導語：如何才能寫好一篇打印合同，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

乙方（承租方）

雙方于____年__月__日，就出租打印機設備一事，經雙方協商簽訂合同如下：

一、甲方將_____打印機___臺出租給乙方使用，租期為____年（從___年 ___月___日至___年___月___日止）甲方收取乙方打印機押金____元，合同期滿后將其押金無息退還給乙方。

二、在租賃期間甲方免費負責打印機的維修和保養，所需零配件及耗材都由甲方負責，打印紙張由乙方自行負責。

三、收費標準：每月最低基本租金為人民幣____元，即可免費打印___張，超出部份每張按____元計算。

四、每月__日為抄表結算日，抄表結算后__日內付款，若乙方不按時付款，甲方有權收機器，并從押金中扣除應收租金及第九條所述違約金后，退回余款。

五、在租賃期間打印機出現故障，甲方應在接到乙方通知后工作時間3小時內到達現場進行維修，乙方不可以召喚甲方之外的其它單位維修。未經文秘站:甲方同意乙方不準私自移機及拆動，乙方在使用過程中因使用或保管不當致使打印機的損壞由乙方承擔責任。

六、在租賃期間如果乙方遺失打印機，乙方必須賠償人民幣___元整（￥___）給甲方。

七、在租賃期間如甲、乙雙方任何一方要求終止合同，要求方必須提前一個月以書面方式通知另一方，并且要求方無條件賠償500元給對方。

八、在合同期滿后，乙方應將打印機及附件退還給甲方。合同到期后壹個月內，甲、乙雙方未提出解約，則視為雙方自動延長此合同相同租期，雙方不用再簽任何合同，本合同具有同等租期和同等法律效力。

九、本合同一式兩份，甲、乙雙方各執一份，經甲、乙雙方代表簽字、蓋章且打印機到位后立即生效。本合同生效后，若雙方任何一方有違約行為，應由違約方賠償人民幣伍佰元（￥500.00）給對方。

十、本臺打印機起始計數器讀為：_______.

十一、本合同未盡事宜，經雙方協商一致，可簽訂補充條款，補充部分作為合同的附件，與本合同具有同等法律效力。

甲方：

乙方：

代表：

代表：

日期：

日期：

地址：

地址：

電話：

篇2

租房協議合同范本一甲方(出租方)

乙方(承租方)

甲、乙雙方就租用甲方房屋一事：經甲、乙雙方友好協商，達成以下協議：

一、甲方將其歸屬所有權的，面積平方米，租給乙方使用。

二、乙方的租期從起至日止。為期年。

三、租金現金支付，每月租金，乙方一次性支付一年租金元。

四、甲方須向乙方出示房屋的正本房產證和有關證明。

五、乙方需承擔租用期間住房的一切管理費用，其中包括小區管理費，電視收視費，水、電、煤氣費和電話費等。

六、乙方在租房期間必須愛護好房屋設施，如有損壞，乙方負責賠償或修理完善，若乙方需裝修或改變房屋結構，需經甲方同意。合約期滿按米修去丟原則辦理

七、乙方在租房期內，不得將租房作違法經營場所。一經發現，除按法律制裁外，甲方有權收回房屋，所剩租金不退。

八、乙方在租房期間未經甲方同意不得將房屋轉租他人，如未經甲方同意轉租，此協議無效，安全責任由乙方自負。

九、如租期滿，乙方需繼續租用，須提前一個月與甲方交涉說明，并提前交清下年租金，如乙方不再續租交清租房期間的所有費用，退還甲方鑰匙并結清相關手續給甲方或中介方;如不按此辦理責任由乙方承擔，甲方和中介方有權在租房期滿五天后打開房屋另行出租或使用。

本協議一式兩份，經雙方代表簽字后生效，具有法律效力，雙方必須共同遵守。

甲方(租賃人) 身份證號： 聯系電話：

乙方(承租人) 身份證號： 聯系電話：

簽約時間：年 月 日

租房協議合同范本二出租方： (以下簡稱甲方)________________________

承租方： (以下簡稱乙方)________________________

甲乙雙方經友好協商，乙方為在開發區設立 公司而租用甲方房屋，并就此租宜達成如下協議：

一、甲方同意供給乙方經營用房 平方米，用于該公司經營之用，該房屋坐落于

二、該房屋租金經雙方商定為每月 元。該房屋總租金為 元。

三、租金于 交付，每延遲一天按總租金的 計罰。若 天內仍未交納，甲方有權收回該房屋，并按實際遲付天數依上述計罰比例向乙方收取罰金。

四、乙方同意預交 元作為金，時，當作房租沖抵。

五、租賃期限為 ，從 年 月 日至 年 月 日。在此期間，任何一方要求終止合同，須提前三個月通知對方，并償付對方總租金 的;如果甲方轉讓該房屋，乙方有優先購買權。

六、因租用該房屋所發生的除土地費、大修費以外的其它費用，由乙方承擔。

七、在承租期間，未經甲方同意，乙方無權轉租或轉借該房屋;不得改變房屋結構及其用途，由于乙方人為原因造成該房屋及其配套設施損壞的，由乙方承擔賠償責任。

八、甲方保證該房屋無糾紛;乙方因經營需要，要求甲方提供證明或其它有關證明材料的，甲方應予以協助。

九、就本合同發生糾紛，雙方協商解決，協商不成，任何一方均有權向開發區人民法院提起訴訟，請求司法解決。

十、本合同未盡事宜，可由雙方協商簽訂補充協議，經公證后與本合同具有同等法律效力。

十一、本合同以雙方共同認可并經公證后生效。

甲方(簽章)：________________________ 乙方(簽章)：_______________________

篇3

關鍵詞：自動化 打印 合同管理

中圖分類號：TP311 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）02（a）-0108-02

目前物資合同統簽統付在全國已經鋪展，物資合同簽訂總量逐年遞增[1]。隨著2015年5月物資子系統的上線，優化著力方向在于電子合同的制定效率，而占據簽約工作較大部分的書面簽約部分仍然依靠大量的手工操作，經多重界面跳轉打開打印，效率低下，無法與逐步優化的系統同步配套，仍然影響整體工作效率。為了進一步提升整體的工作效率，在物資合同統簽統付典型模式的大背景下，借助系統智能化、流程規范化調整的契機，提升電子合同簽訂的規范性與智能化。

1 項目管理系統簡介

項目管理系統是一款基于Html、CSS、Java等語言開發的C/S模式的合同在線管理系統。它包括了合同管理、功能設置、字典管理3大功能模塊。其中合同審核包括初始化、合同上傳、查詢、導出合同、合同審核、合同分類、批量打印、合同刪除等功能；功能設置主要包括打印機設置、修改密碼、用戶注冊等功能；字典管理模塊包括全局數據設置、客戶管理、客戶數據導入、用戶管理等功能。

2 合同導入模板設計

合同管理模塊中的合同導入是以SQL標準模板為基準的。該SQL模板具有的標題列有唯一ID、付款方編號、付款方名稱、收款方名稱、合同日期、更改日期、合同內容、備注、行業代碼、合同代碼、合同號碼等。具體設計代碼如下。

DROP TABLE IF EXISTS `tpt_contact_tabel`；

CREATE TABLE `tpt_contact_tabel` （

`tpt_id` int（32） NOT NULL，

`tpt_payer_code` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_payee_name` varchar（32） NOT NULL，

`tpt_contact_cretime` datetime NOT NULL，

`tpt_contact_upttime` datetime NOT NULL，

`tpt_contact_content` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_remark` varchar（255） DEFAULT NULL，

`tpt_industry_code` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_contact_code` varchar（255） NOT NULL，

…………

PRIMARY KEY （`tpt_id`，`tpt_contact_code`）

）；

按照這個模板設置的SQL數據表，通過合同管理的合同導入功能，在合同上傳后，可將合同信息導入到系統數據庫中。

3 總體設計策略

3.1 合同管理數據庫具體設計

對于合同管理系統中的合同管理對應一張合同數據表（contact_table），合同管理數據表主要由以下字段組成：唯一ID、合同名稱（name）、合同代碼（code）、存儲路徑（path）、是否打印（hasprt）等。具體主要設計代碼如下。

DROP TABLE IF EXISTS ` contact _table`；

CREATE TABLE ` contact _table` （

`id` int（32） NOT NULL，

`name` varchar（255） NOT NULL，

`code` varchar（255） NOT NULL，

`store_path` varchar（255） NOT NULL，

`hasprt` int（1） NOT NULL DEFAULT '0'，

PRIMARY KEY （`id`）

……

）；

這里的hasprt表示合同是否打印，如果一條記錄被選中后打印，該屬性值將被設置為1，有效避免了重復打印。通過合同導入模板外鍵（合同編號）使得合同管理表與模板表相關聯。

3.2 自踴打印關鍵技術說明

要保證文件能夠自動化打印，首先要通過初始化設置，對打印設備進行智能化設置。打印機自動化打印設置步驟如下。

（1）建立打印服務器，并在打印服務器上設置2個共享驅動，驅動1配置為縱向輸出，驅動2配置為橫向輸出。

（2）在項目合同系統上開發打印功能，使得系統可以直接調用打印設備。

（3）用戶在選擇合同打印時，由打印服務器對打印任務進行負載均衡，產生2個打印隊列，分別用驅動1和2進行調用打印設備。

篇4

出租方：(以下簡稱甲方)

承租方：(以下簡稱乙方)

甲、乙雙方就房屋租賃事宜，達成如下協議：

一、甲方將位于______市______街道______小區______號樓______號的房屋出租給乙方居住使用，租賃期限自______年______月______日至______年______月______日，計______個月。

二、本房屋月租金為人民幣______元，按月/季度/年結算。每月月初/每季季初/每年年初______日內，乙方向甲方支付全月/季/年租金。

三、乙方租賃期間，水費、電費、取暖費、燃氣費、電話費、物業費以及其它由乙方居住而產生的費用由乙方負擔。租賃結束時，乙方須交清欠費。

四、乙方同意預交______元作為保證金，合同終止時，當作房租沖抵。

五、房屋租賃期從______年______月______日至______年______月______日。在此期間，任何一方要求終止合同，須提前三個月通知對方，并償付對方總租金______%的違約金;如果甲方轉讓該房屋，乙方有優先購買權。

六、因租用該房屋所發生的除土地費、大修費以外的其它費用，由乙方承擔。

七、在承租期間，未經甲方同意，乙方無權轉租或轉借該房屋;不得改變房屋結構及其用途，由于乙方人為原因造成該房屋及其配套設施損壞的，由乙方承擔賠償責任。

八、甲方保證該房屋無產權糾紛;乙方因經營需要，要求甲方提供房屋產權證明或其它有關證明材料的，甲方應予以協助。

九、就本合同發生糾紛，雙方協商解決，協商不成，任何一方均有權向天津開發區人民法院提起訴訟，請求司法解決。

十、本合同連一式___份，甲、乙雙方各執___份，自雙方簽字之日起生效。

甲方：

乙方：

______年______月______日

正規的個人租房合同范本(二)

甲方：_________

乙方：_________

乙方承租甲方管理的上列房屋作為_________使用，雙方議定遵守事項如下：

房屋座落：_________區_________樓_________單元_________號 房屋使用面積：_________平方米

一、本租約為乙方取得承租房屋使用權的憑證。甲、乙雙方均有遵守國家有關住宅法律和本市房屋政策、法令的義務。

二、房屋租金數額因房屋條件或租金標準變動時，其租額得予調整，每月租金，乙方應于_________日前交清。

三、乙方有下列情況之一時，甲方可以終止租約，收回房屋：

(1)把承租的房屋轉讓，轉借或私自交換使用的;

(2)未經甲方同意私自改變承租用途的;

(3)無故拖欠租金三個月以上的。

四、甲方根據修繕標準檢查，維修房屋和設備，保障安全、正常使用。甲方維修房屋時，乙方應積極協助，不得阻礙施工。在正常情況下，如因檢查不周，維修不及時，以致房屋倒塌，使乙方遭受經濟損失時，由甲方負責賠償。

五、甲方鑒定房屋危險，不能繼續使用，必須騰出時，乙方應按期遷出，其居住房由甲方解決。如乙方籍故拖延不遷造成的一切損失，由乙方負責。

六、甲方對乙方承租的房屋進行翻建大修后，乙方有優先承租權，但事先應簽訂協議。

七、乙方對承租的房屋及室內裝修設備，應負責保管，愛護使用，注意防火、防凍。如有損壞，乙方應負責修復或賠償。樓梯間、門道、走廊等公用房屋和設施，乙方應愛護使用，注意照管，防止損壞。

八、乙方不得私自拆改、增添房屋或設備。如屬必需時，應事先取得甲方同意或另行簽訂協議后方可動工。否則，乙方應負責恢復原狀。

九、乙方退租房屋時，應于七日前通知甲方，并辦清以下手續：

(1)交清租金和應交納的賠償費。

(2)按照租約負責保管的房屋及裝修設備。

(3)撤銷租約。

十、乙方承租甲方代管、托管的房屋在發還原主時，甲方得終止租約。

十一、乙方承租的房屋因國家建設，特殊需要必須騰讓時，甲方得終止租約。乙方所需房屋按有關規定辦理。

十二、本租約自立約日起至_________年_________月_________日止有效。一或_________份，甲乙雙方各執_________份，如有未盡事宜，雙方協議解決。

十三、其他_________.

甲方(蓋章)_________ 乙方(蓋章)_________

代表人(簽字)_________ 代表人(簽字)________

__________年____月____日 _________年____月____日

正規的個人租房合同范本(三)

出租方：______________，以下簡稱甲方。

承租方：______________，以下簡稱乙方。

根據《中華人民共和國合同法》及有關規定，為明確甲、乙雙方的權利義務關系，經雙方協商一致，簽訂本合同。

第一條 甲方將自有的坐落在____市____街____巷___號______(小區)___棟___單元___樓___號的房屋___間(套)，建筑面積___平方米、使用面積___平方米，類型___出租給乙方作___使用。裝修及設備情況：______________________________.

第二條 租賃期限

租賃期共___個月，甲方從___年___月___日起將出租房屋交付乙方使用，至___年___月___日收回。

乙方有下列情形之一的，甲方可以終止合同，收回房屋：

1.擅自將房屋轉租、分租、轉讓、轉借、聯營、入股或與他人調劑交換的;

2.利用承租房屋進行非法活動，損害公共利益的;

3.拖欠租金__個月或空置__月的。

合同期滿后，如甲方仍繼續出租房屋的，乙方擁有優先承租權。

租賃合同因期滿而終止時，如乙方確實無法找到房屋，可與甲方協商酌情延長租賃期限。

第三條 租金、交納期限和交納方式

甲乙雙方議定月租金___元，交納方式為____支付，計人們幣(大寫)____________元(元)由乙方在___年___月___日交納給甲方。先付后用。以后每個___月付款一次，應在付款期末前___天支付。

第四條 租賃期間的房屋修繕

甲方對出租房屋及其設備應定期檢查，及時修繕，做到不漏、不淹、三通(戶內上水、下水、照明電)和門窗好，以保障乙方安全正常使用。乙方應當積極配合。

第五條 租賃雙方的變更

1.如甲方按法定手續程序將房產所有權轉移給第三方時，在無約定的情況下，本合同對新的房產所有者繼續有效;

2.乙方需要與第三人互換用房時，應事先征得甲方同意，甲方應當支持乙方的合理要求。

第六條 乙方必須遵守當地暫住區域內的各項規章制度。按時交納水、電氣、收視、電話、衛生及物管等費用。乙方的民事糾紛均自行負責。水、電、氣底數各是：水____噸，電____度，氣____方。

第七條 甲方收乙方押金____元，乙方退房時，結清水、電、氣費，交還鑰匙后，由甲方退還乙方押金____元。

第八條 違約責任

1.甲方未按本合同第一、二條的約定向乙方交付符合要求的房屋，負責賠償___元。

2.租賃雙方如有一方未履行第四條約定的有關條款的，違約方負責賠償對方___元。

3.乙方逾期交付租金，除仍應補交欠租外，并按租金的___%，以天數計算向甲方交付違約金。

4.乙方擅自將承租房屋轉給他人使用，甲方有權責令停止轉讓行為，終止租賃合同。同時按約定租金的___%，以天數計算由乙方向甲方支付違約金。

5.本合同期滿時，乙方未經甲方同意，繼續使用承租房屋，按約定租金的___%，以天數計算向甲方支付違約金后，甲方仍有終止合同的申訴權。

第九條 免責條款

1.房屋如因不可抗拒的原因導致損毀或造成乙方損失的，甲乙雙方互不承擔責任。

2.因市政建設需要拆除或改造已租賃的房屋，使甲乙雙方造成損失，互不承擔責任。

因上述原因而終止合同的，租金按實際使用時間計算，多退少補。

第十條 爭議解決的方式

本合同在履行中如發生爭議，雙方應協商解決;協商不成時，任何一方均可向房屋租賃管理機關申請調解，調解無效時，可向經濟合同仲裁委員會申請仲裁，也可向人民法院起訴。

第十一條 其他約定事宜

1.___________________________________________________________________________.

2.___________________________________________________________________________.

第十二條 本合同未盡事宜，甲乙雙方可共同協商。

本合同一式2份，甲乙方各執1份。從簽字之日起生效，到期自動作廢。

甲方(簽字蓋章) 乙方(簽字蓋章)

身份證號碼： ___________________ 身份證號碼：___________________

聯系電話：___________________ 聯系電話：___________________

篇5

關鍵詞：方言；語音；異同

中圖分類號：G633.41文獻標識碼：A文章編號：1006-026X（2013）11-0000-02

漢語方言俗稱地方話，只通行于一定的地域，他不是獨立于民族語之外的另一種語言，而只是局部地區使用的語言。不同的地域有著自己獨特的語音特點，但在相互區別的同時還可能存在一定的關聯性。大孤山和莊河方言語音就存在著這樣的特點。我們將對它們之間在聲母、韻母、聲韻配合三個方面的異同進行歸納和區別。

一、聲母方面的變化特點

（一）t、th、的發音的變化特點

在大孤山和莊河方言中，沒有t、th、這三個舌尖后音，普通話這三個聲母在大孤山和莊河方言中一部分讀為舌面前音、h、，例如：吃[th55]讀作[thi213]、[thi213]；另一部分讀為舌尖前音[]、[h]、[s]，例如：插[thA55]讀[tshA213]、[tshA213]。

但是其中有一部分字在這兩個地域的讀音的改變是有區別的。例如：這[t51]讀[e42]、[i42]。

（二）r的發音的變化特點

大孤山和莊河方言中沒有普通話r聲母，普通話的r聲母在大孤山和莊河方言中對應三種發音，在聲母r的發音上變化上大孤山和莊河方言沒有差別。第一種讀成齊齒呼i。例如：日[51]讀[i42]。第二種讀成撮口呼y。如：入團[u51]讀[y312]。第三種讀l，如：扔[55]在大孤山方言中讀[l312]或讀[x312]，而在莊河方言中只讀[x312]。

（三）普通話中送氣與不送氣的聲母，在部分大孤山發音中正好與之相反，在莊河方言也存在這種現象，但是發生變化的讀音沒有大孤山方言的比例大。

1.p與ph，例如：扒拉[phA35]讀作[pA312]、[phA312]。大孤山方言送氣，莊河方言不送氣。

2.t與th，例如：糊涂[thu]讀作[tu]、[thu]，大孤山方言送氣，莊河方言不送氣。但堤壩[ti55]讀[thi42]、[thi42]，這個字大孤山和莊河方言都變為送氣音。

3.t與th，例如：券兒[thyer51]讀[tyer42]、[thyer42]，這個字大孤山方言不送氣，莊河方言和普通話送氣。但畸[ti55]讀[thi42]、[thi42]，鬮[tiou55]讀[thiu312]、[tchiu312]，此二字大孤山和莊河方言都變為送氣音。

4.k與kh，在大孤山和莊河方言中，不送氣的聲母g在一部分字中讀成送氣的聲母k，這一變化兩個地域相同。例如：給[kei214]讀[khe213]、[khe213]。

5.ts、t與tsh、th，在部分字的讀音中互換，在大孤山和莊河方言變化中有異有同。例如，糙[tshu55]讀[312]、[h312]，兩地讀音不同。撞[tu51]讀[tshu42]、[tshu42]，兩地讀音相同。

4.普通話中聲母n的讀音，在大孤山和莊河方言中有一部分n的發音會出現發音部位的改變。并且二者在發音的改變上相同

（1）n變l。例如：能[n35]讀[l42]、[l42]。

（2）n變m。例如：泥[ni35]讀[mi312]、[mi312]。

（3）n變零聲母。例如：虐[ny51]讀[y42]、[y42]。

（4）后接i的n都變為舌面前音。例如：你[ni214]讀[i213]，[i213]。

二、韻母方面的變化特點

1.與普通話相比，大孤山和莊河方言在韻母數量上都少4個韻母。缺少的韻母是、o、ai、u。

（1）大孤山和莊河方言都沒有翹舌音聲母t、th、、，所以能與這些聲母拼合的也就自然缺失，變成與、h、s拼合的。但與普通話的的發音有區別，舌尖不是抵在上齒背而是抵在下齒背，致使的音值接近濁擦音z，只是摩擦程度小一些。例如：志[t51]讀[42]、[42]。

（2）在大孤山和莊河方言中沒有o音，與普通話中只跟p、ph、m、f4個聲母相拼的o，在大孤山和莊河方言中都發一樣的（音。這一變化在聲韻配合部分會具體分析。

（3）普通話中復元音韻母ai，在大孤山和莊河方言中大部分變成一種讀音，個別變成（。并且兩地域有同有異。相同的讀音變化，例如：呆[tai55]讀[t312]、[t312]。不同的讀音變化，例如：麥[mai51]讀[m42]、[m213]。

（4）在大孤山方言和方言中沒有u韻母，都變為u。例如：嗡[u55]讀[u312]、[u312]。

2.普通話u韻母，在大孤山和莊河方言大部分變為。例如：襖[u214]讀[213]、[213]。但其中有兩個p與u拼合的字，u變為A。剝皮[pu55]讀[pA213]、[pA213]，。還有三個不成規律的讀音變化，家雀兒[thiu214]讀[thy213]、[thy213]、，藥[iu51]讀[y213]、[y42]，鑰[iu51]讀[y213]、[y42]。

3.普通話ei韻母，在大孤山和莊河方言中大部分變為e。例如：杯[pei55]讀[pe312]、[pe312]。但大孤山方言與莊河方言不同的是，當u與ei拼合時，在大孤山和莊河方言中ei 也變為e。例如：退[thuei214]讀[the213]、[the213]。

4.以鼻音n結尾的韻母，在大孤山和莊河方言中都變為相應的鼻化音韻母。an變為，n變為，in變為i，un變為y。例如：按[an51]讀[42]、[42]。但與r相拼時不遵循此規律。這在聲母部分已具體分析，此處不作贅述。

5.普通話的uo音，在大孤山和莊河方言中大部分都變為u。例如：多[tuo55]讀[tu312]、[tu312]。但個別字也有特殊變化，例如：脫衣服[thuo55]讀[th213]、[thu213]，這個字在大孤山方言中丟u，與莊河方言不同。

三、聲韻配合方面的變化特點

1、p、ph、m、f四個雙唇音與o相拼。在大孤山和莊河方言中不讀o音，讀（音。例如：脖[po35]讀[p312]、[p42]。

2、、h、s、t、th、n、l在與韻母uei、uan、uen相拼。在大孤山和莊河方言中丟介音u，剩下的韻母變為[e]、[]、[]。例如：亂[luan51]讀[l42]、[l42]。

3、在大孤山和莊河方言中聲母l不與i相拼，全變讀[le]音。例如：麗[li51]讀[le42]、[le42]。

4、n與u相拼的音，大孤山方言變為n與相拼，莊河方言變為n與u相拼。例如：農[nu35]讀[n42]、[nu42]。但是“弄[nu51]”比較特殊，在大孤山方言中有兩個發音[n42]、[nu42]，在莊河方言只有一個發音[nu42]。

5、k、kh與（相拼的音，在大孤山和莊河方言有一小部分變為k與A相拼。例如：疙瘩[k55]讀[kA312]、[kA312]。

6、m與u相拼的音，在大孤山和莊河方言中丟u。例如：木[mu51]讀[m42]、[m213]。

7、t、th、與u相拼，在大孤山和莊河方言中有一部分u音變為y音。例如：住[tu51]讀[y42]、[y42]；在大孤山方言中ts與u相拼，有一部分u音變為y音，并且ts變為，但莊河方言中則沒有這樣的變化。例如：租[tsu55]讀[y312]、[tsu312]。

在聲韻拼合方面的變化除了上述的規律和特點外，還有不成規律性的個別聲韻拼合發生音變，并且部分讀音，在大孤山和莊河方言的各自發生不同音變（用粗體標明）。如下表：

漢字普通話大孤山方言莊河方言

北Pei214p213p213

車th55h312hi312

斥th51h42hi42

齒th214i213h213

兒r35r312r312

喝x55x213xA213

黑xei55x213x213

津貼in55yn312yn312

腳iu214y213i213

嚼碎iu214y42i213

酵母iu51i42i42

顆、棵kh55kh312khu312

烙lu51lu213lu213

沒mei35me42m42

麥mai51m42m213

滅mi51mi42i42

努nu214nu213nu213

弄nu51n42、nu42nu42

怯hi51hy42hy42

扔55x312、l312l312

弱uo51y42y42

誰uei35se312y42

說話uo55y213y213

色s51s213s213

宿舍su51y213y213

塑su51su42su42

脫thuo55th213thu213

我uo214A213u213

尾uei214i213ue213

液體y51i42i42

賊tsei35tse42213

囑咐tu214y213u213

著急tu35ts312tsu42

拙tuo55ty312ty213

以上就是從描述大孤山和莊河方言的異同來分析丹東到大連過渡地域方言語音的變化特點。主要采用了舉例子，并與普通話對比的方法以便于理解。所舉的例子都是筆者在家鄉東港市大孤山鎮生活時使用的常用語與莊河方言進行對比。此中變化特點和區別頗多，可能有疏漏之處，有待進一步的考證和補充。

注釋：

①全文音標示例順序為：普通話、大孤山語音、莊河語音。

參考文獻：

篇6

方式一：通過Airplay功能

所需設備：蘋果iPad(或iPhone、iPod Touch iOS版本4.2.1以上)、支持AirPlay功能的AV功放、音箱

AirPIay，是蘋果開發的一種無線影音傳輸解決方案，有了它，你可以直接從lPad通過無線的方式傳輸音樂。只須將你的任一部揚聲器與AirPort Express相連，或直接將音樂傳輸到如天龍、馬蘭士、B＆W等制造商出品的支持AirPlay功能的AV功放或揚聲器上。iPad會自動檢測到你的多部揚聲器，你只要從中選擇一部就行了。由于一切都可無線進行，因此無論你在家中何處或坐、或站，都可隨意自如地控制音樂播放。

Airplay功能旨在解決個人PC、消費電器、移動設備在內的無線網絡和有線網絡的互聯互通。使得數字媒體和內容服務的無限制的共享和增長成為可能。這也就意味著，以前很多功放必須要各種各樣的線來連接到音源設備。但是配備了Airplay功能的功放只需要連接網線，與無線路由器連接，跟家庭中的其他使用Wi－Fi的設備便可以互通了。這樣一來。功放便不僅僅只是播放CD機或是DVD機中的音頻，它更可以通過遙控器來搜索查詢電腦里的符合其格式的文件來進行播放，用途得到了顯著的提升。想象下傳統的方式中。我們先要選擇自己喜歡的CD，然后把CD從CD盒中拿出來，再放入CD機中，然后才可以聽，而有了DLNA，我們則完全不用去找CD。按照規定的設定，任意選擇NAS(網絡硬盤)中專輯的類型和專輯名稱――是不是方便很多?

2010年11月12日。蘋果公司的iTunes 10.1，全面支持AirPlay無線技術。這樣一來。我們就可以無線享用整個iTunes資料庫，包括每首歌和每個播放列表。舉例來說。假如我們在臥室擺放了一組音響，在書房和客廳還各有一個揚聲器。要實現頂級的恢宏音效，我們可在多個房間同時播放音樂。無論我們在家中的任何位置。都能享受震撼節拍。你只需在iTunes的揚聲器下拉菜單中選中“多個揚聲器”就行了。

AirPlay不僅可使用外部揚聲器同步播放音樂，還能傳輸音樂的相矣信息。無論是歌曲名稱、表演者、專輯名稱，還是已播放時間、剩余時間和專輯封面。都可顯示在支持AirPlav且配有圖形顯示屏的揚聲器上。使用遙控器，或iPhone或iPod touch上的Remote應用程序，我們可以播放音樂或暫停。跳到下一首歌曲，或返回重播前一首，更有隨機播放和重復播放功能。而在在iOS 4.2中，用戶還可以使用該技術從10S設備向APPle TV等其他兼容設備推送視頻和圖片內容。

方式二：手機變身遙控器

所需設備，蘋果iPad(或iPhone、iPod Touch i0S版本4.2.1以上)、支持App Remote功能的AV功放、一臺與AV功放連接的網絡存儲器(NAS)

如果你有一部蘋果iPhone手機(或iPad、iPod Touch)，登錄App Store，即可搜索到包括先鋒、安橋、馬蘭士在內的多家AV功放廠商推出的REMOTE控制App，下載安裝后，即可非常方便地通過上述的蘋果學上設備對處于同一局域網內的AV功放進行控制。

先鋒VSX 1021 K，這是世界上首款能夠支持蘋果的新流媒體平臺AirPlav的AV功放。蘋果掌上設備的用戶可以體驗到直接從功放中收聽到掌上設備中流媒體音樂的過程。同時，AirPIay還能夠支持PC和Mac上iTunes中流媒體文件的傳輸――注意，是無線的傳輸。你再也不需要和雜亂無章的接線打交道。

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近期，浦發銀行在業內率先打通了企業手機銀行和銀企直連服務渠道，為一大批已經使用財務或資金管理系統與銀行對接的銀企直連客戶帶來了移動金融的“福音”。

今后，企業客戶可以通過浦發企業手機銀行進行企業賬戶管理、查詢，并對已通過銀企直連系統提交的業務進行授權和審核，這不僅可以解決管理機制嚴密的大型企業、集團性企業高管經常外出、難以及時通過公司財務或資金管理系統進行緊急付款或業務授權等問題，還可以幫助一些財務管理系統中授權機制不太完善的中小企業增強企業管理。例如公司財務系統中授權層次不夠的企業，通過銀企直連發送交易指令后，可通過增加手機銀行審核的方式來增加授權管理層次，從而既能享受到銀企直連系統所帶來的付款記賬一步處理、來賬自動核銷、電子自動對賬等業務的好處，還能通過手機銀行增加財務管理層次并享受移動辦公的優勢。

在電子銀行服務領域，浦發銀行一直走在同業的前列。該行以客戶為中心，緊跟各種最新IT技術，不斷探索用更好的科技手段和服務方式來充實電子銀行的服務內涵。浦發銀行的銀企直連服務不僅包括傳統的存貸款信息查詢、理財賬戶信息查詢、轉賬支付、工資等基本金融服務功能，還包括集團賬戶管理、人民幣資金池、外幣資金池、銀行理財賬戶管理（活期/定期存款互轉、活期/通知存款互轉等）、電子商業匯票（出票、收票、提示付款、背書轉讓、貼現、質押等）、備付金存管等新型的金融服務功能，全面滿足各類客戶在金融電子化方面的需求。如今，浦發銀行通過打通企業手機銀行和公司網銀、銀企直連等電子渠道的服務功能，為企業客戶帶來更加多樣化、便捷、高效的多渠道金融整合服務體驗，不僅可以幫助企業加強財務管理、降低成本，而且更能增加便利、提高效率，讓企業客戶有更多的時間捕捉市場商機，助力企業客戶的快速發展。

繼去年推出面向企事業單位客戶的企業手機銀行WAP服務和iPhone、Android客戶端服務以來，今年，浦發銀行先后推出了iPad、Symbian（觸摸屏）、Symbian（鍵盤）、WindowsPhone客戶端等服務，成為銀行同業中首家、也是目前惟一能為企事業單位客戶提供全版本企業手機銀行的銀行，讓企事業單位客戶能夠充分體驗移動辦公的便捷和高效。與此同時，浦發銀行注重渠道整合，努力通過網上銀行、直聯銀行、手機銀行、電話銀行、自助銀行五大電子渠道為企業客戶提供最佳的移動金融、多渠道整合的公司電子金融服務。

浦發銀行現金管理部總經理曲麗萍表示，該行將繼續堅持以客戶為中心，秉持“新思維、心服務”的理念，努力為企業客戶打造更加便捷、高效、專業的產品和服務體驗。

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[關鍵詞]商業銀行 統計 數據集中

隨著經濟的發展、金融業務與信息技術的逐漸融合,把以業務自動化處理為主的單―計算機系統改造成為功能強大的集中式計算機應用系統成為金融機構向現代商業銀行改制,控制經營風險,實現管理集約化和經營規模化的必然選擇。目前,四大國有商業銀行均已完成數據大集中工作,光大銀行、民生銀行、深發展銀行、招商銀行及交通銀行等也陸續完成了數據大集中,針對當前國內金融機構進行數據大集中的熱潮,人民銀行作為中央銀行進行數據大集中是必然趨勢和選擇。

人民銀行統計數據大集中是指在網絡技術的基礎上,由總行設置金融統計數據服務器,建立一個全國統一的金融統計數據庫,采集和處理所有金融機構上報的金融統計數據,生成和查詢各銀行業金融機構縣及縣以上各層次金融統計報表和數據,并實現金融統計數據的統一管理統一維護和共享。 在現行模式下,中央銀行對金融統計數據是以“兩條線”的方式進行匯總的,一條線是基層金融機構向同級中央銀行報送,再從央行系統逐級向上匯總;另一條線是基層金融機構逐級向上級行匯總,最后再由上級行匯總到中央銀行。央行實行統計數據集中后,報送方式將出現根本改變,銀行業金融機構與人民銀行總行建立安全網絡通道的,可以通過網絡登陸人民銀行數據采集服務器進行數據上報;沒有建立安全網絡通道的,則將數據傳送給人民銀行當地分支機構,由人民銀行當地分支機構通過內聯網傳送到人民銀行總行數據庫。在這種形勢下,商業銀行需要從以下幾個方面做好準備工作,以迎接央行統計數據大集中。

1、技術上要保障。數據集中后,原來的金融機構與人民銀行的數據接口程序將不能適應新的需要,金融機構需要開發新的數據接口程序與人民銀行進行網絡連接,以建立起與人行的安全網絡通道。這需要金融機構科技部門提供強有力的人員、技術和設備支持。為降低成本,商業銀行應先盡可能對原有系統進行優化,如果仍不能滿足人民銀行數據集中要求,則需重新開發接口系統。

2、增加人員配備,提高人員素質。央行統計數據集中后,金融機構總行(局)統計人員工作量將增加,工作任務會更加繁重,對統計人員素質要求更高,已經實現數據集中的金融機構出于自身經營管理的需要,對提高統計人員素質已有所作為,尚未實現數據集中的金融機構應通過培訓或招聘高素質人員等方法,進一步提高統計人員素質,為自身數據集中和人行數據集中做好準備。

3、加強統計標準化工作。金融機構對金融統計指標的認識和理解保持一致,是保證統計準確性的關鍵。目前,雖然各金融機構的指標體系與中央銀行的指標體系由于使用目的不同而并不完全相同,但長期以來已經能與央行指標體系進行良好銜接。目前,一些金融機構在進行數據大集中過程中為了與國際接軌和適應未來金融創新需要,對原來的指標體系進行了一定調整,隨著數據大集中成為各金融機構發展的必然趨勢,對指標體系的調整也成為必然,這就可能出現金融機構之間統計口徑不一致以及與央行統計指標體系銜接不暢的風險,因此金融機構應格外注意金融統計指標體系標準化的問題,密切關注央行統計指標的變化和調整以及央行在統計指標標準化方面的新進展、新舉措。

4、強化部門間的配合。統計工作和會計工作聯系緊密,商業銀行應強化會計(營業)部門與統計部門的配合,共同完成人民銀行數據集中的相關工作。會計部門調整會計科目后應及時通知統計部門,由統計部門及時做出相應調整,會計(營業)部門應根據統計部門的合理要求,提供相關數據。金融統計數據集中同樣離不開科技部門的支持,數據集中后,龐大的數據量對系統承壓能力、數據安全和災備的保障能力提出更高要求,在試運行階段乃至正式運行初期不可避免會出現這樣那樣的問題,這就需要統計部門和科技部門互相溝通,共同努力加以解決,以保證數據報送準確及時。

5、統計工作歸口管理。目前一些商業銀行統計人員常常身兼數職,不能集中精力進行統計工作,導致數據審核不及時或不仔細,對央行數據報送要求理解不透徹,給央行統計工作帶來困難。數據集中后,對統計數據質量等方面要求更加嚴格,商業銀行要深刻認識到報送給央行的統計數據是央行制定貨幣政策的重要依據,絕不能等閑視之,應積極整合行內資源,制定相應的歸口管理辦法,規范系統維護數據管理等工作,提高數據質量和數據報送數據修正的效率。

參考文獻:

[1]趙建寧,黃東略.數據大集中對金融統計工作的影響.《金融理論與實踐》, 2004;2

篇9

關鍵詞：合同結算糾紛 關鍵問題 防范對策

隨著我國社會經濟體制的不斷完善和人們法律意識的逐漸加強，工程合同成為了工程項目開展過程中維護雙方利益的重要法律依據。合同結算糾紛是工程糾紛中比較常見的一種糾紛形式，對各方的利益都造成了嚴重的影響，因此，避免合同糾紛問題顯得尤為重要。

一、引發合同結算糾紛的原因分析

（一）合同內容問題

合同內容糾紛問題在合同結算糾紛中出現的較多，爭端也比較大。由于發包方在合同簽訂中占據先天優勢，在擬定合同時可以加入有利于發包方的相關條款，而由于承包方在相關技術人員方面比較缺乏，對工程合同的內容理解又不夠全面和謹慎，沒有發覺合同中的相關問題，使得合同結算時出現矛盾。

（二）合同變更問題

合同變更是指工程施工過程中，發包方出于某些原因進行的工程量和合同的更改。合同變更問題同樣容易造成合同結算糾紛，究其原因是因為雙方在達成工程承包意向后未經第三方公證，并且合同變更前承包方沒有及時了解工程總量及隱秘工程量，使得工程延期，從而造成了合同計算糾紛的問題。

（三）合同違約問題

合同違約分為承包方合同違約和分包方的合同違約，這種現象也是造成合同結算糾紛的主要原因。承包方合同違約主要表現在工程時間違約和工程質量的違約，沒有按照書面合同上所規定的時間內交工，或是工程質量沒有符合標準；分包方合同違約則是不能及時支付工程材料費用、工程設備費用等相關費用，導致了工程的延期和停工現象的發生。

（四）工程尾款問題

當工程交工后，為保證工程的使用質量，發包方往往會按照合同條款扣押部分工程尾款，作為一年內工程質量保修金，確保承包方在一年內對工程履行相關的保修義務，保修期過后再將剩余尾款結交給承包方。而工程尾款問題常常因為承包方在進行工程維修時服務質量使發包方不滿意，而最終導致了合同結算糾紛事件。

（五）工程材料問題

工程材料問題同樣也會影響合同結算進度。由于材料市場價格的變動影響，承包方為牟取個人利益或減輕工程資金負擔，使用部分合同之外的建筑材料進行工程施工，從而導致了發包方的不滿，造成了合同結算糾紛。

二、合同結算糾紛的相關預防措施

（一）合同內容的推敲

在進行工程合同簽訂之前，作為承包方，應該仔細閱讀工程合同，認真推敲工程合同中的所有條款，加大對合同審核工作力度。要明確合同內容是否合法、有無缺項漏項、是否存在不公平性、合同中有無涉及自然因素對工程進度影響的說明、工程結算價格是否合理等問題，同時征求工商管理部門對合同的鑒定及合同簽名進行公證。我國已經出臺相應的法律政策，明確了工程合同內容及有關說明，承包方可以按照國家標準進行合同的審核，確定合同的有效性。而發包方，也應該依照相應的合同范本進行合同的擬定，確保合同的有效性及合法性，避免合同糾紛問題的出現。

（二）合同變更中工程量的計算

在工程施工過程中合同變更是非常普遍的，但合同變更需要在合理的條件下才能進行簽訂，從而保證工程的順利竣工。因此，在合同變更時，承包方同樣需要仔細閱讀工程變更條款，認真計算合同變更所增加的工程量，找出隱秘工程量，然后按照工程量進行工期的延長，確保沒有任何異議之后，方能簽訂變更合同，并且同樣征求工商管理部門的公證和鑒定。

（三）避免合同違約發生

合同違約，對于承發雙方都會造成嚴重的損失，因此，避免合同違約現象的發生才是消除雙發經濟損失的最好方法。作為發包方，應該深入了解承包方的實際施工能力，審視承包方的施工資格，確保工程的如期完成。同時，發包方應該督促工程監理人員對工程施工中的質量進行嚴格把控，以免造成嚴重后果；而作為承包方，同樣需要了解工程發包方的資歷和經濟狀況，對于風險較大的工程應該征求相關管理部門意見，杜絕合同違約事故出現。

（四）嚴格把控服務質量

在工程保修期，若工程出現一定質量問題，承包方應該認真履行維修義務，做好工程維修工作，保證工程尾款的順利結算。同時，承包方在工程施工期間也應該注意服務質量，嚴格工程管理，確保承發雙方的良好合作關系。

（五）做好工程內容的統計和匯總

工程日記是承包方施工過程中必須要認真記錄的，這有利于把握工程施工進度，還能夠為承包方提供一定的法律依據。承包方同樣需要做好工程施工材料的統一和審核，若工程材料需要變更，則必須向發包方認真匯報，待雙發達成共識并簽訂書面協議后，方能進行工程材料的更改，從而避免因工程材料導致的合同結算糾紛問題。

總結

工程合同是確保承發雙發利潤的重要工具，為避免合同計算問題的出現，需要承發雙方明確合同內容，認真履行合同義務，確保合作過程的順利結束。從以往合同糾紛的原因中需求問題答案，并在工程開展過程中進行注意，不僅能夠將雙方的損失降到最低，還能夠保證我國建筑工程事業的健康發展，對我國經濟發展、社會發展都有著非常重要的意義。

參考資料：

[1]張鵬，周宏.淺淡建設工程結算糾紛的幾個原因[J].油氣田地面工程，2008.8

篇10

【關鍵詞】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突變；原核表達

Expressions of different deletion mutated HCV core protein genes in E.coli

【Abstract】 AIM: To construct the recombinant plasmids expressing fulllength HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes and to express them in E.coli. METHODS: Entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated gene fragments from HCV core protein which respectively coded 1-191aa， 1-59aa plus 81-191aa， 1-169aa， 1-59aa plus 81-169aa were amplified by PCR and cloned into expression vector pRSETA， thus forming different recombinant plasmids （pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444）， which were transformed into E.coli BL21 （DE3） pLysS and induced by IPTG. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify expressed 6×Hisfusion proteins. RESULTS: Restriction analysis and sequencing confirmed that the 4 recombinant plasmids expressing entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were successfully constructed. Both SDSPAGE and Western blot analysis showed entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were expressed， and the respective molecular weights of the products were about 21×103， 19×103， 19×103 and 16.5×103. The fusion protein production accounted approximately for 20% of total bacterial protein. CONCLUSION: Different deletion mutated HCV core protein genes were expressed efficiently in E.coli.

【Keywords】 hepatitis C virus; core proteins; mutation; prokaryotic expression

【摘要】 目的： 構建丙型肝炎病毒（HCV）全長及3種不同缺失突變的核心蛋白基因的原核表達載體，并在大腸桿菌中表達. 方法：用PCR方法擴增基因型為1b型的HCV核心蛋白的全長及3種不同缺失突變的基因片段，對應氨基酸分別為C573：1-191aa，C510:1-59aa+81-191aa，C507:1-169aa，C444:1-59aa+81-169aa. 將其克隆到高效表達載體pRSETA中構成重組質粒（pRSETAC573，pRSETAC510，pRSETAC507，pRSETAC444），轉化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS. IPTG誘導表達6×His融合蛋白，表達產物經SDSPAGE及Western blot檢測和鑒定. 結果： 經酶切鑒定及測序證實全長及3種不同缺失突變的核心蛋白基因的原核表達載體構建正確. 經SDSPAGE及Western blot顯示在Mr約為21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103處出現融合表達條帶. 融合蛋白的表達量約占菌體蛋白總量的20％. 結論：全長及3種不同缺失突變的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大腸桿菌中得到有效表達.

【關鍵詞】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突變；原核表達

【中圖號】 R512.630.27

0引言

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）感染已成為全球性的社會公共衛生問題，迄今尚無有效的預防性疫苗. HCV核蛋白基因相對保守［1］并且能誘導CTL反應及ADCC，有可能用于開發HCV預防及治療性疫苗. 我室曾擴增羧基末端的20個氨基酸和（或）第60~80位氨基酸多肽基因缺失的核蛋白基因，并在真核細胞中表達成功，初步證實突變掉上訴兩個肽斷能提高機體免疫反應［2-3］. 為進一步探討不同缺失突變核心蛋白對免疫反應的影響，我們構建了HCV核心基因不同缺失突變基因片段的原核表達載體并在大腸桿菌中進行了表達.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1質粒與菌株源質粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444系本室將不同缺失突變的核心蛋白基因克隆入真核表達載體pCIneo中構建而成，其中分別插入了自西安地區患者血清中克隆的1b型HCV完整的核心蛋白基因（573 bp）， 60～80位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（510 bp）， 羧基末端20位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（507 bp）， 同時突變掉60～80位氨基酸和羧基末端20位氨基酸的核心蛋白基因片段（444 bp）. 原核表達載體pRSETA為Invitrogin公司產品，中間克隆載體pGEMT easy為Promega公司產品. E. coli JM109由本室保存，BL21為Invitrogin公司產品.

1.1.2工具酶及主要試劑DNA快速提取試劑盒購自上海華瞬生物工程公司、高保真PCR 試劑盒、DNA分子量標準、蛋白分子量標準均為大連寶生物工程公司產品，HindⅢ， BamHⅠ， T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒購自Promega公司. 抗His抗體購自Invitrogin公司，二抗及顯色試劑購自Sigma公司.

1.2方法

1.2.1PCR引物設計根據源質粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444中HCV核心蛋白基因起始密碼子下游及終止密碼子上游核苷酸序列設計了3條引物（上海鼎安生物技術有限公司合成）: 上游引物P1: 5′ GTGCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAAC 3′， 下游引物： P2: 5′ TCGCAAGCTTTCACAAATTTCCCTGTTGTTGCATA 3′， P3: 5′ TCGCAAGCTTTCAAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG 3′. 在其上游引物引入BamHⅠ酶切位點、下游引物引入HindⅢ酶切位點.

1.2.2目的片段的擴增分別以質粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444為模板進行PCR擴增，擴增過程中模板與引物對應如下：pCI573， pCI510為P1， P2； pCI507， pCI444為P1， P3. 循環參數為94℃ 5 min， 94℃ 1 min， 55℃ 50 s， 72℃ 1 min共進行30個循環，最后于72℃延伸10 min. 取5 μL PCR反應液在10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳上進行擴增產物檢測分析.

1.2.3重組質粒的構建及鑒定將4種PCR產物按1：3與中間載體pGEMT easy連接，轉化感受態細胞JM109，挑陽性克隆接種擴增，小量提取質粒DNA，并以HindⅢ， BamHⅠ雙酶切進行鑒定后交上海鼎安生物技術有限公司測序. 測序正確后將中間連接產物pGEMT easy573， pGEMT easy510， pGEMT easy507， pGEMT easy444用HindⅢ， BamHⅠ雙酶切，膠回收酶切產物與經相應雙酶切的pRESETA質粒連接. 轉化感受態細菌JM109，挑陽性克隆接種擴增，小量提取質粒DNA，并以HindⅢ， BamHⅠ雙酶切進行鑒定后交上海鼎安生物技術有限公司做序列測定.

1.2.4融合蛋白的誘導表達將重組質粒pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444轉化BL21感受態細菌. 30℃振搖擴增轉化細菌，3 h后（A600 nm約為0.6）加IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導表達，分別于1， 3， 5和7 h后收菌. 12 000 g離心5 min，菌體沉淀重懸于100 μL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，于液氮中和42℃反復凍融4次，以最大速度4℃離心10 min，然后分別在上清和沉淀中加入100 μL及200 μL 1×SDSPAGE上樣緩沖液，置于-20℃備用.

1.2.5SDSPAGE融合蛋白定量及Western blot檢測融合蛋白用18％的分離膠SDSPAGE電泳后將蛋白轉移到NC膜上，以50 g/L脫脂奶TBST封閉，以小鼠抗His抗體（1∶100）為一抗，生物素標記的抗鼠抗體（1∶500）為二抗進行抗原抗體反應.然后將NC膜浸入含鏈酶親和素過氧化物酶（1∶500）的TBST中室溫振搖1 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸鎳氨法顯色.

2結果

2.1表達載體的構建及鑒定亞克隆重組質粒pGEMT easy573， pGEMT easy510， pGEMT easy507， pGEMT easy444以及終載體pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444用HindⅢ， BamHⅠ雙酶切后，用瓊脂糖凝膠進行電泳分別在約573， 510， 507和444 bp處出現條帶，與預期分子量相符（圖1）. DNA雙向測序證實插入片段序列及讀碼框均正確，表明質粒構建成功.

圖1重組質粒的限制性酶切分析（略）

2.2融合蛋白的表達與分析經SDSPAGE電泳檢測，在Mr約21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103處出現條帶，均與預期的目的條帶分子量一致. 條帶隨誘導時間延長顏色加深，經IPTG誘導5 h時目的蛋白量最多. 經薄層掃描測定，融合蛋白的表達量約占菌體總蛋白的20%. 表達蛋白大部分以包涵體形式存在于菌體沉淀中，上清中也可見明顯蛋白條帶（圖2）.

2.3融合蛋白的Western blot結果顯色后Mr約21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103處出現藍色條帶，與預期的所要表達的6×His融合不同缺失突變核蛋白分子量大小相符，表明目的蛋白在大腸桿菌中得到了有效表達(圖3）.

圖2融合蛋白表達的SDSPAGE分析（略）

圖3融合蛋白的Western blot分析（略）

3討論

近年來，核心蛋白的抗病毒免疫成為丙型肝炎的一個研究熱點，但研究發現全長的核心蛋白不能誘導有效的CTL效應. 有學者推測核心蛋白的某些區段對機體免疫反應有抑制作用，為證實這一推斷，國內外學者［4-7］對HCV核心蛋白各個區段的功能作了大量研究. 有研究［8］用截去HCV基因羧基末端的核心蛋白（1~176位氨基酸）的表達產物免疫小鼠，發現核蛋白特異性抗體滴度在初次免疫第16周時急劇升高到1∶8000并至少持續到27 wk，同時誘導出特異性T細胞增殖反應. 另一研究小組［9］研究證明：截去羧基末端的核蛋白基因的質粒免疫小鼠能夠刺激IFNγ的產生，并誘導出強烈的核蛋白特異性遲發性超敏反應. Langhans等［10］報告來源于HCV核心蛋白第59~83氨基酸合成肽具有抑制HCV感染者外周血T細胞針對核心蛋白的增殖反應. 作者認為該多肽片段干擾了對核蛋白的抗原提純. 為進一步探討不同缺失突變核心蛋白對免疫反應的影響，我們將全長及3種不同缺失突變的核心蛋白基因在大腸桿菌中進行大量表達.

我們采用了原核表達載體pRSETA，該載體有兩個特點：一是含有T7啟動子，可被T7 RNA聚合酶識別，T7 RNA聚合酶的轉錄效率比大腸桿菌RNA聚合酶高5倍，能夠高效轉錄mRNA，大量表達目的蛋白. 二是載體上攜帶有6個His殘基，分子量僅為840，對目的蛋白的結構和生物學活性影響很小，而且便于純化. 本研究用該載體獲得了目的蛋白的高效表達，同時我們還觀察到IPTG最佳誘導時間為5 h. 為減少核心蛋白本身的細胞毒性作用，采取了30℃誘導. 總之，本研究成功構建了不同截短核心蛋白基因的原核表達載體，獲得了正確的表達蛋白，為進一步研究HCV核心蛋白各區域的免疫學功能打下了基礎.

參考文獻

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