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關鍵詞：動物遺傳學 動物科學 遺傳檢測 細胞遺傳學 分子遺傳學

中圖分類號：G642.0 文獻標識碼：C DOI：10.3969/j.issn.1672-8181.2013.23.150

動物遺傳學是動物科學專業的重要專業基礎課程。遺傳學具有基礎理論抽象、邏輯思維強、知識面涵蓋廣等特點，是動物育種的理論基礎。遺傳學的基本概念和原理來自于生產、生活和科學研究的實踐，遺傳學實驗是遺傳學教學中重要的環節，是理論教學的深化和補充。近些年，隨著遺傳學的不斷發展，取得了很多的進展，特別是隨著分子生物學的發展，遺傳學進入了全新的分子遺傳學時代，較之之前的形態遺傳學、細胞遺傳學而言，分子遺傳學更為抽象，因此，長期沿用下來的經典遺傳學實驗顯然已經不能滿足遺傳學快速發展的需求，從而對遺傳學相關實驗課提出了更高的要求。

針對以上情況，結合我校動物科學專業設置的實際情況，經過長期的摸索和創新，我校動物科學學院近年來開始開設了實用遺傳檢測技術課程，學時120學時。主要通過實驗制備和觀察，使學生從細胞、分子及群體水平上掌握遺傳學的實驗操作方法；學會基本儀器設備的使用技巧；了解遺傳學研究方法和手段，進一步加強學生獨立分析問題和解決問題的能力，獨立操作和創新能力及培養學生的動手能力。同時注意培養學生實事求是，嚴肅認真的科學操作和良好的實驗習慣，為今后的工作和研究打下良好基礎。本文將就本課程的設置進行綜述，旨在為相關學科今后在遺傳學相關實驗課程的開設方面提供借鑒。

1 細胞遺傳學篇

細胞遺傳學是研究細胞中染色體遺傳規律的學科。 同時也是在細胞層次上進行遺傳學研究的遺傳學分支學科。著重研究細胞中染色體的起源、組成、變化、行為和傳遞等機制及其生物學效應。

圍繞細胞遺傳學，設立了如下實驗項目：①細胞培養。主要講解細胞的體外培養原理、條件、技巧和注意事項。主要通過采集動物外周血培養2個周期，用以觀察培養細胞在體外分裂情況；②培養細胞的同步化處理。主要講解在體外培養條件下同步化處理的原理、條件、技巧和注意事項。處理培養細胞分裂中期同步化；③外周血淋巴細胞染色體標本制作。主要包括以下過程：收集細胞低滲處理固定涂片染色觀察；④骨髓細胞染色體標本的制備。主要包括以下過程：秋水仙素處理取管狀骨沖取骨髓細胞低滲處理固定涂片染色觀察；⑤果蠅唾液腺染色體標本的制備。主要包括以下過程：培養果蠅三齡幼蟲解剖分離唾液腺水解處理染色壓片觀察；⑥染色體顯G帶。主要包括以下過程：制備染色體標本片胰蛋白酶處理染色觀察；⑦各種顯微鏡的調試實用實踐。主要包括熟悉普通研究顯微鏡，相差顯微鏡，暗場顯微鏡，熒光顯微鏡的光路合軸、聚光器調焦、濾鏡選用等操作；⑧染色體標本的觀察照相。主要包括以下過程：顯微鏡下觀察制備好的染色體標本片統計分裂相的比例數細胞染色體數選形態良好數目占眾數的分裂相拍照；⑨染色體核型分析。主要包括以下過程：染色體照片photoshop軟件裁剪整理同源染色體配對排序測染色體臂長計算相對長度和臂比。

2 分子遺傳學篇

隨著遺傳學的迅猛發展，分子遺傳學已經滲透到了遺傳學的各個角度，分子遺傳學也因此在教學中已經占有了相當大的比重。分子遺傳學實驗技術也成為研究者使用得最多的分析手段，這就進一步要求我們的實驗教學也要適應遺傳學的發展。

圍繞分子遺傳學，設立了如下實驗項目：①動物組織（肌肉）中DNA的提取。主要包括以下過程：采集動物組織材料破壞細胞膜和核膜白和DNA分離抽提純化DNA乙醇沉淀DNA檢測DNA純度和量；②動物性別鑒定。主要包括以下過程：提取動物組織DNAsry特異引物PCR擴增電泳判斷；③DNA酶切電泳。主要包括以下過程：λDNA限制性內切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳檢測；④動物來源物種鑒定。主要包括以下過程：樣品采集基因組DNA提取PCR-RFLP瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷；⑤動物組織總RNA的提取。主要包括以下過程：樣品采集RNA提取瓊脂糖凝膠電泳檢測；⑥Total RNA質量的檢測及cDNA的制備。主要包括以下過程：紫外分光光度計檢測Total RNA質量反轉錄cDNA檢測；⑦microRNA指紋圖譜技術（MTFP）在肉品質檢測中的應用。主要包括以下過程：樣品采集總RNA提取及檢測cDNA的制備及檢測PCR反應及檢測PAGE電泳檢測和分析；⑧PCR-RFLP鑒定ABO基因型。主要包括以下過程：毛囊（毛發）中總DNA的提取及電泳檢測糖基轉移酶基因片段擴增及電泳檢測擴增片段限制性酶切及電泳檢測。

遺傳學是研究生物遺傳和變異的科學。隨著現代生物科學技術的發展，遺傳學已成為生命科學領域中發展最為迅速的基礎學科之一，而實驗實踐教學環節為培養學生的科學思維、探索思維和實踐創新能力提供重要途徑，并且可以提高學生的實際動手能力和分析問題、解決問題的能力。遺傳學實驗技術和方法是遺傳學建立和發展的基礎，如今現代的遺傳學實驗技術已廣泛滲透到生命科學的各個分支領域，并正在發揮其獨特的作用。本文通過數名長期工作在遺傳學本科教學一線的教師多年的教學實踐經驗，結合動物科學專業設置的特色，摸索了一套適合動物科學專業本科生實際的實驗課教學體系，旨在為培養理論與實踐兼備的高素質動物科學方向的本科生做出一定的貢獻，也期望為國內同行遺傳學教學相關實驗課的開設提供一定的借鑒作用。

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作者簡介：蘇蕊，內蒙古農業大學動科院，內蒙古呼和浩特 010018

張燕軍，內蒙古農業大學動科院，內蒙古呼和浩特 010018

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【關鍵詞】胃癌；分型；進展

胃癌是消化系統的常見惡性腫瘤，為全世界范圍內發病率最高的癌癥之一，根據世界衛生組織癌癥研究中心2002年的統計，我國胃癌發病率僅次于日本，位于全球第2位。2007年中國腫瘤登記提示：我國胃癌的發病居第二位，僅次于肺癌，死亡據第三位，僅次于肺癌、肝癌。胃癌在演進過程中隨著附加的基因突變會產生不同的亞克隆，使其不斷異質化導致其侵襲和轉移能力不斷加強，而這是胃癌治療困難和致死的主要原因。國內外學者都在尋求能指導臨床方案選擇及判斷預后的胃癌分型，傳統的癌癥診斷對病理學依賴性較大，有時會因為腫瘤的不典型或臨床信息的不完整而造成診斷困難。應用基因分析技術所產生的信息，特別是應用高通量芯片技術所產生的信息可以為胃癌分型提供更多的參考，因此對目前胃癌相關的分型予以綜述。

1 胃癌的傳統分型

胃癌病理分型是以組織形態結構和細胞生物學特性為基礎，不同類型的胃癌，其形態結構和生物學行為各異，流行病學和分子機制亦不同，以致現有的胃癌分型系統眾多。目前，常用的是WHO型、Lauren分型，大體分型主要使用Borrmann分型。

1.1 WHO胃癌包括以下常見組織學類型

狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌、腺鱗癌、鱗癌、小細胞癌、未分化癌。此外，胃內還可以發生類癌。WHO分型將Lauren分型的腸型、彌漫型納入腺癌之下。其管狀腺癌還可進一步分成高分化、中分化與低分化腺癌。少見類型或特殊類型胃癌有：實體型變異、肉瘤樣變異等。

1.2 1923年德國病理學家Borrmann提出的一種胃癌大體形態分型方法，此分型主要根據癌瘤在黏膜面的形態特征和在胃壁內的浸潤方式進行分類，將胃癌分為4型：Ⅰ型（結節型），II型（潰瘍局限型），III型（浸潤潰瘍型），是最常見的類型，約占50%。Ⅳ型（彌漫浸潤型），由于癌細胞彌漫浸潤及纖維組織增生，胃壁呈廣泛增厚變硬，稱“革囊胃”。Borrmann分型是胃癌經典的分型方法，既能反映胃癌的生物學行為，又簡潔實用，國際上廣泛采用。

1.3 Lauren分型將胃癌分成兩大主要類型，即腸型與彌漫型，當腫瘤內兩種類型成分相當時就稱為混合型。胃癌發生是一個多步驟的過程，彌漫型和腸型在腫瘤發生各個階段會產生多種基因及表觀遺傳學方面的變異。常見的包括抑癌基因的點突變和雜合性丟失，常見的表觀遺傳學異常包括CPG島的甲基化引起的腫瘤抑制基因沉默和腫瘤促進基因轉錄水平的增高。

2 胃癌分型與分子病理學

胃癌分型研究的意義在于探索其是否對判斷預后有價值或者對于今后的治療有指導意義。當前，國內張樹華采用組織病理與組織化學和免疫組織化學技術相結合的方法，兼顧宿主的免疫防御反應，把胃癌分為兩型：限制生長型和促進生長型。限制生長型預后較促進生長型好。

根據黏蛋白標記的差異，胃癌組織被分為4型：1）胃型：胃型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；2）胃腸型：胃型黏蛋白標記的胃癌細胞> 10%且腸型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；3）腸型：腸型黏蛋白標記的胃癌細胞>10%；4）未分類：胃腸黏蛋白標記的細胃癌細胞

Solcia等對對294例平均隨訪時間長達150個月的胃癌進行研究顯示，如果將胃癌的組織學結構、細胞異型性程度、p53基因突變、18q雜合性缺失、微衛星不穩定性以及有無脈管神經浸潤等因素與預后綜合分析，可以將胃癌惡性程度分成三級。胃癌I級（預后良好型）包括：大量腫瘤內/旁淋巴樣細胞反應型、高分化管狀腺癌、黏液結節型和促纖維結締組織增生性彌漫型胃癌，I級胃癌約占全部胃癌病例的37%。胃癌III級（預后不良型）包括：高度異型性胃癌、浸潤型黏液腺癌、腫瘤細胞異型性中等但具有p53基因的第7或第8外顯子突變、伴有血管淋巴管浸潤以及神經浸潤者，III級胃癌占全部胃癌病例的19%。其他胃癌則歸屬于預后中等的胃癌Ⅱ級，占全部胃癌的44%。這一關于胃癌惡性程度評價體系雖然是不依賴于臨床分期的胃癌預后判斷新標準，但實際操作中涉及到微衛星不穩定性的分子遺傳學檢測、p53基因突變檢測以及EB病毒原位雜交檢測等實驗技術，在臨床普及以及操作流程標準化控制等方面均有待統一。

3 微衛星不穩定性與胃癌分型

微衛星不穩定性[MSI]是胃癌發生過程中的一個常見事件，反應了腫瘤潛在DNA錯配修復缺陷，常常由Hmlh1啟動子區甲基化引起，胃癌合并MSI者其臨床病理因素特別，預后相對良好，胃腸道腫瘤中MSI的測定是最先被廣泛利用的預后分子檢測之一。MSI的檢測常采用熒光定量多重PCR進行，費用相對低，適用性廣。以往的很多觀察表明，胃癌中MSI的存在不僅僅是與已知的與組織病理特征強關聯的分子分型標志，同時MSI能能區分預后良好好亞組。因此Simpson等建議將MSI作為一個有效的分子分型工具。葡萄牙的一項研究表明，胃癌患者并低度MSI五年生產率為30%相比，而高度MSI者則為70%。韓國的一項大型研究也表明在胃癌分期為II、III期的患者MSI與預后良好有關。

4 胃癌的分子分型

以分子特征為基礎的新型分類體系即分子分型。高通量的基因分析可以是DNA水平的基因多態性分析、DNA甲基化分析和基因拷貝數分析.也可以是RNA水平的基因表達譜分析、微小RNA表達譜分析和蛋白表達水平的蛋白芯片分析等。

腫瘤分子分型的基礎：目前可以在DNA、RNA和蛋白質水平上進行腫瘤分子分型的研究。在DNA水平，可以依據基因突變、基因組的細胞遺傳學改變或甲基化差異進行分型。根據基因表達譜（RNA水平）的差異實施分型，是目前分子分型的研究主體，以表達譜芯片為基礎的分子分型研究數據處理分二類：一是，unsupervised analysis；二是，supervised analysis。在蛋白質水平，可以根據蛋白質表達譜的差異，亞細胞結構蛋白組成的不同或蛋白質翻譯后修飾的改變來進行分型。

分子分型的研究方法主要有：基因表達譜芯片技術：它可以同時觀察成千上萬個基因在不同個體、不同組織、不同發育階段的表達狀況。它的原理是在已建立的cDNA或寡核苷酸組成的芯片或微陳列上，用不同顏色熒光標記的cDNA制備的探針與之雜交，掃描及計算機處理所得的信號就代表了樣品中基因的轉錄表達情況。基因芯片技術在腫瘤的分子分型、基因功能、信號通路及代謝與調控途徑研究等方面有顯著的優勢；比較基因組雜交（CGH）技術：是在染色體熒光原位雜交基礎上發展起來的一種新的分子細胞遺傳學研究技術。它主要是用不同的熒光體系來標記腫瘤組織DNA和正常對照DNA，與正常中期分裂象染色體進行競爭性抑制雜交，熒光信號攝取及軟件分析所得的比值可判斷染色體區段的擴增、缺失還是正常。它僅需少量腫瘤組織DNA即可在整個基因組水平研究不同基因組間DNA拷貝數差異，并將這些異常定位在染色體上。CGH與微芯片技術結合的芯片CGH，以cDNA作為雜交靶，可使得基因組水平遺傳物質異常的分辨率達到幾十個kb，并可對關鍵基因改變進行精細定位；蛋白芯片技術：基因突變和基因表達差異不一定導致相應的蛋白表達，而且蛋白質還存在磷酸化，乙酰化等復雜的翻譯后修飾過程，這些改變在轉錄水平上是無法檢測的。以高通量結合生物信息學為特點的蛋白質組學分析技術可以從細胞整體水平上檢測到這種變化，為腫瘤分子分型以及治療標志物的篩選帶來巨大的便利與可能。蛋白芯片技術主要包括雙向凝膠電泳技術、質譜技術以及生物信息學技術。

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隨著對白血病發病機制的深入研究及其治療方案的改進,白血病的完全緩解率也有明顯的提高,但仍有一部分患者最終會復發。近年來的研究發現, 白血病的復發與微小殘留病密切相關。微小殘留病(minimal residual disease, MRD )是指經過誘導治療達臨床緩解時，白血病患者體內殘留的少量白血病細胞。對患者進行微小殘留病監測對白血病的治療和預后判斷具有非常重要的意義。檢測MRD的關鍵是尋找分子基因標志。細胞免疫表型及遺傳學的異常改變在急性白血病MRD 檢測中占有重要地位。令人遺憾的是，這些方法只適用于少數患者，大多數患者并不具備遺傳學的預后指標。隨著對急性白血病分子生物學發病機制研究的進步，人們把急性白血病的發生歸結為抑癌基因和原癌基因通過遺傳學和表觀遺傳學機制的發生異常改變［1］。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳調控機制，其與腫瘤發生、發展以及檢測相關機制的研究逐步成為研究的熱點。表觀遺傳學生物標記（Epigenetic biomarkers），特別是DNA 甲基化相關標記檢測擁有遺傳學標記、抗體等標志不具備的優勢。本文就MRD細胞分子遺傳學的檢測方法及DNA甲基化檢測MRD的臨床應用進行綜述。

1 常用白血病MRD檢測方法的研究進展

1.1 分子生物學方法：遺傳學的改變，包括染色體易位/缺失、基因突變等是白血病發生的基礎，其所導致的正常基因表達調控紊亂和功能異常是白血病發生的主要原因。異常的遺傳學改變，已成為急性白血病臨床檢驗資料的重要組成部分。

實時定量聚合酶鏈反應( RQ-PCR ) 方法結合了PCR和熒光探針兩種技術，通過定量檢測白血病細胞中標志性基因實時觀測MRD，是目前檢測MRD最為敏感的方法，靈敏度可達10-4-10-5，已成為臨床實驗室建立MRD檢測方法的首選。其檢測的基因標志包括：（1）染色體異位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 細胞受體（T-cell receptor ，TCR）重排等，常見的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表達增高的腫瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）發生突變的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病發展過程中比較穩定,以其作為PCR檢測MRD的分子標志具有特異性強、敏感度高的優點［2］。但是這些檢查不僅價格昂貴，其檢測的標本為RNA，存在不易保存，結果不穩定的缺點。更令人遺憾的是,由于白血病是一組異質性很大的惡性血液病，各亞型之間遺傳背景不同，這些遺傳學基因標志只能覆蓋1/3的白血病類型，還有2/3類型的白血病不具備遺傳學基因標志，無法在臨床上進行MRD的檢測。即使聯合應用多種基因仍有40%～50%的患者無法找到適當的基因標志檢測MRD，使其疾病狀態缺乏準確的判斷依據。

1.2流式細胞術( FCM)：FCM是通過檢測在正常細胞上不表達或低表達而在白血病細胞上表達或高表達的白血病相關免疫表型來定量檢測MRD，能夠準確定量殘留白血病細胞數，并且還能了解殘留白血病細胞的凋亡情況［3］。其優勢是每秒可檢測5 000～10 000個細胞,并能用計算機記錄處理,快速地對各個細胞進行多參數定量分析,靈敏度達到10- 4。但應用此法必須要對患者初發時的免疫表型特征有詳盡了解,以便選擇適當的標志檢測MRD。因為白血病細胞與正常細胞相比, 通常低達10- 5～10- 6, 可能低于FCM檢測范圍而使這種方法缺乏特異性; 而且隨著病程發展, 細胞表面的抗原發生改變, 會導致假陰性結果。

2 異常DNA甲基化檢測白血病MRD的臨床研究進展

DNA甲基化是指在DNA序列不變的情況下，通過影響基因轉錄活性以調控基因的表達。DNA甲基化作為一種表觀遺傳學改變與白血病的發生密切相關，在不改變遺傳信息的前提下導致細胞遺傳特性改變，作為腫瘤性疾病"二次打擊"經典假說的重要補充，已成為白血病研究的新熱點。DNA異常高甲基化導致抑癌基因的失活在白血病發生發展、診斷、監測微小殘留病、預測病情以及指導治療方面都有重要作用，這些表觀遺傳學標志作為MRD監測標志物的臨床研究逐漸引起大家的關注。

P15基因甲基化與白血病的關系目前研究最為深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴細胞白血病(ALL)患者發生p15基因高甲基化，且持續p15基因高甲基化預示疾病復發。與p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明顯延長（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。

Au等［5］檢測了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在發展為治療相關的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早為兩年前。提示pl5甲基化發生在t-MDS/AMI 早期，檢測p15甲基化有助于判斷預后、指導治療。在一組65例急性早幼粒細胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年無病生存率僅為29．64％ ，顯著低于34例無甲基化的患者79%。p15基因甲基化與預后不良相關。

Id4和zo-1是我室新發現的兩個血液系統相關候選基因，并對其在白血病發生、復發中的作用及應用于MRD檢測進行了系列基礎與臨床研究。

采用MS-PCR的方法對完全緩解期白血病患者骨髓標本檢測id4基因甲基化狀態，結果發現：（1）58例完全緩解的急性白血病人MRD的檢出率為41%，MRD陽性的患者12個月內復發率為62.5%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為10%。（2）16例異基因外周血干細胞移植后的白血病患者中，5例檢測到MRD的患者中有4例在1年的隨訪期出現復發，而11例移植后MRD持續陰性的患者無一例復發。

研究對26例完全緩解的急性白血病患者進行zo-1基因甲基化檢測，MRD檢出率為34.6%，MRD陽性的患者12個月內復發率為57.1%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為15.4%，MRD陽性病人復發率明顯高于陰性者。Id4和zo-1基因甲基化檢測可能成為急性白血病新的生物標記用于預測疾病的預后以及復發。

隨著PCR 技術的進步，將實時定量PCR（real-time PCR）與MSP 結合提高了甲基化分析檢測的特異性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR為MRD檢測開辟了另一種解決方法。甲基化定量水平的變化對于細胞修復、腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。因此，甲基化定量PCR技術被應用與臨床各領域的研究。

Shuchi等［6］以啟動子區高甲基化狀態的雌激素受體α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做為MRD標志，采用定量甲基化特異性PCR對180例急性白血病患者骨髓標本進行檢測，結果發現：（1）臨床緩解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因啟動子區呈現高甲基化狀態的患者較低甲基化狀態的患者有更高的復發風險，而且ER-α和p15INT4B基因啟動子區甲基化水平的增高與患者無病生存期（disease free survival,DFS）縮短有明顯相關性。（2）對5名兒童ALL患者ER-α基因啟動子區甲基化程度進行了自誘導緩解后的追蹤檢測，結果提示疾病復發狀態較緩解狀態ER-α基因啟動子甲基化水平增加。其結果與目前常用的MRD監測標志TCR/免疫球蛋白重排水平結果基本一致。

另一研究以啟動子區高甲基化狀態的p73、p15、p57KIP2基因為MRD標志，通過對199例Ph染色體和MLL陰性的處于完全緩解狀態（complete remission,CR）的成人ALL標本進行定量甲基化特異性PCR檢測，研究結果提示p73基因啟動子區甲基化水平與第一次CR持續時間及無病生存期（DFS）及總生存期（overall survival, OS）縮短間有顯著相關性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR檢測有可能成為一種評估急性白血病復發風險及MRD檢測的有效手段。

結語

白血病作為一種惡性腫瘤，復發是影響其患者生存的主要問題。患者體內白血病微量殘留病是復發的主要根源，對患者進行微量殘留病監測在白血病的治療和預后判斷中具有非常重要的意義。遺憾的是，由于絕大多數患者缺乏明確的遺傳標記作為早期檢測和準確評估MRD的標志，在臨床上常因治療不足導致疾病復發或治療過度引起嚴重并發癥，絕大多數患者在發病后1~3年內死亡。因此，要在白血病MRD早期檢測和指導治療上有所突破，就必須尋找能夠早期診斷白血病MRD的特異性強、通用性好的分子標志物。DNA 甲基化作為腫瘤相關標記，與遺傳學標記、細胞表面抗體等標志具有更多的優勢。首先，臨床常規的腫瘤標記檢測以蛋白或者RNA為對象，必須采集新鮮樣本以確定檢測結果的準確性。而甲基化檢測則以DNA 為樣本，很容易從各種體液中，甚至石蠟包埋組織中得到，極大地擴展了研究資源。其次，甲基化以DNA作為研究對象，較RNA 和蛋白更穩定，更容易保存。進而保證了檢測結果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的變化對于腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。

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關鍵詞基因治療;治療方式;發展前景

中圖分類號r459.9文獻標識碼a文章編號 1007-5739(2010)01-0025-01

美國是世界上最早開展基因治療的國家,也是目前開展基因治療最多的國家。我國在1991年7月開始基因治療的臨床研究,最早的工作是對b型血友病的基因治療及利用抑癌基因對癌癥的基因治療[1]。基因治療目前主要用于治療對人類健康威脅嚴重的疾病,包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。

1基因治療的方式

1.1體內基因治療

體內基因治療是指將具有治療功能的基因直接轉入病人的某一特定組織中。利用反轉錄病毒載體已成功地將真核基因轉入動物細胞,但通過質粒dna的直接操作,將更加省時而且產量較高;采用溫和病毒載體的體內基因治療主要是通過腺病毒和單純皰疹病毒來完成的,即將載有矯正基因的載體直接注射入需要這些基因的組織。以腺病毒為載體的體內療法在遺傳性疾病方面,目前主要見于囊性纖維變性的基因治療研究。多數研究表明,基因治療糾正了呼吸道上皮的氯離子轉運缺陷,使跨上皮基礎電位下降,肺功能有所改善[3]。

1.2反義療法

反義療法主要是通過阻遏或降低目的基因的表達而達到治療的目的。反義療法是通過引入目的基因的rna的反義序列而達到上述目的。當引入的反義rna與mrna相配比后,用于翻譯的mrna的量就大大減少,因而合成的蛋白的量也相應大大減少。引入的反義序列也可能與基因組dna互補配對,從而阻遏mrna的轉錄。這2種情況都會使細胞中靶基因編碼的蛋白合成大大減少,以達到基因治療的目的。

1.3通過核酶的基因治療

20世紀80年代初,美國科學家cech和altman發現了核酶,核酶是指由rna組成的酶,能夠序列特異性地抑制靶mrna。近年來,核酶在抑制癌基因的表達[4]、增強腫瘤對藥物的敏感性及抑制腫瘤血管的生成等方面的應用得到了廣泛的研究。

1.4自殺基因療法

自殺基因療法是惡性腫瘤基因治療領域最有希望的方法之一,已廣泛用于各種惡性腫瘤的基礎研究和臨床試驗性治療。它是用藥物敏感基因轉染腫瘤細胞,其基因表達的產物可以將無毒性的藥物前體轉化為有毒性的藥物,影響細胞的dna合成,從而引起該腫瘤細胞的死亡。

2基因治療存在的問題

2.1基因治療的社會和倫理問題

基因治療不僅僅是一種醫療方法,它還涉及很多其他問題。因為當人們試圖“糾正”人類自身“不正常”的基因時,這種糾正的后果是無法預料的。由于人類的遺傳信息非常復雜,轉基因也可能帶來不可預料的后果,沒有人能保證這種基因結構的改變絕對不會造成人類某一未知功能的缺失。另外,當人們試圖把基因治療引入生殖細胞時,又涉及后代基因結構的改變問題,且改變將直接影響這個“未來人”,這是一個很難解決的倫理問題。

2.2基因治療的技術問題

目前,基因治療的對象是單基因的缺陷,但許多疾病涉及多個基因之間復雜的調控和表達關系。對這類疾病的基因治療難度很大,因為向細胞中導入多個基因后,使幾個基因之間能保持正常的調控關系幾乎是不可能的。即使是單基因缺陷癥,使導入細胞的基因能正常表達也是一個較復雜的問題。將基因導入細胞后,其表達量的多少是直接影響能否達到治療的目的和有無副作用的關鍵。但這個問題將會在人類基因組計劃完成的基礎上,對人類后基因組計劃的開展,弄清了人類基因之間復雜的調控聯系后而最終得到解決。只有這樣,才能在基因治療中盡量做到使導入的基因處于正確的調控下,取得治療效果,消除副作用。

3展望

以基因轉移為基礎的基因治療要在臨床上很好地應用,還有待理論和各種技術的進一步發展。過去20~30年基因治療的發展已取得了巨大成就,已被看成是對先天和后天基因疾病的潛在有效的治療方法,不過其依然存在缺少高效的傳遞系統、缺少持續穩定的表達和宿主產生免疫反應等問題。今后基因治療研究將向2個方向發展:一是基礎研究更加深入,以解決在臨床應用中遇到的一些困難及基因治療本身需要解決的一些難點;二是臨床試用項目增多,實施方案更加優化,判斷標準更加客觀,評價效果更加精確。總之,隨著分子生物學、分子遺傳學以及臨床醫學的發展,基因治療也會不斷發展,日趨成熟,很多難題會得到解決,并在臨床上得到廣泛應用。整理

4參考文獻

[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科學出版社,2004.

[2] anderson w.human genetherapy[j].nature,1998(392):25.

篇5

骨髓細胞形態學檢查是一門具有百年悠久歷史的血液病診斷技術，一百多年來一直都是使用瑞氏及其先驅者發明的涂片染色法，它是血液病理學重要的診斷工具。因為其制片的過程容易簡單，能快速的對樣品做出初步檢查，即使在血液病檢測手段與日俱進的今天，傳統的骨髓細胞形態學檢查仍然具有獨一無二的魅力，它為現代血液病理診斷的發展奠定了基礎。本文通過骨髓細胞形態學檢查對其本身的不斷完善進步，并結合其他現代血液病診斷技術，在MICM方法上對各種白血病的發病機理的研究現狀作一綜述。

一、血細胞的生成，發育規律及正常形態學特征

(一) 血細胞的生成

目前認為，所有血細胞均起源于共同的造血干細胞。造血干細胞是造血組織中一類目前尚無形態學特征描述的功能細胞。其功能特點為：①具有高度自我更新的能力；②具有多向分化的能力。

血細胞的生成過程可劃分為三個連續的階段，即造血干細胞，造血祖細胞和形態學上可辨認的各系原始幼稚細胞階段，然后進一步成熟為具有特定功能的各系血細胞。

(二) 血細胞發育過程中形態學演變的一般規律

1、細胞大小及外形

(1)大小：從原始細胞到成熟細胞，胞體由大逐漸變小。但巨核細胞則與此相反。

(2)外形：紅細胞系始終呈圓形，粒細胞和淋巴細胞系保持圓形或橢圓形不變；單核細胞系和巨核細胞系則均由圓形或橢圓形變為不規則形。

2、核質比例(N/C)胞核逐漸縮小(巨核細胞例外)，胞質量逐漸增多，由核大質少變為核小質多。

3、細胞核

(1) 大小：由大變小，巨核細胞的胞核則由小明顯變大。

(2) 核形：幼紅細胞胞核始終呈圓形，核逐漸縮小，核染質固縮，最后脫核而消失，成熟紅細胞無細胞核；粒細胞系原始及早幼粒細胞階段呈圓形或橢圓形，隨著細胞成熟，胞核的一側逐漸凹陷，最后形成分葉狀。

(3)核位置：居中，常偏位，側這邊。

(4)核染色質：結構由細致疏松逐漸凝集變為緊密粗糙，著色則由淺變深。

(5)核膜：由不明顯到明顯。

(6)核仁：由清晰可見到消失。

4、細胞質

(1)胞質量：一般由少逐漸增多，淋巴細胞例外。

(2)著色。

(3)顆粒：多從無到有，從非特異性顆粒到特異性顆粒。

(4)空泡：正常情況下，漿細胞胞質中可見小空泡，其他細胞系列中一般無空泡，出現空泡多由于細胞退行性變。

二、常見血液病的形態學特征[1]

(一) 貧血

1.缺鐵性貧血 是因體內貯存鐵缺乏而使血紅蛋白合成不足所致。

【血象】

(1)紅細胞，血紅蛋白均減少，以血紅蛋白減少更為明顯。

(2)輕度貧血時成熟紅細胞的形態無明顯異常。中度以上貧血才顯示小細胞低色素性特征，紅細胞體積減小，淡染，中央蒼白區擴大。

(3)網織紅細胞輕度增多或正常。

(4)白細胞計數和分類計數，以及血小板計數一般正常。

【骨髓象】

(1)骨髓增生明顯活躍。

(2)紅細胞系統增生活躍。

(3)貧血早期程度較輕時，幼紅細胞形態無明顯異常。中度以上貧血時，幼紅細胞內血紅蛋白合成不足，細胞體積減小，胞質量少。

(4)粒細胞系相對減少。

(5)巨核細胞正常。

2、再生障礙性貧血(AA)簡稱再障，是由于多種原因所致骨髓造血干細胞減少和(或)功能差異常及造血微環境損傷，導致紅細胞，粒細胞和血小板生成減少的一組綜合征。

(1)急性期：急性型再生障礙性貧血(AAA)又稱重型再障I型(SAA-I)，起病急，發展迅速，常以嚴重出血和感染為主要表現。

【血象】呈全血細胞減少。①紅細胞，血紅蛋白顯著減少，兩者平行性下降，呈正常細胞正常色素性貧血；②網織紅細胞明顯減少，絕對值

【骨髓象】急性型再障的骨髓損害廣泛。①骨髓增生明顯減低；②粒、紅兩系細胞極度減少，淋巴細胞相對增高；③巨核細胞顯著減少；④漿細胞分類比值增高。

(2)慢性型：CAA起病和進展緩慢，以貧血和輕度皮膚，粘膜出血癥狀多見，嚴重出血和感染少見。

【血象】①紅細胞，血紅蛋白平行性下降，血紅蛋白多為中度或重度減低，呈正常細胞正常色素性貧血。②網織紅細胞減少，絕對值低于正常，常小于15×109/L；③白細胞減少，多在(2、0~3、0) ×109/L；④血小板減少，多在(30~50) ×109/L。【骨髓象】慢性型再障的骨髓中可出現一些局灶性代償性造血灶，故不同部位骨髓穿刺的結果可有一定的差異。①骨髓增生程度多為增生減低；②巨核細胞、粒細胞、紅細胞三系細胞均不同程度減少。巨核細胞減少常早期就出現，治療有效時恢復也最慢，故在診斷上的意義較大。③淋巴細胞相對增多。

如穿刺部位為代償性造血灶，則骨髓象呈增生活躍，粒系百分率可呈正常或減低，紅系細胞百分率增高，但巨核細胞仍顯示減少或明顯減少。

(二) 白血病

1、急性白血病

【血象】

(1)紅細胞及血紅蛋白中度或重度減少，呈正常細胞正常色素性貧血。

(2)白細胞計數不定：白細胞數增多者，多在(10~50) ×109/L之間，也有白血病計數在正常范圍或減少。白細胞分類計數可見一定數量的白血病性原始或幼稚細胞，所占百分率不定。

(3)血小板計數常減少。

【骨髓象】

(1)骨髓增生在極盛期明顯活躍或極度活躍，但在疾病過程中會出現島狀增生，非均一性增生，局部增生(混雜性浸潤)及間質變，再障樣變等多種變化需要通過骨髓活檢來鑒定。

(2)一系或二系原始細胞明顯增多。≥30%ANC(all nucleated cell,所有有核細胞)。

(3)因白血病細胞類型的不同，其他系列血細胞均受抑制而減少。

(4)涂片中分裂型細胞核退化細胞增多。在急診白血病中，“藍細胞”較其他類型白血病中多見；在急粒和急單白血病中，可見到Auer小體。

2、慢性白血病

慢性粒細胞白血病：CML為起源于造血干細胞的克隆性增殖性疾病，以粒系細胞增生為主。多見于青壯年，起病緩慢。突出的臨床變現為脾明顯腫大和粒細胞顯著增高。細胞遺傳學的特征為具有特異性的Ph染色體。

【血象】①紅細胞及血紅蛋白早期正常或輕度減少，隨病情發展貧血逐漸加重，急變期呈重度貧血。一般為正常細胞正常色素性貧血；②白細胞顯著增高為突出表現。疾病早期可在(20~50) ×109/L,多數在(100~300) ×109/L。分類計數粒細胞比例增高，可見各階段粒細胞，尤以中性晚幼粒細胞為多見，原粒細胞和早幼粒細胞

【骨髓象】①骨髓增生極度活躍；②粒細胞系顯著增生，原粒和早幼粒細胞

3、急性骨髓纖維化

急性骨髓纖維化臨床進展迅速，臟器浸潤輕，外周血常呈全血細胞減少，無淚滴狀紅細胞，但伴少量原始細胞；骨髓穿刺常呈干抽，骨髓象增生低下，可伴少量原始細胞。

【骨髓活檢】骨髓增生極度活躍，紅系前體細胞、粒系、巨核三系增生活躍；幼稚細胞簇狀及散在分布，幼稚紅細胞簇突出，巨核細胞較多，不同大小的均可見，核分葉少；大多數網狀纖維增生顯著，膠原纖維增生不明顯。

4、多毛細胞白血病

外周血及骨髓涂片染色見直徑10-15μm、胞漿 淡染有多毛狀突起的毛細胞。相差顯微鏡下多毛突起最明顯。外周血單核細胞減少(HCL 亞型時不減少)。骨穿常見干抽。骨髓活檢是金標準。

【骨髓活檢】毛細胞胞漿豐富、透明(HCL 亞型時嗜堿性)，核圓、橢圓，居中呈“煎蛋樣，多無核仁，有的核呈粗塊狀似成熟漿細胞胞核，有胞核似豆形核。根據毛細胞浸潤骨髓程度不同，可呈間質性、大片狀或彌漫均勻分布，胞漿豐富，胞核彼此間距寬而類似“鋪藥片”樣或“蜂窩”狀是其特征，在骨髓“血湖樣”改變不常見。粒、紅、巨核三系細胞隨毛細胞浸潤加重而減少，網狀纖維可增多。

5、冒煙型白血病

冒煙型白血病涂片檢測可為陰性，僅表現為骨髓活檢陽性。骨髓活檢：見體積大，有異型的成片的幼稚細胞。由于成片存在，極易誤診為轉移性腫瘤。這種早期白血病的診斷需要非常謹慎，必須結合相關特異性免疫標記，才可做出診斷。否則其診斷僅可作為參考，不能認為是最后診斷，更不能作為治療依據。

三、骨髓檢查的新進展：

1、骨髓活檢是用一種環鉆(trephine)切取骨髓作活組織檢查，可觀察骨髓完整的組織結構，真實反映骨髓局部的增生情況，發現局灶性壞死等。而抽吸取樣破壞了骨髓原來的結構并被血液稀釋，故骨髓活檢被認為是觀察骨髓各細胞系列比例和增生情況的金標準。

2、細胞免疫表型分析即細胞分化抗原簇(CD)分析。用各種熒光染料標記的抗CD單克隆抗體與流式細胞術結合，鑒定包括造血干細胞、各種淋巴細胞、髓系細胞、單核細胞、巨核細胞等的CD表型。目前在血液細胞學分析，特別是淋巴瘤和白血病分型方面應用越來越廣。

3、細胞遺傳學分析淋巴瘤，白血病、MDS等惡性血液病，往往有染色體異常。通過直接制片用熒光原位雜交(FISH)技術可以作細胞分裂間期的細胞遺傳學分析或通過短期培養，即可進行常規染色體鑒定，目前以FISH和常規染色體鑒定為基礎的細胞遺傳學已逐步發展為診斷淋巴瘤，白血病乃至多種實體腫瘤的常規診斷手段。

4、分子遺傳學分析從基因(DNA或RNA)水平研究和診斷血液系統疾病[2]，是當前熱點，例如由于9號和22號染色體易位t(9:22)形成的，在慢粒白血病常見的Ph染色體，以往多用染色體分析法鑒定，后來發現這種易位形成了一個新的融合基因bcr-abl，從而可用基因探針技術或PCR進行定性和定量分析。

5、直接查找微生物如黑熱病的利-杜體、弓形蟲等。近年來，由于臨床免疫抑制劑的大量使用和艾滋病的發生率增高，許多以往很少見的微生物如鳥分枝桿菌、組織胞漿菌(Histoplasma)等。這些病原微生物的檢測近來多利用包括分子生物學技術在內的先進實驗室檢驗技術進行，但也常可在骨碎片中找到。

隨著時展，骨髓檢查的內容愈加豐富，技術手段也越來越多。現代的骨髓檢查已從早期單純的細胞涂片發展到以細胞形態學和組織形態學為基礎結合細胞化學、免疫組織化學、流式細胞分析，細胞遺傳學和分子生物學、超微結構分析等諸多方面的綜合診斷學。常規的形態學檢查也逐步規范化。

參考文獻

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關鍵詞：卵巢癌；漿液性癌；免疫組織化學；基因表達卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，其病死率高居首位，上皮性卵巢癌是最常見的一種類型。由于缺乏有效的早期診斷方法，卵巢癌的五年存活率仍然較低，早期卵巢癌5年存活率可達75%以上，而晚期卵巢癌采用腫瘤細胞減滅術及化療患者的5年存活率僅15%~20%。近年來，人們不斷的對卵巢癌發生、發展機制進行研究。

1卵巢癌的分級

腫瘤的分級是評估腫瘤預后的重要指標。2002年，singer等[1]提出將卵巢漿液性癌分為高級別卵巢漿液性癌、低級別卵巢漿液性癌兩類。高級別的卵巢漿液性癌的前驅病變不清，發展迅速；低級別卵巢漿液性癌則逐步進展。美國德州大學M.D.安德森癌癥中心的兩級分化標準：以核分裂指數為主要標準，壞死細胞、多核巨細胞數量作為輔助標準，將漿液性卵巢癌分為二型，即低級別卵巢漿液性癌：核分裂指數≤12個/10HPF，存在微結構，不伴有壞死及多核巨細胞；高級別卵巢漿液性癌：核分裂指數>12個/10HPF，具有中度以上的非典型增生。兩種卵巢漿液性腺癌的臨床病理特征見表1。

既往研究發現，卵巢癌常用的免疫標志物有CA125、ER、PR、TK1、WT-1、P53、Survivin、Livin、維甲酸類化合物、CD24、CD44、CD133等，這些標志物與卵巢癌的發生、發展以及預測預后等方面有一定的關系[2]。按二級法分類發現，低級別漿液性癌與高級別漿液性癌存在表型與遺傳方面的差異。K-RAS、BRAF、ERBB2、p16基因在低級別卵巢漿液性癌組織中的陽性表達率高達68%，而在高級別卵巢漿液性癌組織中幾乎不表達[3]；近期有研究發現，PAX2、PAX8、P53在低級別卵巢漿液性癌和高級別卵巢漿液性癌組織中的陽性表達率也存在明顯差異。

2 PAX2、PAX8在低級別、高級別漿液性卵巢癌中的表達研究進展

PAX基因（核轉錄因子-Paired box gene）是對發育調控的基因家族，研究表明PAX基因表達的蛋白是一類重要的轉錄調控因子，他們在胚胎發育過程中對組織和器官的分化起著重要的調控作用。許多研究表明PAX基因改變會導致癌癥發生。PAX2是控制早期泌尿生殖器發育的重要因子，它的表達異常會導致多種相關的惡性腫瘤的發生，已有文獻報道PAX2過度表達會導致腎癌的發生，在腎母細胞瘤兒科腎癌和間充質細胞起源的腎癌均有PAX2表達不正常的上調；PAX8突變或失活就會引起甲狀腺濾泡癌或腺癌。

2.1 PAX2是PAX基因族的一亞型，PAX2編碼轉錄因子對泌尿生殖道、眼及中樞神經系統的發育起到關鍵作用。Tong等研究女性生殖系統中PAX2分布后發現PAX2在輸卵管內膜、子宮內膜，宮頸管內膜一級卵巢表面衍生的異位纖體中均有表達，但卵巢上皮及卵巢性索間質中則未見PAX2蛋白表達，據此認為PAX2蛋白是一種可用于鑒別組織起源的分子標志物，并認為PAX2蛋白陽性的卵巢漿液性癌（OSAC）很有可能源于輸卵管內皮。

2.2 PAX8也是核轉錄調節因子的配對盒子家族成員之一，是一種白。近來,轉錄因子PAX8被證明是一個敏感且相對特異的苗勒氏腫瘤的標記物。PAX8在甲狀腺，副中腎管，腎臟等組織中存在表達，但正常卵巢的上皮細胞不表達。PAX8在卵巢癌表現出高敏感性和相當的特異性，與WT1僅表達在漿液性卵巢癌有所不同，PAX8在卵巢內膜樣癌和透明細胞癌也呈陽性，但在粘液性卵巢癌中幾乎不表達。PAX8除了在甲狀腺和甲狀腺腺癌中呈陽性外，在乳腺以及其它非婦科的原發性腫瘤中幾乎無表達。這些特點奠定了PAX8在卵巢腫瘤中的應用。

2.3 p53基因是一種抑癌基因，定位于人類染色體17p13.1，編碼393個氨基酸組成的53kD的核內磷酸化蛋白，被稱為p53蛋白。p53基因是細胞生長周期中的負調節因子，與細胞周期的調控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡等重要的生物學功能有關。 P53分為野生型和突變型兩型，野生型P53基因為抑癌基因，而突變型P53基因則是癌基因。野生型p53能維持基因的穩定，參與細胞周期的調控，組織細胞從G1期進入S期，識別并修復損傷的DNA，誘導受損傷細胞凋亡。P53突變后，失誤了對細胞增殖的抑制作用，受損傷的衣長細胞不斷增殖，最終導致突變。而突變型p53不但無抑癌作用，還抑制野生型p53的活性，引起細胞的轉化。如若P53基因出現基因突變、等位基因的丟失、染色體重組等，可導致細胞進行過度的分裂從而促進了細胞的癌變[4]。有研究顯示，p53在卵巢癌組織中陽性率冥想高于癌旁正常組織且與組織學分級呈正相關，提示p53異常表達在腫瘤細胞的增殖和發展中起重要作用[5]。在卵巢上皮性腫瘤中，國內研究顯示，P53在上皮性卵巢癌細胞的表達部位為細胞核。上皮性卵巢癌P53陽性表達率為77%，交界性卵巢腫瘤陽性表達率為59%，而在正常卵巢中無表達，兩者間的差異有統計學意義。

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篇7

禽流感診斷技術

1病毒的分離培養

禽流感通常從人類感染者的結膜拭子、呼吸道樣品（如咽喉或鼻分泌物和沖洗物）中分離到，無菌采集病料，經處理后接種9～11日齡雞胚。因AIV的HA能使璃紅細胞發生凝集，可用血凝實驗作病毒的初步鑒定。若尿囊液為陰性則應繼續盲傳2～3代。對陽性尿囊液需先用新城疫（ND）抗血清做血凝抑制（HL）試驗，以排除ND感染。然后用免疫擴散等方法來檢測特異性核心抗原一核糖蛋白（NP）或基質蛋白（MP），再用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗鑒定A型流感病毒亞型。雞胚分離培養的特異性和敏感度均可以達到100%，但操作繁瑣，耗時較長，需要一周左右時間。

2瓊脂凝膠擴散試驗（AGP）

抗原抗體在瓊脂中由高濃度向低濃度自由擴散可以形成特異性肉眼可見的沉淀線。此法能用于檢測AIV共同抗原NP或MP。由于所有的AIV都具有型特異性共同抗原，用一種AIV的抗原或抗血清就可對所有AIV的抗體或抗原進行鑒定。1970年Beard首次將AGP用于禽流感抗體的檢測，此法雖然簡便易行，但敏感性差，有假陽性且不能區分動物血清抗體陽性是病毒感染所致還是注射的疫苗所產生的抗體。趙增連等發現在瓊脂板中加入3%的PEG6000，可提高AGP的敏感性，且快速省時。鄧國華等利用桿狀病毒表達禽流感病毒的重組白作為禽流感瓊擴抗原，其特異性和敏感性有較大提高，生物安全性更可靠和生產成本更低廉。但該實驗需要大量的抗原和抗體才出沉淀線，且需要至少24h才出結果，沒有HI實驗敏感、快速。

3血凝（IA）和血凝抑制（HI）試驗

AIV能夠與雞紅細胞發生凝集現象，即血凝實驗。這種紅細胞凝集現象又可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗。HA主要用于AIV的鑒定，HI主要是用已知單因子血清進行AIV的亞型鑒定，也可用來測定血清中的HI抗體滴度。該方法最早在1942年Hirst采用，后經改進并建立了標準操作程序。由于許多禽類血清中有非特異性血凝因子，導致假陽性出現，故通常在斌驗中首先用受體破壞酶或高碘酸鈉法去除非特異性抑制因子。有報道用馬血球替代標準HA中的雞或豬血球檢測禽流感H7，可提高敏感性達85%，特異性達100%。HA、HI特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費時，并且用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的AIV。

4病毒中和試驗（VNT）

VNT試驗是最特異的血清學方法之一，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應，特別是與吸附到宿主細胞上的癇毒表面抗原相對應，才能在實驗中取得滿意的顯示效果。因此，某一個血清型的中和試驗抗體只與同組內的其他病原表現出有限的交叉反應。該實驗還具有高度的敏感性，Thoms等建立的用于AIV H5N1檢測的微量中和斌驗的敏感性要高于HI試驗，如同時結合運用H5型特異的westernblotting）試驗，其敏感性可達80%，特異性達96%。VNT操作繁瑣，費時間，耗材料，故在實際臨床診斷中不常使用。但作為經典方法在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的檢測方法都要以此作為標準進行比較。

5免疫熒光技術（IFA）

IFA是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。最早用于流感病毒是鑒定和定位病毒感染細胞異性的抗原、白（NP）或基質蛋白（MP）抗原。用NP抗原的熒光抗體染色，主要出現核內熒光；用MP抗原的熒光抗體染色主要出現胞質熒光，核內也可出現部分熒光。1984年賓夕法尼亞州暴發禽流感時，Skeeles將IFA首次用于AIV的檢測，其敏感性相當于病毒分離。現有一種微球免疫法（microsphere immunoassay，MIA）將重組NP結合于Luminex（聚苯乙烯微球）上檢測禽流感，敏感性高達99.13%。秦愛建等研制的抗禽流感H5和H9亞型病毒的單克隆抗體，通過免疫熒光技術檢測AIV，24h內檢測出病毒的最小感染量為10個TCID50孔。IFA具有特異性強、敏感性好、簡便快速的優點，但非特異性染色問題尚未解決、結果判定的客觀性不足、技術程序比較復雜。

6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

它是20世紀70年代在熒光抗體和組織化學基礎上發展起來的一種新的免疫測定技術，是在不影響酶活性和免疫球蛋白分子的條件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共價結合成酶標記抗體。酶標記抗體可直接或間接通過免疫橋與包被在固相支持物上待測定的抗原或抗體特異性結合，從而特異的定性、定量檢測病毒的存在。由于標記酶酶促反應的放大作用，其靈敏度比常規血清學檢測要靈敏得多，尤其適合大批量的血清學調查。酶聯免疫吸附試驗具有較高的敏感性，既可以檢測抗體，又可以檢測抗原，可以標準化，且結果易于分析，在流感的控制、撲滅、檢疫中很有用途。目前由于AIV全病毒作為包被抗原建立的ELISA方法存在生物安全性問題，應用AIV型特異性蛋白及其單抗建立ELISA方法成為了研究的熱點。

7反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

RT-PCR技術是指提取AIV總RNA，再加反轉錄酶合成cDNA，進行PCR擴增后，直接檢查AIV基因。如果檢測出了相應的擴增帶則判為陽性反應；反之，無擴增帶則為陰性反應。用于AIV檢測的早期報道是在1986年Perdue等在接種雞胚的尿囊液中檢測AIV。近幾年隨著分子生物學的深入發展，用于AIV檢測的RT-PCR方法不斷得到改進和報道。2007年韓雪清等，根據禽流感病毒H1、H3、H5亞型的HA基因和N2亞型NA基因的保守序列，設計出四對RT-PCR引物，建立一步法多重RT-PCR，能夠特異、敏感地對禽流感Hl、H3、H5、N2四亞型進行快速檢測，且與禽流感其它亞型和NDV、IBV、ARV和IBDV的核酸均無交叉反應。同年張鶴曉等。進一步研制開發H5/H7和H5/N1多重熒光PCR技術，實現了在一次反應中對樣本里的病毒進行快速定型，此法檢測H5和H7的敏感性分別為10-6和10-5，而且與禽類其他常見病毒和禽流感病毒其他亞型未發現交叉反應。因此該檢測方法將在大量檢測H5和H7亞型禽流感病毒的混合感染方面，大大提高檢測效率，節約檢測成本。

篇8

關鍵詞：牛；抗病基因 研究進展

中圖分類號：S823 文獻標識碼：A 文章編號：1674-0432（2013）-04-0282-2

0 前言

動物可能對一些傳染性疾病存在完全或部分的抗性，即抗病性。抗病性大多是由遺傳因素來決定和控制的，動物自身的遺傳性狀決定著疾病的發病率。[1]抗病基因是動物抗病性的遺傳基礎，它是在外來因素的刺激下能夠抵抗疾病入侵、能使動物體內產生抗體，即動物對疾病產生抗性的基因。抗病基因按照效應大小分為三類：第一是單一主基因，這種基因的功能主要是控制抗性狀的表達；第二是微效多基因，這種基因控制的抗病能力是由多個基因共同完成的；第三是獨立的多基因，一般抗病能力多受到獨立的多基因控制，而特殊抗病能力主要受到單個主基因位點的控制。[2]

雖然預防接種在動物疾病控制方面起到了重要的防治作用，但仍未能完全遏制傳染病的流行。當前可以利用分子生物學技術，進而找尋抗病基因進行抗病育種，從根本上改變動物的遺傳性狀，已成為控制和減少一些疾病發生的有效途徑。而利用分子遺傳學方法，采用基因圖譜和數量性狀位點掃描技術尋找與抗病力相關的基因，進行間接選擇也日漸成為了新的方法。[3]目前，已經發現的在牛體內與免疫相關的抗病候選基因數量逐漸增多，主要有主要組織相容性復合物（MHC），天然抗性巨噬結合蛋白1（NRAMP1），甘露糖結合凝集素（MBL），Toll樣受體基因（TLR），干擾素（IFN）等，這些抗病候選基因有望成為動物抗病育種的新靶點。

1 主要的抗病候選基因

1.1 天然抗性巨噬結合蛋白1（NRAMP1）

NRAMP1基因是一個比較保守的基因，主要存在于吞噬細胞，嗜中性粒細胞以及外周血液細胞中，為特異性表達，會影響動物自身的固有免疫，所以是綜合抗病能力較好的候選基因。NRAMP1基因最初在小鼠體內發現，是在網狀內皮細胞中的巨噬細胞表達。NRAMP1基因的存在可以抵抗多種細胞內病原微生物的入侵，發揮著重要的免疫功能。[4]通過把小鼠的基因敲除發現，NRAMP1基因與一些細胞內菌，病原微生物菌，例如分枝桿菌中的結核分枝桿菌、沙門桿菌、利什曼菌等的抗性和易感性有關。牛的NRAMP1基因位于第2號染色體上，研究表明其對牛布魯氏病、乳腺炎等疾病有抵抗作用。對NRAMP1基因功能的研究表明可能是通過消耗含有胞內病原微生物吞噬體中的二價金屬離子，使病原微生物缺乏繁殖必需的金屬離子而達到抵抗胞內病原微生物的作用[5]，但具體的作用機制目前尚不清楚。Ciro Estrada-Chavez，Ana L. Pereira-Suarez[6]等人發現在人體中，NRAMP1基因已被確定與結核易感性有關。

1.2 主要組織相容性復合物（MHC）

MHC是由連接緊密的多態性基因組成的，是一個與抗病性和免疫應答有著緊密相關性的基因家族，在免疫反應中對細菌、病毒、寄生蟲等的控制和清除起著重要的作用。目前已經證實MHC與多種疾病間存在著密切的聯系，牛的MHC物位于第23號染色體上，1978年牛的MHC基因得到了首次報道，命名為BoLA基因。有關BoLA基因和疾病的報道很多，Gilliespie，Sharif等人研究出BoLA-DRB3第2外顯子與奶牛炎的高發病率有顯著相關性。Wei Lei，Qinglong Liang等人研究了牛BoLA-DRB3基因和皖北FMDV與牛口蹄疫易感性之間的關聯，采用BOLA-DRB3基因擴增的半巢式聚合酶鏈反應，分析基因頻率和基因型頻率在健康和感染口蹄疫牛之間的差異，發現等位基因Hae III A在皖北牛中與口蹄疫易感性顯著相關，而Hae III C則對口蹄疫病毒具有很強的保護作用。[8]牛的BoLA基因與腸道寄生蟲病、高酮癥的易感性相關，牛的白血病與BoLA-AW16相關，牛的慢性后脊椎輕癱與BoLA-A8相關，牛眼癌與W6相關，W14單倍型與牛結核病易感性相關。

1.3 Toll樣受體基因（TLR）

TLR基因是一類普遍存在于哺乳動物中已經被鑒定出來的跨膜蛋白家族，主要存在于巨噬細胞、樹突狀細胞中，Toll樣受體的作用是作為膜受體來識別侵襲機體的病原體含有的保守蛋白，還起著傳遞識別信號，激活核轉錄因子，轉錄相應的效應分子以及影響機體天然免疫等作用。[9]自從2006年牛的TLR基因mRNA序列在GenBank上公布，對TLR基因家族和牛疾病之間的相關性研究便迅速增多。Colleen A. Fisher， Eric K. Bhattarai[10]等人運用自定義下一代測序方法以及等位基因分型檢測方法對牛的10個TLR基因變體的280雙等位基因進行SNP檢測和驗證。采用驗證牛TLR識別細菌配體基因的病例對照研究發現有6個SNP位點可能與結核分枝桿菌的易感性和奶牛感染副結核病的易感性相關。還有研究認為，TLR基因可能與牛呼吸性疾病、腸道性感染疾病、牛炎、口蹄疫病毒感染疾病、敗血病及子宮內膜炎等。

1.4 甘露糖結合凝集素（MBL）

MBL基因是人體和動物體內重要的天然抗感染免疫分子，是由肝臟合成后分泌到血液中的，在抗原抗體發生特異性免疫反應前，其可以誘導并激活機體的固有免疫反應。MBL基因與免疫調節、補體活化的介導等生物學效應有著緊密的關聯，同時又是臨床上介導多種疾病發生的基礎結構，MBL基因在防御病原微生物侵襲的天然免疫中起著抗感染分子的作用。[11]研究發現MBL基因的多態性和免疫缺陷性疾病、病毒性疾病、類風濕性關節炎、細菌性疾病、真菌性疾病以及寄生蟲性疾病等均有相關性。根據Gen Bank的數據，牛具有MBL1與MBL2兩種基因，Andersen等人通過親和層析法從牛的血清中得到了純化的MBL基因。Kawai等人采用編碼人MBL基因的膠原區、頸區及糖識別區域探針的方法，從牛肝cDNA文庫中篩選編碼牛MBL基因的cDNA克隆，同時從牛血清中分離得到了MBL基因。Capparelli R[12]等人研究發現MBL基因多態性與水牛抗布魯桿菌病的能力密切相關，其作用機理為MBL基因突變導致甘露糖結合凝集素血清水平下降，影響了正常的免疫功能。Liu J， Ju Z， Li Q等人選擇了MBL基因啟動子區域的三個新SNP位點和兩個已報道的MBL1基因外顯子2的位點進行檢測，采用PCR單鏈構象技術在中國奶牛的三個不同品種中進行性多態性分析，分析其基因型和單倍型頻率，血清MBL-A的水平，補體活性等，結果表明MBL1基因與抗奶牛乳腺炎存在相關性。[13]

1.5 干擾素基因（IFN）

由于IFN具有抑制腫瘤細胞生長、抵抗病毒感染及調節機體免疫功能的作用，因此成為病毒學、遺傳學、免疫學、以及分子生物學比較活躍的研究領域。IFN-γ在調節機體免疫系統功能、增加巨噬細胞殺菌力、影響細胞的增殖與凋亡等方面具有重要的研究意義，其主要是通過刺激或抑制相應的基因發揮作用。[14]孫仰峰等人2008年對牛IFN-α基因高效表達及純化進行了研究。[15]張永紅等人研究魯西黃牛BoIFN-α基因，并獲得了具有較高抗病毒活性的重組干擾素產物。[16]蔡進忠從我國環湖型牦牛和野牦牛基因組DNA中克隆了α干擾素基因，重組后的BoIFN-α基因對牛傳染性鼻氣管炎病毒具有一定的抑制作用。[17]Sweeney RW， Jones DE等人選取5只未受感染的成年荷斯坦奶牛，7只自然感染結核分枝桿菌的成年荷斯坦奶牛，屠宰時從每只牛體內取回腸和盲腸的淋巴結樣品，運用逆轉錄-聚合酶鏈反應法測定IFN-γ和白細胞介素4在每個樣品mRNA表達量。結果感染結核的牛IFN-γ基因的表達量顯著高于未感染牛，因此，IFN -γ的表達量增加，可能會增強牛的抗感染性。[18]

2 抗病基因應用于動物抗病育種時可能存在的問題與前景展望

2.1 存在的問題

動物抗病能力的遺傳機制很復雜，還有環境的影響也很大。病原微生物的遺傳特性與宿主動物的關系也很復雜，同時對抗病性和易感性指標的測定也沒有統一的規定，而且還缺乏用于選擇的可靠性標記。研究表明抗病性性狀是由微效多種基因所控制的，但基因之間還會存在相互的作用，單純的使用某種標記輔助選擇達不到全面性效果，基因工程育種雖然有很強的針對性，但成功率卻極低，而且需要的花費也相當巨大，很難實現大規模的操作。[19]因此，單獨應用某一種抗病育種技術都會呈現出很多方面的局限性，還有抗病性與生產性狀之間存在著負相關作用，不同的疾病間也會存在拮抗作用，目前除了一些已知的疾病外，大多數疾病在抗性選擇方面可以參考的數據還很少，抗病機理也不是很明確和清楚，這些問題也同樣在制約和阻礙著抗病育種的發展和應用。

2.2 前景展望

抗病育種并不是育種的最終目的，還需要與動物的生產性能、疾病的生理學特征、流行病學、免疫機制等多方面的綜合因素相結合考慮，才能產生最適合經濟需要的效果。在目前畜牧業抗病育種的方法中，應當充分將常規的表型選擇和標記型的輔助選擇有效的結合起來，讓兩者的優勢得到互補，有效的提高家畜機體的一般抗病能力和特殊抗病能力。[20]對此，應該將分子學技術與抗病基因結合，開展動物基因組的基礎研究工作，采用現代生物學技術和轉基因工程技術系統地對基因的結構和功能進行全面性的研究。隨著抗病基因作用機制研究不斷的深入，抗病育種進展緩慢的局面將會得到逐漸的改善，綜合性抗病育種研究將對我國畜牧業發展產生巨大的推動力。

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篇9

關鍵詞 噪鹛屬；藍冠噪鹛；研究現狀

中圖分類號 Q958 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）03-0294-02

Abstract The blue-crowned laughingthrush（Garrulax courtoisi）is a critically endangered bird and its wild population is now known only could be found in Wuyuan，SE China.The blue-crowned laughingthrush is considered to be yellow-throated laughingthrush south China subspecies，after upgraded to separate species.At present，the part of the zoo in Europe and the United States have captive population，in the domestic，Hong Kong Ocean Park and Nanchang Zoo have captive population，synthesize domestic and international research experience of captive population and research situation of wild condition，refer to the literature，from the study on blue crowned laughingthrush and blue crowned laughingthrush congeneric species，the current situation of the development trend on the blue crowned laughingthrush research study was comprehensive reviewed.At present，laughingthrush research of the birds is already relatively deep，in macro and micro research，and analysis was comprehensive，the blue crowned laughingthrush studies only stay in the study habitat，it isn′t related to reproductive ecology and micro research.

Key words laughingthrush；bule crowned laughingthrush；research status

1 研究目的和意義

藍冠噪鹛（Garrulax courtoisi）屬雀形目畫眉科噪鹛屬，為中國特有物種，分布于江西婺源一帶，極度瀕危。迄今已知的野生種群僅現于江西婺源。基于傳統的形態學、聲學、動物地理學等分類方法，藍冠噪鹛曾經被視為黃喉噪鹛華南亞種（Garrulax galbanus courtoisi），后升格為獨立種，何芬奇將其更名為“靛冠噪鹛”[1]，而目前鳥類學界比較通用的中文名為“藍冠噪鹛”。

20世紀80年代，由于國際與國內對野生動物貿易立法的缺失，中國有大量藍冠噪鹛經由香港被販賣到歐洲和北美。目前在一些歐美動物園以及香港海洋公園其人工飼養歷史已超過20年，全球圈養持有的數量超過200只，接近野外種群數量，但是總體上面臨近親及老齡化，加上球蟲的困擾、雛鳥成活率低等問題，前景不容樂觀[2]。2007年黃喉噪鹛被列入世界急危物種名錄，列入《世界自然保護聯盟》（IUCN）國際鳥類紅皮書。

2 研究綜述

2.1 鹛類及噪鹛屬鳥類的分類

鹛類主要分布在歐亞大陸東部、南部以及非洲，由于其形態及生態習性多樣，一直以來分類方式較為混亂。其中分布于中國的鹛類共計142種，占世界鹛類記錄總數284種的50%，中國因此而被稱為鹛類王國。相關研究學者對于中國分布的鹛類的分類同樣存在許多不同觀點，有代表性的大致有3類[3]。第1類的代表學者為Cheng和鄭作新，其將鹛類分類為l科、畫眉亞科，并認為包含了所有的鹛類、鴉雀類以及山鹛屬；第2類的代表學者為Mickinnon和Phillipps，其將鹛類分類為鶯科 、噪鹛亞科、鶯亞科 、族鹛，并將山鹛屬并入扇尾鶯科，噪鹛屬和P鹛屬歸入噪鹛亞科，棕胸鴉鹛屬并入幽鹛屬，與鴉雀類等同歸鹛族；第3類的代表學者為鄭光美，其將鹛類分類為畫眉科，并將文須雀屬、紅嘴鴉雀屬、鴉雀屬合為鴉雀科，山雀屬并入扇尾鶯科，白腹鳳鹛單立為畫眉科下一屬。

我國分布有38種噪鹛屬的鳥類，占世界分布噪鹛屬種類的70%以上，其中7種為我國特有種。Cibois基于線粒體基因的聯合分析指出，噪鹛屬的單系性被Bootstrap Probability test、Shimodaira-Hasegawa test以及Swoford-Olsen-Waddel1-HiUis test 3種檢驗所拒絕，建議做進一步分析驗證。Luo 等在基于Cyt b和RAG-1聯合分析構建的畫眉科鳥類系統發育樹中，也否定了噪鹛屬的單系性，其中斑背噪鹛（Garrulax lunutus）、灰翅噪鹛（Garrulax cineraceus）、山噪鹛（Garrulax davadi）、白喉噪鹛（Garrulax albogularis）、棕噪鹛（Garrulax poecilorhynchus）、黑臉噪鹛（Garrulax perspicillatus）、白頰噪鹛（Garrulax sannio）（7種）屬于噪鹛類Ⅰ，黑頂噪鹛（Garrulax affinis）、橙翅噪鹛（Garrulax elliotii）、赤尾噪鹛（Garrulax milnei）、紅頭噪鹛（Garrulax erythrocephalus）、紅翅噪鹛（Garrulax formosus）（5種）屬于噪鹛類Ⅱ，并且2支噪鹛與麗鹛之間的關系也沒有得到解決[4]。

2.2 DNA測序技術在鳥類系統發育研究中的應用

傳統的鳥類系統學研究以形態學為主，研究爭議較多。近年來逐漸開始利用鳥類鳴聲進行鳥類系統學研究。同時利用分子遺傳學理論與技術進行鳥類系統學問題研究是未來的發展趨勢。線粒體DNA是分子系統發育學研究重要的分子標記，具有易分離、進化速度快、母系遺傳、缺乏重組和無內含子等特點。Cibois基于線粒體Cytochrome b、12s和16s 3個基因構建了畫眉科的系統發育樹，對于畫眉科鳥類系統發育重建工作意義顯著[5]。由于當研究類群的分歧大于10%時，線粒體控制區、ND2以及細胞色素b基因都可能出現替代飽和，因此在科級水平上研究高級分類階元的系統發育關系時不能僅依靠線粒體基因的序列信息[6]。

與此同時，越來越多的學者建議在重建系統發育關系時增加核基因作為分子標記。Irestedt 等通過線粒體基因cytb和核基因c-myc、RAG-1和myoglobin分析探討了亞鳴禽中的系統發育關系；Lee等運用線粒體的3個基因（16s rRNA、tRNA-Leu和nad1）研究了全球的鵲屬內部的系統發育關系；Slikas等通過線粒體的2個基因（cox2基因、atp8基因）序列分析研究了繡眼鳥屬內部物種之間的系統發育關系；Yuri等采用線粒體基因12S rRNA、nad2、atp8、atp6、部分cox2以及6個tRNA基因探討了燕雀科的系統發育關系[7]；Zuccon 等通過線粒體基因nad2和2個核基因RAG-1和myoglobin分析了椋鳥科的系統發育關系并探討了椋鳥科在l總科中的位置，2008年又通過3個核基因標記（myoglobin的內含子2，ODC的內含子6和7，以及GAPDH的內含子11）聯合線粒體基因nad2和cox2探討了椋鳥科中的椋鳥屬、八哥屬、長冠八哥屬、肉垂椋鳥屬和Fregilupus屬之間的系統發育關系[8]。

2.3 藍冠噪鹛行為學研究

2.3.1 噪鹛屬鳥類的行為學研究。噪鹛屬鳥類的行為學研究對藍冠噪鹛行為學研究具有一定的參考意義，鳥類行為的研究主要是從其行為節律分布情況，各種行為譜在整個行為中占有的比重，進一步又將行為分為繁殖期行為和非繁殖期行為。

噪鹛屬鳥類行為的研究國內外都比較常見，其行為學研究也得出了一定的結論。朱 峰等在四川省南充市市郊觀察了白頰噪鹛（Garrulax sannio）的繁殖行為。結果顯示，白頰噪鹛的營巢成功率為73.3%，影響其巢址選擇的主要因素依次為巢位及巢的穩固因素、隱蔽因素、食物因素；孵化期親鳥的離巢時間隨著孵化天數的增加而減少，離巢次數隨著孵化天數的增加而增加；育雛期親鳥喂食頻次隨著雛鳥日齡增加而增加，在7：01―10：00和17：01―19：00時喂食頻次最高，在6：30―7：00和10：01―14：00時最低[9]。

柴璐艷等對四川大學望江校區白頰噪鹛（Garrulax sannio）在非繁殖季節時的行為節律及時間分配進行觀察和研究。結果表明：白頰噪鹛在非繁殖季節集5～14只的群體，6～8只最多（58.82%），在日出前（25.69±8.17）min蘇醒開始活動，日落后（40.23±4.16）min進入樹上夜棲；在行為節律上，白頰噪鹛的覓食、運動、警戒、保養、社會行為等5種行為均具有極顯著的節律性變化；時間分配方面，白頰噪鹛的覓食時間占52.04%±6.10%，運動時間占13.43%±1.84%，保養時間占13.11%±3.00%[10]。

柯坫華等分析研究了江西省吉安市境內的黑臉噪鹛家族群的夏季分布格局。研究發現，黑臉噪鹛主要分布在市郊疏林灌叢環境，而在城市居民區未見分布。同時測量了家族群相互之間的最近距離，其家族群之間的最小距離平均為600 m，最小的家族群間距為230 m[11]。

吳麗榮在山西蘆芽山國家級自然保護區對山噪鹛的生態進行了觀察。結果表明：該鳥多在山地疏林灌叢間棲息，在本區種群遇見率為2.35只/km。巢多筑在陽坡灌木、小喬木橫枝上，每窩產卵3～5枚，卵由雌鳥孵化，孵化期13～14 d，孵化率為97.44%，巢內育雛12～13 d[12]。

2.3.2 野生藍冠噪鹛行為學研究。由于藍冠噪鹛地理分布及數量稀少的原因，對其野外行為觀察有一定的局限性，目前對野生狀態下藍冠噪鹛行為研究的文章數量有限。劉智勇等進行了江西省婺源縣黃喉噪鹛調查初報，其深入婺源縣兵林營自然保護小區，對分布的60余只黃喉噪鹛繁殖群體進行觀察。首次記錄了自然生境、鳥巢、鳴聲、活動與覓食等[13]。洪元華等對黃喉噪鹛華南亞種（Garrulax galbanus courtoisi）4個繁殖地開展了生境調查，并對其繁殖期的活動情況地進行了比較分析。結果表明：黃喉噪鹛華南亞種對天然常綠闊葉林適應性很強，應著手保護天然常綠闊葉林，以維護黃喉噪鹛的自然生境[14]。廖為明等通過研究婺源黃喉噪鹛華南亞種的分布種群、繁殖生態，并分析其棲息地的植物物種，揭示該鳥類與村落環境的依賴關系，對于維持生態平衡意義顯著[15]。

2.3.3 人工種群藍冠噪鹛行為學研究。由于歷史的原因，2010年之前人工飼養的藍冠噪鹛只存在于香港及歐美地區的動物園或鳥類公園，對其圈養環境下的研究多集中于一般的日常管理。雖然這些機構飼養藍冠噪鹛逾20年，但是一直以來雛鳥第1年的成活率都不足50%，除了疾病和近親繁殖等因素外，人們還試圖研究親鳥的育雛行為與環境、種群等的內在關系。Anais Tritto研究了法國牟羅茲動物園4個靛冠噪鹛的繁殖行為，以此分析可能導致雛鳥過早死亡的原因。最初員工提出的假設是親鳥未能擔負起育雛的責任，但研究顯示事實并非如此，而與之有關可能包括喂食的頻率、營養，或者也可能存在的病原體[16]。此外改善飼養環境，如植被的疏密、高低等，不僅會影響親鳥的一般日常行為，同時也可能有利于繁殖季節里的配對行為的正常表達，而地面的墊料以及是否提供巢材都會影響親鳥的筑巢行為。

3 結語

目前雖然國際鳥類保護聯盟已經將藍冠噪鹛列入世界急危物種名錄，但我國尚未將這一瀕危物種明確保護級別，所以加強對藍冠噪鹛的研究已經迫在眉睫，對藍冠噪鹛的研究包括棲息地的研究、行為學的研究、遺傳基因等多方位的研究，只有深入的研究才能了解其瀕危的根源所在，因此才為藍冠噪鹛的保護提供理論和實踐基礎。

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篇10

【關鍵詞】 IgA腎病； 原發性腎小球疾病； 中醫藥治療

中圖分類號 R692 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2014）26-0161-03

IgA腎病是大量免疫復合物沉積在腎小球系膜區的一種原發性腎小球疾病，臨床上以血尿和或蛋白尿為主要表現，是我國最常見的原發性腎小球疾病。西醫學在發病機理和診斷方面有較深研究，治療方面尚無特效藥物，中醫藥在IgA腎病治療的研究較多，且療效確切，顯示出一定優勢，現將中醫藥治療IgA腎病的近況以綜述形式闡述。

1 病因病機

王珍等[1]認為，IgA腎病以正虛為本，氣陰兩虛乃為其最常見證型。邪實為標，邪實之中又以風熱、濕熱、瘀血等為常見，演變過程中往往虛、實、邪夾雜。并常夾有上焦風熱或痰熱，中、下焦濕熱。病久氣血運行不暢，致血脈瘀阻滯。瘀血阻滯脈絡可使血不歸經，溢于脈外；或瘀血蘊久化熱，使熱毒更盛，迫血妄行；或瘀血阻滯氣機，導致臟腑功能失調，失于疏泄固攝，均可進一步加重血尿，從而使病程纏綿難愈。縱觀IgA腎病的發生和發展，先天稟賦不足、氣陰兩虛是本病發生的始動因素，而濕、熱、毒、瘀諸邪不但參與疾病的發生，更是導致病情轉變的主要病理因素。曾莉等[2]認為IgA腎病病機多熱在下焦。熱有虛實之分。實熱多因感染外邪，上犯咽喉，腎絡與咽相通，故傷腎絡而尿血。虛熱則內因素體陰虛，外復感熱邪，灼傷陰津，導致腎陰不足，虛火灼傷腎絡而尿血。脾腎氣虛、久病入絡、氣滯血瘀亦可導致血尿。范軍芬等[3]認為根據疾病的發生發展過程，本病屬本虛標實、虛實夾雜之證。本虛有氣血陰陽虧虛及臟腑虛損；標實主要為濕、熱、瘀等，標實是導致疾病惡化的主要病理因素。病位涉及肺、腎、脾、肝，腎是本病中心所在。有學者以《黃帝內經》“病久入深，營衛之行澀，經絡時疏故不通”及葉天士“久病入絡”為理論指導；以病程長、反復發作，舌暗脈澀為辨證依據；提出“腎絡瘀阻”病機學說，認為“腎絡淤阻”是慢性腎臟疾病的中醫發病機制，“腎絡瘀阻”為貫穿 IgA 腎病始終的基本病機[4-6]。周迎晨等[7]認為，IgA腎病的病位在腎，但臨床的疾病發生、發展常與肺、脾、腎三臟的功能狀態有關。

2 分型辨證論治

王珍等[1]治療IgA腎病分急慢兩型。急性期急性期，多為風熱壅盛、迫血下行證，常在外感病后出現。外感咳嗽發熱后，治療以疏散風熱、解毒利咽、涼血止血為主，常選用銀翹散與小薊飲子化裁。下焦濕熱型治以清熱利濕、助運化濕、涼血止血為主，方用八正散合小薊飲子加減。慢性期宜分型辨證論治，多分為肺（脾）腎氣虛證、脾腎陽虛證、肝腎陰虛證、氣陰兩虛證四證。肺（脾）腎氣虛證以玉屏風散合四君子湯加減；脾腎陽虛證以右歸丸加減；肝腎陰虛證以知柏地黃丸合二至丸加減；氣陰兩虛證以參苓白術散加六味地黃丸加減。慢性遷延期以氣陰兩虛多見，采用滋補腎陰、補益脾氣為主要治法，常用藥為黃芪、太子參、白術、茯苓、陳皮、山藥、生地、玄參、薏苡仁、白扁豆，并依據患者氣虛或陰虛的偏重隨癥加減。余秉治常謂：慢性腎炎病在腎、治在脾，強調調理后天脾胃的重要性，補氣健脾法貫穿治療始終。

洪欽國治療IgA腎病采用辨病、辯證和辨證相結合，將IgA腎病分為急性發作期和慢性進展期處理。急性發作期偏于邪實，治以祛邪為主；慢性進展期偏于正虛，治以扶正為主。急性發作期分為風熱擾腎型、下焦濕熱型；慢性進展期分為氣虛不攝型、氣陰兩虛型、陰虛內熱型。風熱擾腎型，治以疏風清熱，利咽止血。方用銀翹散合滋陰養咽藥，加入玄參、生地黃、沙參等。下焦濕熱型治以清熱瀉火，涼血止血。方用小薊飲子加減。氣虛不攝型治以補氣攝血。方用補中益氣湯或歸脾湯加減。氣陰兩虛型治須益氣養陰止血。選用生脈飲加減。陰虛內熱型宜滋陰降火，涼血止血。方用知柏地黃湯合二至丸加減。血尿者加用大薊、小薊、白茅根、側柏葉、茜草、地榆等清利止血；蛋白尿者加用芡實、金櫻子、蓮肉、蓮須、桑螵蛸等補腎固澀；慢性咽炎者配合玄麥甘桔湯；易感冒者配合玉屏風散。弱病情綿長，久病入絡，血尿經久不愈，常選用活血止血法，常用益母草、澤蘭、三七粉、丹參、當歸、蒲黃、茜草、馬鞭草等。張麗等[8]認為IgA腎病，在發作前多因外感邪毒，而發呼吸道或皮膚感染，病在上焦，治宜疏風清熱，利咽解毒，涼血止血。方用銀翹散、小薊飲子加減。急性發作期以清熱利濕解毒為基本原則，旨在清解上、中、下三焦的濕熱毒邪，控制炎癥反應，達到截流澄源的目的。常選用大柴胡湯、八正散等為主方，臨床隨癥加減。若毒傷腎絡，久病入絡，臟腑虛損，氣機失調，血脈不利，壅滯成瘀。多以補腎活血與止血藥物并用，不能一味止血。病久亦郁，肝主疏泄，調暢一身氣機，為三焦氣機之樞道，病久濕熱淤血等標實之證形成。治宜疏利三焦氣機，得氣血津液運行正常。常以柴玉平肝湯加減，多選用柴胡、陳皮、白芍、川芎、梔子、枳殼、瞿麥等，每每疏肝利膽，調暢三焦氣機。

3 專方專用

歐嬌英等[9]用滋陰益腎方治療IgA腎病。滋陰益腎方（女貞子12g，墨旱蓮12 g，麥冬12 g，黃芪30 g，白術12 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，積雪草30 g，鹿銜草20 g，六月雪30 g，白花蛇舌草30 g，白茅根15 g）隨癥加減1個月為1個療程，連續服用2個療程。與單純的尿激酶法進行對比。結果表明滋陰益腎方是治療IgA腎病的有效措施，與單純的尿激酶相比該方法具有明顯改善IgA腎病患者的臨床癥狀，減少IgA腎病的蛋白尿和血尿，延緩疾病的進展和縮短病程，也有預防IgA腎病復發的作用，無明顯的不良反應。趙志新等[10]用常規治療合五子固腎湯為治療組（協定方藥物組成：黃芪30 g，太子參15 g，枸杞子15 g，菟絲子15 g，五味子9 g，車前子15 g，覆盆子20 g，石韋10 g），對蛋白尿嚴重者，加芡實20 g，益智仁30 g腎功能異常者，加大黃15 g；水腫者，加澤蘭30 g，茯苓15 g。每日1劑，每次150～200 ml，每日2次，8周為1個療程。對照組常規治療，結果發現治療組療效顯著（P

4 中成藥治療

楊柳等[13]將鹽酸貝那普利、雙嘧達莫為基礎治療治療。在此基礎上，治療組加用黃葵膠囊治療。治療組患者治療12周后24 h尿蛋白定量、尿RBP及尿β2-MG水平與對照組比較差異均有統計學意義（P0.05）。黃葵膠囊可以減少IgA腎病濕熱證患者的尿蛋白，其療效與福辛普利相似。蔣易容等[15]利用計算機檢索關于黃葵膠囊治療IgA腎病的試驗，進行Meta分析。結果顯示：黃葵膠囊在減少IgA腎病患者尿蛋白，提高IgA腎病療效方面優于對照組，但在改善腎功能、改善血尿、降血脂等方面與對照組差異無統計學意義。無研究報道治療期間不良反應。說明黃葵膠囊可減少IgA腎病患者的尿蛋白，提高IgA腎病療效確切，但其安全性有待進一步研究。張永秀等[16]將102例患者隨機分為A組（纈沙坦組80 mg，1次/d）和B組（金水寶4粒，3次/d與纈沙坦聯合治療組80 mg，1 次/d），觀察12周，A、B兩組治療前后尿蛋白變化，每組均較治療前存在顯著性的降低。治療后B組下降的幅度較A組更明顯（P

5 最新進展

隨著分子生物學、分子遺傳學技術的發展和人類基因組計劃的完成，認為IgA腎病是一種多基因、多因素復雜性狀的疾病，遺傳因素在IgA腎病的發病機制中起重要作用。陳香美、Lim等研究提示IgA腎病發生與Megsin基因遺傳變異有關[17-19]。masutani等[20]研究認為IL-4基因多態性可以影響IgA腎病的易感性和疾病發展進程。

隨著腎活檢的廣泛經行，中醫學者發現IgA腎病的中醫證型與IgA腎病的病理有一定關系。陳香美等[21]研究發現IgA腎病的中醫分型與IgA腎病病理分級及病變程度有相關性且通過中醫辨證分型可推測腎臟病理改變程度，即IgA腎病臨床與病理加重的過程在一定程度上反映了中醫證型的演變過程，即脾（肺）腎氣虛氣陰兩虛肝腎陰虛脾腎陽虛。

綜上所述，中醫藥聯合西藥治療IgA腎病臨床療效優于單純西醫治療，且方法不拘一格，可依據各醫家的辯證論治、分期論證靈活用藥。目前中醫對于IgA腎病的病因、病理等方面的研究明顯落后于西醫。中醫所提出的辨證分型多是各醫家在自己的經驗上進行的，用藥也是根據經驗用藥加減，沒有統一的辯證標準，雖臨床療效顯著，但是客觀性不夠，導致祖國醫學走出國門困難重重，對祖國醫學的長遠發展不利。目前應利用現代技術，如蛋白質組學技術、建立動物模型等研究方法來深入研究中醫的分期分型與現代醫學的關系，建立統一的辯證標準。

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