導語：如何才能寫好一篇深海微生物的研究進展，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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摘 要：2013年為863課題“深海微生物活性物質的挖掘及其利用技術”實施的第二年。該年度該課題進展順利，完成了預期的研究計劃。取得的研究進展主要分為以下5個方面：（1）在深海沉積環境樣品中分離、純化、保藏869株菌株，確定了729個菌株的系統進化地位，在深海海水樣品中分離了海洋微生物237株，完成了其中168株的細菌測序工作；其中發現一個潛在的新屬級類群。（2）對21株深海微生物進行次生代謝產物的分離和純化，從中分離鑒定代謝產物186個，其中新結構化合物71個；其中1個對稱的環四肽類新骨架化合物；發現具有較好藥用活性的化合物25個；對Staurosporine的衍生物HDZ-115和Xanthocillin X進行深入的藥理藥效研究，確定為下一步成藥性評價的先導化合物。（3）從深海來源微生物中發現對植物病原真菌具有良好抗性的脂肽類活性物質；篩選得到一系列抗污損活性的活性物質，其中1個單體化合物在海洋掛板實驗中較好抗海洋污損生物活性，具有進一步開發價值。（4）完成了1株深海海洋放線菌SCSIO ZH66的全基因組掃描測序，克隆鑒定了Grincamycin，Lobophorin的生物合成基因簇，完成了Grincamycin，marinacarboline，lobophorin的生物合成途徑。（5）從深海微生物中分離純化兩種具有重要經濟價值的新蛋白酶，分離得到到新型高溫α淀粉酶和生淀粉酶基因，成功實現異源表達，并對酶學性質進行了研究。

關鍵詞：深海微生物 活性物質 藥用活性 生態效應 生物合成 新型酶

Abstract： This 2013 annual report of the National High Technology Research and Development Program of China “Discovery and Development of Bioactive Substrates from the Deep-sea Microorganisms” includes the following contents： （1） 869 strains have been purified， separated and preserved from the deep sea sediment and 729 of them have been determined with their phylogenetic position. 237 strains have been purified and separated from deep sea water samples， and 168 of them have been completed with their bacteria sequencing studies； there is a potential new genus level taxa in them； （2） 21 Stains of deep-sea microbes have been investigated for their secondary metabolisms. 186 compounds have been isolated and identified and 71 of them are new compounds， including a novel cyclic tetrapeptide. 25 compounds were found to show significant pharmacological activities. Detained pharmacological studies of HDZ-115 （derivative of staurosporine） and Xanthocillin X show that these two lead compounds are worthy of further drug assessment. （3） Some lipopeptides show antagonistic activities toward the tested plant fungal pathogens. Several active substances are obtained with their antifouling activities， and one of them shows a good application value in the antipollution experiments in sea. （4） The genome of the deep sea actinomycete SCSIO ZH66 has been scanned； gene clusters responsible for grincamycin and lobophorin have been cloned and identified and the pathways of grincamycin， marinacarboline and lobophorin have been deciphered； （5） Two new proteases， with good economic value， were isolated and purified from deep-sea microbes. New high temperature α-amylases and amylase genes were isolated with successful implementation of heterologous expression.

Key Words： Deep-sea microbes； Bioactive substance； Pharmacological activities； Ecological effect； Biosynthesis； New enzyme

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1. 全球載人航天領域形成競爭新格局

載人航天工程是美國最令人驕傲和興奮的科技成果和實力體現，每一年都有值得紀念的周年慶典。不過，值得注意的是，在經歷了40多年的顛峰期后，美國載人航天工程似乎開始滑向低谷，甚至到了借用俄羅斯火箭升空的地步。隨著中國載人航天事業的崛起，美國人重新找到了新的競爭對手。12月底，中國公布了最新的太空活動五年計劃，其中包括空間實驗室計劃以及2020年登月計劃。在全球舞臺上，載人航天與國家地位和榮譽密切相關。2012年，就看誰將在這一領域率先取得重大突破。

2. 火星科學實驗室登陸

今年8月份，火星科學實驗室即將登陸火星，人類通過遙控設備對火星探索的黃金時期仍將繼續。在過去十年中，“火星奧德賽”號、“火星漫游者”號、“火星勘測軌道器”、“鳳凰”號火星車等一系列探測器令火星應接不暇。這一系列的火星任務表明了美國宇航局對太空遙控探索的實力。此前的火星探索任務已經證明火星上曾經存在水的事實并繪制了火星歷史上的化學成分圖。火星科學實驗室探索的重點將是蓋爾隕石坑，該隕石坑中含有粘土和硫酸鹽礦物質，這些似乎表明火星曾經潮濕的過去。樂觀地講，火星科學實驗室希望能夠挖掘出一些有機分子。本圖所示為2011年11月26日美國宇航局火星科學實驗室發射時場景。

3. 探測南極冰下湖泊

在過去數年間，許多國際科考隊曾經致力于鉆探南極數千米冰層下的遠古湖泊。一支由科學家和工程師組成的俄羅斯科考隊在經歷了20多年的鉆探，最終鉆透冰層抵達沃斯托克湖的水面。同時，其他科考隊也在其他湖泊上方努力著，如英國和美國正在分別致力于鉆透伊爾斯沃斯湖和維蘭斯湖。本圖所示為南極沃斯托克湖的位置。

4. 全新深海潛艇下潛6 500米

“阿爾文”號深海潛艇剖面圖。自1964年起，許多重大深海科學發現都是由“阿爾文”號深海潛艇取得的。“阿爾文”號深海潛艇好像是一個可愛的鈦球體，可以將科學家們帶到海面以下數英里深的海底實施科考。“阿爾文”號曾經在北大西洋中發現“泰坦尼克”號，在加拉帕戈斯附近發現海底熱液出口。不過，在經歷了40多年深海探索后，“阿爾文”號早該升級了。在過去14個月中，“阿爾文”號上的工程師和駕駛員們正在美國馬薩諸塞州一家工廠內著力打造升級版的“阿爾文”號。屆時，新“阿爾文”號將擁有全新的浮力泡沫和鈦球體、更高級的相機系統以及更多的房間和更大的窗戶。經過第二輪升級后，新“阿爾文”號將可以潛入到水面之下6 500米深的海底。

5. 研制合成生命

2010年，科學家克雷格-溫特等人宣稱，他們已經制造出首個“合成細菌細胞”。經過深入論證，人們發現這種合成細胞距離形成生命所必須的基本需求還差得很遠。從無到有地制造一個活細胞，這是一項巨大的挑戰。從原始湯到能夠活動的微生物需要太多的步驟，但全球太多的研究團隊仍在努力克服一道道障礙。1月份，美國加利福尼亞大學圣地亞哥分校和哈佛大學聯合研究團隊發現，簡單的非生命反應能夠產生膜狀容器，這是在生命持續反應與外部雜亂秩序之間建立阻隔的先決條件。無論如何，2012年將繼續看到這一領域的研究進展。本圖所示為溫特研制的合成生命。

6. 探索系外行星

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關鍵詞：溫泉；嗜熱細菌；熱穩定纖維素酶；分離；鑒定

中圖分類號：q939.9；q93-331 文獻標識碼：a 文章編號：0439-8114（2014）07-1516-04

isolation and identification of thermophiles degrading cellulose in hot spring

mei fan1a，1b，lin bai-xue1a，zhao chao1a，1b，liu bin1a，1b，2

（1a.college of food science；1b.institute of bioenergy， fujian agriculture and forestry university， fuzhou 350002， china；

2.china national engineering research center of juncao technology， fuzhou 350002， china）

abstract： culture-based approach was used to isolate thermophiles from hot spring. in total， 27 thermophilic bacterial strains were isolated from hot springs in nevada of usa and yongtai hot spring in fujian province of china. superior cellulose and hemicellulose decomposing strains were screened and identified by 16s rdna. the results showed that ly7 and ly8 degrading cellulose were indentified as alicyclobacillus sp. ly7 and geobacillus sp. ly8. geobacillus sp. ly8 could be cultured at temperature ranging from 40 ℃ to 70 ℃， with the optimal temperature of 65 ℃. the β-glucosidase activity of ly8 was 145 iu/ml.

key words： hot spring； thermophiles； thermostable cellulase； separation； identification

纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱。根據酶的功能差異分為三類：①內切葡聚糖酶（ec 3.2.1.4）；②外切葡聚糖酶（ec 3.2.1.91）；③β-葡萄糖苷酶（ec 3.2.1.21）[1，2]。纖維素酶降解纖維素是酶系各組分之間協同作用的結果。首先由內切葡聚糖酶在纖維素分子內部非結晶區進行隨機的酶切產生小分子的纖維素，然后由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位從纖維素線性末端進行水解，每次切下一個纖維二糖分子，最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖以及短鏈纖維寡糖水解成葡萄糖[3-5]。

嗜熱菌是一類能在45 ℃以上生長和繁殖的極端環境微生物，包括部分細菌、古菌和真菌三大類，通常分布在地熱環境和人工高溫環境中，如溫泉、地熱區土壤、深海火山口、深海熱液區以及高溫堆肥、熱水器等環境[6]。嗜熱菌產生的熱穩定酶具有耐熱性、高效性以及對有機溶劑、去污劑和變性劑的較強抗性，在食品、醫藥、生物質能源、生物工程及廢物處理等方面都得到廣泛的應用[7]。其中，熱穩定的纖維素酶在纖維素的轉化中有著重要的應用價值。研究表明，許多高溫菌具有分解纖維素的能力，如芽孢桿菌屬（bacillus）、梭狀芽孢桿菌屬（clostridium）、脫硫腸狀菌屬（desulfotomaculum）、熱酸桿菌屬的解纖維素熱酸桿菌（acidothermus cellulolyticus）、喜熱菌屬（caloramator）的厭氧和分解纖維素高溫菌na10菌株[8]。由于高溫有利于纖維素的降解，而高活力熱穩定的纖維素酶更是纖維素酶研究的重要內容。因此，研究采用純培養的方法從溫泉樣品中篩選出能降解纖維素的耐熱性菌株并進行了16s rdna鑒定，為在常溫條件下獲得有價值的熱穩定性強的酶奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

溫泉樣品：大盆地溫泉和大沸泉，溫度42.5～97.0 ℃，取自美國內達華州；42～70 ℃溫泉樣品，取自福建福州永泰。菌株escherichia coli dh5α為福建農林大學食品科學學院實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗜熱細菌的分離 將泥樣和水樣混合均勻后，以500 r/min離心2 min，去除大顆粒的雜質，然后以10 000 r/min離心10 min，獲得菌體沉淀。水樣可以直接利用。處理后的樣品分別置于4 ℃冰箱和-70 ℃超低溫冰箱。取處理好的樣品加適量無菌生理鹽水稀釋，取1

00 μl涂布于zobell 2216e或者tim改良后的tm固體培養基上，置于不同溫度的電熱恒溫鼓風干燥箱中培養。挑取單個菌落進行劃線分離，反復分離至單一菌落。 　1.2.2 嗜熱菌全菌蛋白分析 將提取純化得到的嗜熱菌全菌蛋白進行sds-page凝膠電泳，挑選具有不同電泳帶型的嗜熱菌菌株進行復篩。

1.2.3 降解纖維素嗜熱菌的篩選 將純化得到的嗜熱菌分別點種于纖維素篩選平板上，置于合適的溫度下培養1～2 d。用0.1%剛果紅染色0.5 h，再用1 mol/l nacl溶液脫色0.5 h，挑選有透明圈的菌落，測量透明圈直徑，進行初篩。復篩采用液體發酵培養基，于120 r/min下培養36 h，測定發酵液酶活[9，10]。

1.2.4 16s rdna基因序列的pcr擴增和鑒定 用細菌基因組提取試劑盒提取嗜熱菌基因組dna，再進行pcr擴增，將回收后的16s rdna片段與pmd18-t vector 在16 ℃連接過夜，再轉化至e. coli dh5α中。將提取得到的質粒經hind ⅲ限制性內切酶和bamh i限制性內切酶在37 ℃反應3～4 h，取適量酶切產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，分析插入片段的大小，確定克隆是否成功[11]。

1.2.5 序列比對和系統發育分析 陽性克隆的測序由北京天根生物科技公司完成。核酸序列相似性分析采用美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information， ncbi）提供的比對搜索工具blast（basic local alignment search tool， blast）進行搜索（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。用clustal x（1.83）進行序列比對，采用mega構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 嗜熱菌的分離純化和菌株分型

每個樣品經過處理后，涂布于嗜熱菌分離培養基zobell 2216e或者tim改良后的tm固體培養基上，分別在53 、60 、65 、70 、85 ℃下進行培養。經過多次劃線分離純化得到27株嗜熱菌菌株。

部分嗜熱菌的菌落形態如表1所示。已純化的嗜熱細菌菌株采用甘油法保存于-70 ℃冰箱。

采用嗜熱菌全菌蛋白的sds-page凝膠電泳（圖1）對27株嗜熱菌進行初步篩選。挑選具有不同電泳帶型的嗜熱菌菌株進行下一步的研究。

2.2 降解纖維素嗜熱菌的篩選與鑒定

2.2.1 產纖維素酶嗜熱菌的篩選 采用剛果紅染色法從永泰溫泉篩選到兩株具有較強纖維素降解能力的菌株ly8和ly7，對這兩株菌株的形態進行觀察，并進行鑒定。

2.2.2 產纖維素酶嗜熱菌的形態特征 兩株菌株都是桿狀、有芽孢的革蘭氏陽性菌，菌落均是白色。ly7沒有鞭毛，ly8有鞭毛（表2）。

2.2.3 降解纖維素嗜熱菌的酶活活性 纖維素酶根據酶的功能的差異可分為三類：內切葡聚糖酶（eg），外切葡聚糖酶（cbh），β-葡萄糖苷酶（bgl）。如圖2所示，ly8內切葡聚糖酶活性高達145 iu/ml。

2.3 降解纖維素嗜熱菌的鑒定

2.3.1 產纖維素酶嗜熱菌的16s rdna鑒定 將ly7和ly8接種液體培養基，65 ℃培養36 h后離心收集菌體，用細菌基因組提取試劑盒提取這兩株嗜熱菌的基因組dna。用細菌通用引物euba27f和euba1492r進行16s rdna 的擴增，擴增產物大小約1 500 bp，結果見圖3。

將純化回收的16s rdna pcr產物與pmd 18-t 載體連接，轉化e. coli dh5α，雙酶切驗證后（圖4）送北京天根生物科技公司測序。

2.3.2 序列比對與系統發育分析 ly7和ly8的16s rdna測序結果表明，菌株ly7的16s rdna為1 531 bp，菌株ly8的16s rdna為1 552 bp。用blast在ncbi中搜索同源序列進行比較分析，結果（圖5）顯示，菌株ly7屬于脂環酸芽孢桿菌屬（alicyclobacillus），菌株ly8屬于土芽孢桿菌屬（geobacillus），生長溫度為40～70 ℃，最適溫度65 ℃。

3 小結與討論

本研究以纖維素為底物，從美國內達華州溫泉和中國福建永泰溫泉分離得到兩株產纖維素酶的嗜熱細菌菌株ly7和ly8，它們的最適反應溫度為65 ℃，而目前文獻中報道的纖維素降解菌株最適溫度為30 ℃左右，因此本研究篩選的菌株可在很多工業和生物技術領域得到廣泛應用。嗜熱細菌ly8的酶活最高，其內切葡聚糖酶活性最高達145 iu/ml，與文獻報道的產內切葡聚糖酶活性較高的幾株菌株（綠色木霉c-08最高酶活為89 iu/ml[12]、里氏木霉40359最高酶活100 iu/ml[13]）相比，可知嗜熱細菌ly8內切酶活性最高。雖然目前工業上纖維素酶產生菌trichoderma reesei工程菌mcg80發酵酶活為300～500 iu/ml[14]，但嗜熱細菌ly8

為一株野生菌株，酶活能夠達到這個水平，說明很有應用前景，如果再通過誘變育種很可能成為一個生產菌株，而且其可在高溫范圍降解纖維素，有著常溫細菌不可比擬的優勢。通過16s rdna序列鑒定，ly8屬于土芽孢桿菌屬（geobacillus），ly7屬于脂環酸芽孢桿菌屬（alicyclobacillus）。由于真菌降解纖維物質主要是通過分泌大量的胞外酶來進行的，因此纖維素降解真菌在纖維素酶的開發和應用上具有細菌、放線菌等所不具有的優勢。然而，本研究的細菌體內存在著獨特的耐高溫代謝途徑和耐高溫酶，如果通過分子生物學方法克隆這些耐高溫酶的基因，并使其在畢赤酵母等真菌宿主中進行表達，就可以在常溫條件下獲得有價值的熱穩定性強的酶，因此具有極高的研究和應用價值。

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