導語：如何才能寫好一篇基因檢測，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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社會熱詞

如今，“基因檢測”成為一個社會熱詞，一些商業機構打出頗具誘惑性的廣告語：“解碼生命秘密，預知未來健康”、“只要你的一滴血，甚至一點點口水，就可能預測你一生可能遭遇的疾病并加以預防……”“一口唾液，就能測出孩子的天賦。如果他有運動基因，他可能是下一個博爾特；如果他有音樂基因，你可能把他培養成肖邦……”開展“兒童天賦基因”檢測的某商業機構的廣告語是“別把天才放錯了位置！”這些機構推出了“基因體檢套餐”、“天賦基因檢測”、“美容基因檢測”、“家族性疾病風險預測”等項目，有的地方甚至將基因檢測作為高端體檢項目來推廣，類似金女士這樣做基因檢測的人越來越多，不少人慷慨解囊，去檢測自己是否有患遺傳疾病的風險。

那么，基因檢測到底是怎么回事兒？真的可以準確預測未來疾病，甚至可以預知孩子的天賦以及未來的發展嗎？基因檢測與商業盈利混同在一起會不會有什么問題？

來龍去脈

那還是2006年，科學家繪制出人體所有23對染色體的完整基因序列圖譜以后，一些頗具市場眼光的企業開始進入這個潛力巨大的市場，向顧客提供有償基因檢測。

基因是什么呢？基因是DNA分子上攜帶有遺傳信息的功能片段，是遺傳信息的基本單位，是決定一切生物物種最基本的因子；基因在一定程度上決定人的生老病死，也在遺傳角度上決定人是否健康、靚麗、長壽等等。人的長相、身高、體重、膚色、性格等都與基因密不可分。基因檢測就是通過分析受檢者特定的基因序列，并根據這些基因序列與行為、生理活動和疾病的相關性，了解受檢者的遺傳信息以及患病風險。

2013年，美國好萊塢影星安吉麗娜？朱莉通^基因檢測發現自己攜帶家族遺傳的一種缺陷基因，患卵巢癌和乳腺癌的風險較高，于是接受了預防性的雙側乳腺切除術。朱莉是國際影視界的大牌明星，影響力很大，她這樣做等于給基因檢測做了一個特大廣告，吸引更多的人關注和了解這個項目。

如今，基因檢測似乎成為一種“高大上”的新鮮事物。在某些發達國家，檢測基因、指導疾病預防比較火；而國內也在悄然升溫，有人把它稱作“科學算命”。據了解，目前國內“三甲醫院”和有的民辦體檢中心爭相開展基因檢測項目，基因檢測也成為各體檢中心招攬客源的一大噱頭。據說目前有一千多種疾病可以通過基因技術做出預測和診斷。

除了實體健康機構有這個檢測項目以外，互聯網上有諸多基因檢測中心也做起了“基因檢測”的生意，要求在網上檢測基因的人也是絡繹不絕。許多人之所以選擇通過網上進行基因檢測，是這樣更便捷、更具私密性。操作的流程是：上網選定基因檢測單位的網站，打開網頁，根據自己需要選擇檢測項目；選定項目以后，基因檢測中心將通過快遞方式將采樣包交轉購買人。購買人采樣后，將采樣包寄回，基因檢測中心組織檢測并出具檢測報告，并給予個體化健康干預建議。

商業動作大

沒有人否認基因檢測的價值，它可以運用到新生兒檢測、遺傳病攜帶者的檢測、孕期基因檢測、法醫基因檢測。但是，上面提到的這些，都屬于預測性檢測。預測性檢測多半仍停留在學術研究階段。在基因檢測的發展過程中，很多商家比科學家先行了一步，他們盯住了社會上的特殊群體：老人、兒童、慢性病患者以及潛在的癌癥患者。

最能夠吸引老年人的，是諸如高血壓、糖尿病、老年癡呆（阿爾茨海默病）等慢性病的基因檢測，相關機構會告訴你：攜帶高風險基因型的人，在同樣生活環境及習慣下，發病率高出常人數倍。但真實情況并非如此，以高血壓為例，《自然遺傳學》披露的研究結果顯示，某些獨特的基因位點，可能會影響高血壓的發病率。但是，它可能是幾百種基因互相糾結、環境因素累加、時間因素累加后的共同結果。

預測患癌幾率是目前基因檢測的最大市場，也是國人最認可的項目。但是，癌癥的發病是多種因素引起的，大多數醫生都認為癌癥是一種生活方式疾病，與遺傳因素關系不大。以乳腺癌為例，大概只有10%的乳腺癌可以確切證明由遺傳因素導致。在已知的癌癥中，也只有5%至10%的癌癥是由遺傳基因引起的；這5%至10%的癌癥，預防性的基因檢測能告訴我們的也不多。況且，有了某種基因變異，也并不意味著一定會罹患癌癥。

有專家指出，各種所謂針對兒童的“天賦基因”檢測有兩個最大的漏洞，其一是故意混淆了統計學上的“關聯關系”與“因果關系”，有關聯不等于就是因果，檢測者把關聯說成了因果；其二是避而不談后天環境對人的重大影響。專家告誡，目前所有給孩子做的天賦基因檢測都是騙人的。

隱憂不少

目前，國內的基因測序儀都是從國外引進的，由于基因測序儀產地不同，在使用方法和檢測標準上也各不相同。就是說，兩家基因檢測公司的儀器不同，得出的結論也會有差異，一般人無從辨別查證。

基因檢測行業在使用試劑、應用范圍等方面也混亂無章。不少基因檢測公司使用誘惑性語言進行的宣傳也明顯言過其實。

在收費方面，基因檢測項目沒有收費標準，也沒有納入臨床檢測范疇，價格隨意性很大。

基因檢測是新興的高精尖技術，對從業人員素質要求應該相當高。但現實狀況是很多剛從醫學院校畢業的、不能進入醫療機構從事臨床醫療的人在操作檢測。由于檢測過程不規范，往往導致檢測結果也不那么準確。

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為了預測孩子的天賦，中國很早就開始在新生兒周歲時舉行“抓周”，以孩子選擇抓起書、筆、紙還是錢，預測他們未來會成為文人或商賈。這種帶著娛樂性質的活動寄托了家長的美好期待，如今幾乎不會有人當真。然而，有基因檢測機構嚴肅地告訴你，其天賦基因檢測能立刻獲知孩子具備何種潛質，未來你只管好好培養，一切皆有可能……

“一口唾液就能預測天賦”

英國《每日電訊》近日的報道開頭提到，一位中國家長忽然讓孩子放棄圍棋課程，轉而學習擊劍，原因是根據“天賦基因報告”，她的小孩運動天賦突出，而靜態思考分析并非強項。另一位范姓母親接受《每日電訊》采訪時表示，她的兩個孩子均被檢出具有極高的繪畫天賦，她準備為他們報名藝術課程。

在搜索引擎上輸入“兒童天賦基因檢測”，記者得到了近20萬條鏈接，相關機構的檢測價格從幾百到幾千元不等，地點遍及北上廣深及很多二線城市。

記者發現，其中絕大部分公司的檢測方法十分簡單：只要在網上注冊交費，然后用指定試劑收集孩子的唾液，郵寄到指定地址，過幾天便能以App收到孩子的“天賦檢測報告”。

一家提供天賦基因檢測產品的公司創始人告訴《每日電訊》，這種檢測項目已經過市場多年的歷練，不算新興產品，它以檢測者的血液或口腔粘膜細胞提取、擴增其基因信息后，“通過基因芯片技術或超高通量單核苷酸多態性分型技術，對用戶DNA信息進行檢測，分析其中包括的疾病風險、用藥安全、營養代謝、天賦潛能等信息”。

登錄這家公司的W站，記者發現其提供成人健康檢測、寶貝密碼健康基因檢測、寶貝密碼天賦基因檢測等產品，其中天賦基因檢測收費6999元，號稱可以一次性檢測出孩子的智商、情商甚至天賦潛能，指導如何開發孩子的潛能，乃至將來的工作能力。

這位公司創始人分析說，中國家長普遍存在這種焦慮感，他們害怕為孩子作出的選擇不夠好，導致其他機會溜走，不僅浪費了錢，還會毀掉孩子的自信。基因檢測恰到好處地給這些家長打了一針“強心劑”。

不過，他強調檢測結果只是參考，“小孩子被檢測出具有某方面的優勢基因，不代表他一定能成為這方面的頂尖分子，對于一個人的發展，天賦起很大作用，后天培養同樣重要”。

專家：不要草率決定孩子的未來

“通過基因去分析人體潛能和性格特征，理論上是有可能的，但缺乏足夠的科學論證。”浙江大學遺傳與基因組醫學研究中心主任祁鳴曾向國內媒體表達過對天賦基因檢測的專業認識。

“科學上從來沒有（定義）一種基因是天賦基因，我們對基因與才華的關聯度認識還比較弱，到底哪個基因與什么才華有關系，關聯度有多大，認識還很粗淺。只有個別能力是比較清楚的，像肌肉爆發力、肌肉耐力、骨密度水平等。市面上的某些天賦基因檢測項目，很可能是對一些基因相關的曲解。”祁鳴說。

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借助于紛繁多樣的新方法，下一代基因測序技術將肩負起在平行序列測定大量DNA的快速數據生成能力。部分下一代基因測序技術適用于篩檢出人群是否存在某些特定遺傳性癌癥高危險，實際例子是Myriad遺傳性癌癥風險測試。不止于此，它還可被用于明確癌癥患者的基因變異特征，進而盡早從癌癥靶向治療的非適應證用藥的新希望中受益。

盡管下一代基因測序技術有助于實現個體化醫學的目標，尤其對推動腫瘤學發展大有裨益，但不得不承認，標準化仍舊是當前亟需破解的瓶頸桎梏。伴隨而至的是醫療保險覆蓋欠均衡，最終命運尚未可知。

為盡早填平這一溝壑，8月17日，美國醫療技術政策中心（CMTP）針對以下一代基因測序為基礎的臨床腫瘤基因檢測，正式出臺初步醫療政策和醫保覆蓋指南。

“面對不斷涌現的基因檢測新工具，與之相適應的可供預測的醫保覆蓋和支付政策缺位，必然阻遏腫瘤醫療服務行業快速發展。”在新聞會上，CMTP首席執行官、美國醫療保險和醫療補助服務中心（CMS）前首席醫療官Sean Tunis如是說。“就建立在下一代基因測序基礎上靶基因板的醫保覆蓋事宜達成一致，無異于向出臺與臨床基因組學相匹配的更具全面性和前瞻性的醫療政策邁出具有里程碑式意義的第一步。”

CMTP報告顯示，將多部基因檢測相關指南整合為一困難重重。一方面，盡管業界對下一代基因測序的臨床有效性和結果解析仍存質疑聲，但不少醫保付費者仍表示對聚焦于基因測序檢測臨床應用規范問題的磋商深表關注。另一方面，鑒于當前缺乏充實的臨床應用實證，即便是已問世多年的基因和基因組檢測方法，醫保覆蓋依舊難盡如人意。

對于單次測序，下一代基因測序不僅可實現大基因組區域、高基因通量和（或）可觀樣本數檢測，而且較傳統技術更顯有效性、成本效益比和敏感性優勢。不無遺憾的是，迄今基因測序板所提供基因變異信息的確切臨床價值并未盡知，暫無力改變現有臨床干預決策成為不爭的事實。

人們有關下一代基因測序臨床應用標準化的探討順而轉向全力填補特定臨床疾病的個體變異或基因突變的證據空白，而非直接解決大量涉及如何評估以下一代基因測序為基礎，能同時分析多種不同基因變異技術的臨床獲益和風險。

此次頒布指南的要點包括：對患者而言，覆蓋5～50基因數的下一代基因測序試劑盒被視為標準醫療服務項目并為臨床必需，醫保可予付費；參照美國病理學家學會認證計劃和能力驗證標準，保障下一代基因測序的分析效度；在特殊醫療需求情況下，醫保可對更趨高通量和更全面的下一代基因測序癌癥試劑盒實行預授權付費；各項建議旨在激勵實驗室與臨床實現數據分享，提升患者的臨床試驗和注冊研究參與度，著力支撐精心策劃的數據寶庫以及諸如醫學證據聯盟、美國臨床腫瘤學會TAPUR試驗等臨床研究項目。

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[關鍵詞] 金黃色葡萄球菌;中毒休克綜合征毒素-1基因;殺白細胞毒素基因

[中圖分類號]R37 [文獻標識碼] B[文章編號] 1673-7210(2010)1(b)-070-02

Development of multiplex PCR for the detection of antibiotic-resistant gene and pathogenic genes in staphylococcus aureus

WANG Fengling, LIU Guohua, HOU Yingrong

(Laboratory Department of Cangzhou Traditional Chinese Medicine and Western Hospital, Hebei Province, Cangzhou 061001, China)

[Abstract] Objective: To study the features of staphylococcal toxic shock syndrome toxin (TSST-1), PVL and antibiotic resistant gene carried by staphylococcus aureus. Methods: The detection of PVL gene, mecA gene and TSST-1 gene were carried out by multiplex PCR. Results: 84 strains of staphylococcus aureus were detected mecA gene with multiplex PCR, and the detection rate was 58.3% (49/84). The isolation rate of PVL-positive strain was 23.8% (20/84) in S. aureus isolates. MRSA of PVL-positive had 13 strains (13/49, 26.5%), MSSA of PVL-positive had 7 strains (7/35, 20.0%), they showed no statistical difference(P>0.05). The prevalence of TSST-1 gene was not detected. Conclusion: The antibiotic resistance of staphylococcus aureus is increasing. Staphylococcus aureus may secrete various toxins. We should pay attention to detecting these toxins when separating staphylococcus aureus.

[Key words] Staphylococcus aureus; Toxic shock syndrome toxin-1 gene; Panton-valentine leukocidin gene

感染性疾病是全球最常見的疾病,金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是引起化膿性感染的主要病原菌。隨著抗菌藥物的廣泛應用,金葡菌的耐藥性逐漸增加,其中耐甲氧西林金葡萄菌(MRSA)的檢出尤為明顯。MRSA的耐藥機制主要是它獲得了含有mecA耐藥基因的可移動遺傳元件,即SCCmec盒。金葡菌能產生和分泌多種毒素[如殺白細胞毒素(PVL)、中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌腸毒素及表皮剝脫性毒素等],這些毒素已被證明與食物中毒、中毒性休克、皮膚燙傷樣綜合征及作為超抗原功能有關[1]。因此,非常有必要對金葡菌進行耐藥基因及致病毒素基因的檢測,防止此類細菌的播散。我科對我院臨床分離的金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因PVL基因和TSST-1基因進行檢測,并對其所引起的感染進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

84株金葡菌均為我科2008年1月～2009年1月從臨床標本中分離的菌株,分別來源于痰液、膿液、血液、分泌物、腹腔引流物、腎囊腫穿刺液、胸腔積液、膿皰液、皰液、導管下段及導管尖端,經美國DADE-BERING公司WalkAway-40全自動微生物分析儀鑒定核實為金葡菌。

1.2 細菌鑒定質控菌株

金葡菌ATCC25923,購于衛生部臨床檢驗中心。

1.3 儀器與試劑

WalkAway-40全自動微生物分析儀(美國DADE-BERING公司產品),PCR儀(美國Eppendorf公司產品),測序儀(美國ABI公司),凝膠成像儀(美國FOTODYNE),電泳儀(瑞典Phermacia公司)。PCR試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.4 引物設計

根據GenBank中已的基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件及參考文獻[2]設計mecA基因、TSST-1基因、PVL基因引物,擴增產物預期長度分別為892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。

mecA:P1 5'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3',P2 5'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。

PVL:P1 5'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3',P2 5',-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。

TSST-1:P1 5'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3',P2 5'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。

1.5 細菌DNA的提取

將冰凍保存的84株實驗菌株用胰酶大豆肉湯復蘇、轉種哥倫比亞羊血瓊脂培養基。用接種環挑取24 h培養的單個菌落,置于100 μl裂解液(1 mol/L NaOH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷卻后用等量的1 mol/L鹽酸中和,離心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400 μl無水乙醇),混勻后-20℃冰凍30 min,13 000 r/min離心15 min,棄上清。加入70%乙醇200 μl,靜置5 min,13 000 r/min離心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30 μl雙蒸水溶解DNA,作為PCR擴增模板。

1.6 多重PCR擴增體系及反應條件

把3對引物放入同一反應體系建立多重PCR。PCR體系:采用20 μl反應體系,模板1 μl,起始引物和終末引物各1 μl,dNTP 1.5 μl,Taq酶0.2 μl,10× Buffer 2 μl,Mg2+ 2 μl,雙蒸水11.3 μl。PCR反應條件:94℃預變性4 min,然后進入循環,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共進行35個循環,最后72℃延伸15 min,PCR產物在20 g/L的瓊脂糖凝膠中進行電泳,然后在溴化乙錠溶液中染色20 min,清水沖洗后用凝膠成像系統觀察結果。

1.7 序列測定

將PCR產物送上海生工生物工程有限公司進行測序,結果與GenBank中的核苷酸序列進行同源性比較。

2 結果

2.1 多重PCR擴增產物的電泳分析

84株金葡菌中檢出mecA基因陽性49株,檢出率為58.3%;檢出PVL基因20株,占臨床分離株的23.8%,其中,MRSA為13株(13/49,26.5%),MSSA為7株(7/35,20.0%),差異無統計學意義(P>0.05);未檢出TSST-1基因陽性菌株。部分菌株的PVL基因PCR擴增結果見圖1。

圖1 PVL陽性菌株電泳結果

(1～6、9～11泳道為PVL基因陰性菌株;7、8泳道為PVL基因陽性菌株;M:PCR marker)

2.2 PVL基因陽性金葡菌的分布特點

PVL基因陽性的分離株中,有7株分離自膿液和創傷分泌物,5株分離自血液,5株分離自痰液,2株分離自腹腔引流物,1株分離自尿液。

2.3 測序結果的分析

將測序結果與GenBank中的已有序列進行比較,同源性為100%。

3 討論

最近,國內學者報道葡萄球菌已是醫院感染分離率最高的細菌,其中MRSA占較高的比例[3]。近年來,其臨床分離率呈明顯上升趨勢,因具有多重耐藥特征和攜帶多種毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成為臨床治療的難點。筆者對我院金葡菌感染情況分析發現,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明顯高于馬筱玲等[4]報道的MRSA檢出率(42%),說明我院MRSA感染率較高,并且多為院內感染,應引起臨床重視。MRSA的甲氧西林耐藥決定簇(mecA)位于SCCmec盒上,該結構類似于轉座子,可以介導mecA基因游離傳播,使敏感的金葡菌獲得甲氧西林耐藥;同時SCCmec盒還可以整合許多其他耐藥基因。因此,MRSA菌株常表現為多重耐藥。MRSA的產生還與臨床上抗生素的不合理應用有密切關系。

PVL是金葡菌產生的一種外毒素,該毒素特異性地吸附并作用于白細胞,改變白細胞的通透性,造成大量白細胞損傷,喪失吞噬能力。同時,由于白細胞的破壞,處理抗原和呈遞抗原信息的能力下降,損害了機體的防御屏障和免疫應答,從而不能建立有效的特異性免疫。近年來由產PVL金葡菌所致感染而導致死亡病例逐漸增多,尤其是攜帶PVL基因的MRSA[5]。本研究結果顯示,84株金葡菌中PVL基因陽性的檢出率為23.8%,明顯高于閆中強等[6]報道的PVL基因檢出率(15.7%)。20株PVL陽性菌株中,7株分離自膿液和創傷分泌物,5株分離直血液,5株分離自痰液,2株分離自腹腔引流物,1株分離自尿液,說明不同臨床標本中都可能檢出PVL陽性的金葡菌,PVL陽性的金葡菌主要造成化膿性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因陽性菌株在MRSA中的分離率高于MSSA,PVL基因陽性的MRSA具有多重耐藥性且攜帶PVL,其毒性強,有一定的致死性,將會給患者帶來嚴重的后果。

TSST-1是金葡菌產生的一種產熱毒素,作為超抗原,TSST-1與MHC-Ⅱ類分子結合,作用于T細胞受體,使其大量增殖,并產生白細胞介素-1、白細胞介素-2及干擾素等多種細胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究對84株金葡菌進行檢測,未檢出TSST-1基因,可能與感染類型不同、其金葡菌攜帶的毒素基因不同有關。

[參考文獻]

[1]Becker K, Friedrich AW, Lubritz G, et al. Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantignes and exfoliative toxins among strains of staphylococcos aureus isolated from blood and nasal soecinens[J]. J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.

[2]Yamasaki O, Kaneko J, Morizane S, et al. The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection [J]. Clin Infect Dis,2005,40(3):381-385.

[3]姚春艷,府偉靈.葡萄球菌醫院感染的耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志,2004,14(1):104-106.

[4]馬筱玲,孫光明,戴媛媛,等.金黃色葡萄球菌耐藥性監測[J].臨床輸血與檢驗雜志,2007,9(1):18-20.

[5]Lopez-Aguilar C, Perez-Roth E, Moreno A, et al. Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylococcal disease [J]. J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.

[6]閆中強,沈定霞,羅燕萍,等.多重PCR檢測臨床分離金黃色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中國感染與化療雜志,2008,8(4):255-259.

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目前應用最廣泛的基因檢測是新生兒遺傳性疾病的檢測、遺傳疾病的診斷和某些常見病的輔助診斷。疾病診斷是用基因檢測技術檢測引起遺傳性疾病的突變基因。近年來令人非常興奮的是預測性基因檢測的開展。利用基因檢測技術在疾病發生前就發現疾病發生的風險，提早預防或采取有效的干預措施。目前已經有多種疾病可以用基因檢測的方法進行預測。基因檢測是通過血液、其他體液或細胞對DNA進行檢測的技術。可以診斷疾病，也可以用于疾病風險的預測。在進行基因檢測的過程，保證基因結果的準確性的諸多因素中，采樣的正確是一個重要的環節。今年在我院進行基因檢測預測疾病風險的人有60例，過程順利，并取得良好效果，現報道如下：

1 資料與方法：

在我院通過基因檢測預測疾病風險的人有60例，其中男26例，女34 例，年齡27-65歲。而這部分人群中，普遍對自己的身體狀況比較重視，且有腫瘤或心腦疾病家族病史。檢測時，工作人員用特制的采樣棒在被檢者的口腔內兩頰部輕輕刮取口腔黏膜的脫落細胞（或留取被檢者的唾液），放入固定液中送檢。實驗室對被測者細胞中的DNA分子的基因信息進行檢測。

2 結果：

在我院檢測的60例檢測者中，59例取樣一次成功，只有一例因取樣因細胞不夠而需重新取樣。

3 討論：

3.1 工作人員地操作正確與否，直接影響檢查地結果：抱著對被檢者認真負責的態度，檢查者必須強調讓被檢者在取樣前半個小時內不吃東西，如半小時內進食過的人必須用白開水輕輕漱口后再進行取樣檢測；取樣時工作人員帶上口包，手套；刮取口腔黏膜的脫落細胞時，動作不能過猛，但又不能太輕，過猛會刮破口輕粘膜，太輕又沒取到足夠的脫落細胞。刮取的標本應存放在陰涼干燥的地方，固定液的瓶蓋蓋嚴實，并及時送檢。

3.2 基因檢測可預測身體患病的風險，從而有針對性地預防和改善自己的生活環境和生活習慣，避免重大疾病的發生。

3.3 疾病易感基因檢測與常規體檢都能起到預防的作用，但二者反映的是不同的階段。一種疾病從開始到發病要經歷很長的時間。基因檢測是人在沒發病時，預防將來會發生什么疾病，屬于檢測的第一階段；而常規檢測是發生疾病后，疾病到達什么程度。如：早期、中期等等，這屬于檢測的第二個階段，是臨床醫學的范疇。所以說，基因檢測是主動預防疾病的發生，而傳統的體檢手段則無法起到這樣的預防作用。 傳統體檢主要針對人體已經出現的臨床病變進行診斷和檢查，它的主要任務是配合疾病的治療，無法在病變之前預知，下更多、更深的結論。也就是說，在疾病的預防上，傳統體檢十分的被動和滯后。現實中很多疾病并無明顯征兆，而一旦發病，現代醫學往往束手無策，患者及其家人就可能一生痛苦和麻煩。

3.4 基因檢測為健康管理帶來新思路

3.4.1 基因檢測為我們確定疾病風險提供了新的思路；隨著基因醫學研究的不斷深入，基因檢測在疾病風險預測與評估方面發揮了越來越重要的作用。在疾病發生前，通過對疾病易感基因進行檢測，從而對可能引起疾病的遺傳因素進行識別、評估，找到疾病發生的風險因素，應用于個體化的預防醫學，包括飲食、運動、生活方式和藥物影響，從而使人最大程度地保持健康 。

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【關鍵詞】 轉基因大豆成分 PCR SDS-PAGE 基因芯片 酶聯免疫吸附分析技術

我國為大豆的原產國也是大豆的主產國之一，但是近年來，國外的轉基因大豆大量涌入中國，中國國產大豆失去了價格優勢，很多企業選擇低成本的轉基因大豆作為原料。中國是個飲食文化上很依賴大豆的國家，各種大豆制品充斥著我們的餐桌，但是由于轉基因大豆可能存在安全性問題，很多消費者選擇不食用轉基因食品，但是有調查顯示我國存在很多大豆制品中是使用轉基因大豆制作的，但是都沒有進行標示，所以在食品安全監測方面，亟待一種有效的檢測產品中是否含有轉基因成分的手段。本文列出幾種大豆制品的轉基因成分的檢測方法，并對其優缺點進行了綜述。

1 PCR法

1.1 PCR（polymerase Chain Reaction）

目前，種植最廣的是抗草甘膦大豆由美國孟都山公司生產的轉基因大豆，轉基因大豆的外源基因epsps（5-enolypyruvy lshikimate-3-phosphate synthase，來源于A.tumefaciens菌株cp4），調控元件上游為花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子，下游終止子為NOS，檢測時主要針對這三種基因進行檢測，而且還包括大豆的內源基因lectin，用于鑒別大豆。利用這四個基因片段的特異性基因序列，利用Primer Premier5.0設計四對引物，進行擴增，可以初步確定大豆中是否含有轉基因成分。有研究結果表明，利用CTAB法提取大豆的總DNA，對大豆的CaMV 35S啟動子和內源基因Lection PCR擴增，擴增片段長度為118bp和195bp，表明了大豆中有轉基因成分。另有研究利用GUS標記基因和NOS終止子的pBI221質粒作為PCR檢測的陽性對照，在轉基因大豆中擴增出了陽性結果，并利用Southern雜交驗證了結果的可靠性。這些研究都證明了利用PCR對轉基因大豆進行檢測是簡便可靠的一種檢測手段。

1.2 巢式（nested PCR）和半巢式PCR

在食品檢驗領域，很多時候我們要面對的是大豆制品，其中的DNA被破壞，可供我們利用的有效的模板少，所以利用普通PCR無法檢測出是否含有轉基因大豆成分。巢式PCR是設計2對引物，其中1對引物在另1對引物擴增產物的片段上，通過2次PCR反應對某個基因進行檢測。通常第1次采用能擴增較大片段的引物，經過20～30 次循環擴增后，將第1次擴增的產物作為模板進行第2次擴增。半巢式PCR的原理與巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有1對半引物，有1個引物被用于2次PCR反應中。這2種方法不但可以減少假陽性的出現，而且可以使檢測的下限下降幾個數量級。從理論上來說，用巢式和半巢式PCR可以檢測到低于10-11g/μL的DNA模板量。

2 基因芯片

基因芯片是采用光導原位合成或顯微印刷等方法，將大量DNA探針片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標記的生物樣品中DNA分子雜交，再對雜交信號進行檢測分析，就可得出該樣品的遺傳信息。一次可以檢驗大量樣品，但是造價較高，還有待開發。

3 酶聯免疫吸附技術

酶聯免疫吸附分析是指：應用一個酶標記的免疫反應物和一個免疫吸附劑的酶免疫分析，通過不同的方法，可用于測定未知樣品的濃度。Lipp等人在2000年建立測試和驗證了基于ELISA的抗草甘膦轉基因大豆的特異性檢測方法，這個方法利用CP4-EPSPS（5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶）蛋白特異性抗體，初步研究表明，此方法可以檢測大豆原料中的轉基因成分含量范圍在0.3%-5%之間。

4 蛋白質SDS-PAGE電泳

研究表明：利用SDS-PAGE蛋白電泳，發現轉基因大豆中有一條分子量約為45ku的蛋白帶的表達量明顯比非轉基因大豆強，這樣可以在蛋白檢測中，從表達量的大小來區分轉基因大豆與非轉基因大豆，但是，這個實驗中，由于無法引進轉基因大豆對應的原始非轉基因大豆品種，只能與中國的大豆進行比對，所以結果僅作參考，但是這為轉基因大豆的檢測提供了一個新思路。

5 結語

轉基因大豆的檢測方法多種多種，各有其優點和缺點，在實際的檢測工作中，要根據具體情況，選擇一種行之有效的方法。

參考文獻：

篇7

【關鍵詞】人性化護理；ICU；應用

[Abstracr] Objective： Discuss the Mediterranean anemia gene detection in the diagnosis of the Mediterranean anemia screening application value. Method： Of the Mediterranean anemia’s survey 1354 cases of primary school students to proceed blood routine detection、hemoglobin electrophoresis and Mediterranean anemia gene test， statistical analysis of three kinds of screening diagnosis method of the relationship. Result： According to the MCV 80 fl or less Mediterranean anemia for standard screening， αMediterranean anemia missed diagnosis rate was 35.87%， βMediterranean anemia missed diagnosis rate was 6.74%； In MCH 25 pg or less for screening criteria， αMediterranean anemia missed diagnosis rate was 38.48%， β Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 15.28%； With the MCV80 fl， MCH 25 pg or less joint criteria for screening， α Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 29.26%， β Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 5.96%； By hemoglobin electrophoresis HbA2 > 3.5% for screening criteria，β Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 0.26%， send a quick zone screening α Mediterranean anemia missed diagnosis rate was 98.00%. Conclusion： The MCV， MCH and hemoglobin electrophoresis can be used as the Mediterranean anemia screening method of a kind of simple、convenient、fast， but not as a gold standard， the Mediterranean anemia gene testing detects in guidance of eugenic and superior nurture plays an irreplaceable important role.

[Key words] MCV； MCH； Hemoglobin Electrophoresis； Mediterranean anemia gene

地中海貧血，又稱海洋性貧血，亦稱珠蛋白生成障礙性貧血。它是一組常染色體遺傳性疾病，其發病機理是珠蛋白基因缺陷而導致一種或幾種珠蛋白合成障礙，造成血紅蛋白中的α類和β類珠蛋白比例失衡，以致引起慢性溶血性貧血。臨床癥狀輕重不一，輕型地中海貧血一航無明顯癥狀。對地貧的篩查診斷方法有多種，常用的有血液分析、血紅蛋白電泳、紅細胞脆性檢測等，隨著分子生物學技術的發展，地貧的基因診斷已被應用于臨床。現對1354例在讀小學生進行血液分析、血紅蛋白電泳和地貧基因檢測，分析地貧基因檢測的重要性，報道如下：

1 資料與方法

1.1 受檢對象：隨機選取德宏州鄉鎮小學在讀學生1354人。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：杭州博日熒光定量PCR儀、日本東亞SysmexXT-1800i全自動血液學分析儀、美國CVP凝膠成像儀、韓國COMBI分子雜交箱、北京六一廠31B瓊脂糖水平電泳儀

1.2.2 試劑：亞能生物技術（深圳）有限公司提供α-地貧和β-地貧基因檢測試劑盒

篇8

【關鍵詞】 分支桿菌;結核;藥物耐受性;基因

鏈霉素(Sm)作為最主要的一線抗結核藥物之一,但由于單純化療和不規律化療,其耐藥情況日益嚴重,對其耐藥性的研究受到重視。[1]有報道認為結核分支桿菌耐鏈霉素的產生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導致 [2]。本院采用采用PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交技術檢測了55株肺結核患者痰標本臨床分離株,并對25例結核患者痰標本直接進行rpsL基因、rrs基因突變檢測,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 23例敏感株和32例耐SM或含耐SM的臨床分離株來自本所。25例耐SM或含耐SM的肺結核患者痰標本來自本院住院結核患者。按結核病診斷細菌學規程進行菌種鑒定及藥敏實驗證實為結核分支桿菌并對鏈霉素耐藥。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA的制備[3] 臨床分離株DNA用常規酚/氯仿抽提法提取標本中DNA。

1.2.2 PCR擴增 采用25 μl反應體系,4XdNTPs終濃度為0.2 mmol/L,Bio-標記引物終濃度為0.2 μmol/L,擴增程序為:94℃變性I min,58℃退火1 min,72℃延伸I min,循環30次,最后72℃延伸10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測出現267 bp條帶。

1.2.3 雜交檢測 將點有探針的硝酸纖維素膜裝入雜交袋中,加入雜交液放置水浴鍋中進行預雜交:45℃×30 min。將Bio-標記引物的PCR擴增陽性產物變性:95 ℃×l0 min,取出迅速放入冰盒中,每毫升雜交液一般加l0 μl變性的擴增產物,放置水浴鍋中進行雜交:45℃×30 min。洗膜:洗液1 、45℃× 3 min,洗液2 、45℃×3 min。SA-AP:用1∶1000的稀釋液(洗液Ⅰ)與膜在37℃作用30 min。洗膜:洗液Ⅰ、45℃× 3 min,洗液Ⅱ、45℃×3 min。顯色:每毫升洗液I加入NBT 6.6 μl、BICP 3.3 μl混勻,將配好的顯色液加入雜交袋中,閉光37℃顯色5 min,觀察結果。

2 結果

2.1 PCR擴增,以結核分支桿菌H37RV為對照,23株藥物敏感株、32株耐SM分離株rpsL、rrs基因擴增均為陽性;25例耐SM肺結核患者痰標本中rpsL基因18例擴增陽性、rrs基因14例擴增陽性(見表1)。

2.2 應用寡核苷酸探針反相斑點雜交技術檢測rpsL、rrs基因突變結果(見表1、2)。

表1

基因例數 擴增陽性數 基因突變數突變率(%)

rpsL基因25 18950

rrs基因251417.2

表2

對55例臨床分離株的檢測結果(%)

分離株 例數rpsL基因突變數rr 基因突變數

敏感株23 1(4.3) 0(0)

耐藥株 3221(65.6) 4(12.5)

23株藥物敏感株的rpsL、rrs基因突變率分別為4.3%、0。32株耐SM分離株中,21株rpsL基因發生突變,突變率為65.6%;4株rrs基因發生突變,突變率為12.5%。耐SM肺結核患者痰標本中,基因突變檢測率分別為50.0%、7.2%。

3 討論

迄今,檢測結核桿菌藥敏的傳統方法仍然是培養法,但由于結核桿菌生長緩慢,使藥敏測定結果需要兩個月,甚至更長時間,這也是影響結核病化療效果的原因之一。因此,建立一種新的快速,有效的藥敏試驗方法對結核病的早期治療具有重要的意義。有研究表明[4] 結核分支桿菌耐鏈霉素的產生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導致。本實驗室前期通過PCR-SSCP方法得出耐鏈霉素時,rpsL、rrs基因總突變率為72.2%。[4]但PCR-SSCP方法建立在凝膠電泳基礎上,難于標準化和質量控制,難以大規模推廣。通過對rpsL、rrs基因核心易變區進行DNA序列分析。根據基因突變的中心區域,設計靶基因,制備寡核苷酸探針,點樣在雜交膜上,進行PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交。

PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交檢測rpsL、rrs基因突變,23株藥物敏感株的rpsL、rrs基因突變率分別為4.3%、0。32株耐SM分離株中,21株rpsL基因發生突變,突變率為65.6%;4株rrs基因發生突變,突變率為12.5%。由于有4.3%的敏感株也突變,說明某些耐藥菌株的形成可能與rpsL、rrs突變無關。

筆者用PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交技術直接檢測了25例耐SM肺結核患者痰標本,rpsL基因18例擴增陽性、rrs基因18例擴增陽性,其基因突變檢測率分別為50.0%、7.2%。低于耐SM臨床分離株。這可能是由于痰標本雜質多,同時痰標本的處理和靶DNA濃度對PCR擴增有直接影響。PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交技術以其簡便、快速、靈敏并可以直接檢測未經培養的痰標本中結核分支桿菌rpsL、rrs基因突變,為臨床檢測結核分支桿菌對鏈霉素耐藥性提供了初步依據。

參 考 文 獻

[1] Marttuke GJ,Soini H,Vyhneueskiy B.Rapid detection of rifampin- resistant.mycobacterium trberoulosis by Sequencing and line probe assay.Scand J Infect Dis,1998,30(2):129-132.

[2] Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mech anism of multiple drug resistance in clinical isolates of mycobacterium trberoulosis.JID,1995,171(4):954-957.

篇9

關鍵詞：沙門氏菌；ICAN；invA基因

沙門氏菌（Salmonella）為腸桿菌科沙門氏菌屬成員，是一類條件性細胞內寄生的革蘭氏陰性腸桿菌。絕大多數沙門氏菌對人和動物有致病性，能引起人和動物多種不同的臨床表現，主要引起發熱、胃腸炎、腹瀉和敗血癥等，中毒嚴重的，可引起死亡，病死率一般是0.5%～1%[2，3]。據世界衛生組織的報道，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，給各國經濟造成重大損失。因而，在醫學和公共衛生上具有非常重要的意義。目前，對沙門氏菌檢測大多采用細菌分離、生化鑒定、PCR等方法，過程煩瑣、費時費力，并且腸桿菌科細菌間的生化反應多有交叉，因此，這些檢測方法在快速、敏感與特異性等方面有自身的局限性[4～6]。Cocolin等[7]利用PCR擴增invA 基因快速檢測食品中的沙門氏菌；Bohaychuk[8]等人利用熒光定量PCR技術對沙門氏菌invA基因進行定量檢測。隨著對分子生物學技術研究的不斷進展，2007年日本學者Hiroyuki Mukai[1]等發明了一種嵌合引物介導的恒溫擴增法（即ICAN法）。ICAN反應在恒溫條件下進行，5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物、耐熱的RNaseH及具有鏈取代活性的DNA聚合酶是ICAN反應必需的。該反應的原理包括多引物反應和模板轉換兩個機理， RNaseH在新合成鏈的引物部分的RNA處引入切口后，馬上就會在切口處發生鏈取代反應取代新合成的鏈，同時，反應液中的嵌合引物立即與模板雜交開始新的延伸反應，多條鏈同時在同一模板進行的鏈合成反應稱多引物反應機理；模板轉換反應是指：原反應液中的模板合成的新模板在RNaseH酶和鏈取代酶的作用下，可以快速轉換出新的模板。由于多引物反應和模板轉換反應的同時進行，ICAN比起一般的擴增方法更加快速。ICAN法區別于其他檢測方法的最重要的特點是：反應時間短（一般只需60min）、所需模板量少（只需PCR所要求的模板量的1/5）、靈敏度高、擴增反應不需特殊的儀器（普通水浴鍋即可），另外，因為ICAN采用恒溫擴增系統，所以我們只要簡單地增加反應液的體積卻不需改變反應條件，這有助于DNA的產業化發展[9]。本文主要對ICAN法應用于沙門氏菌檢測的研究情況加以介紹。

1 材料與方法

1.1菌株 本次試驗的菌株全部來自浙江省疾病預防控制中心微生物檢驗所，名稱見表1。

1.2主要試劑和儀器 PCR儀（eppendorf Mastercycler Gradient）、離心機（eppendorf centrifuge 5417R）、DU800紫外/可見分光光度計、MiniRun GE-100型凝膠電泳儀、凝膠成像儀（BIO-RAD）、Bca BEST DNA聚合酶（TaKaRa）、Tli RNaseH Ⅱ（TaKaRa）、Hepes（sigma-aldrich）、dNTP Mixture（TaKaRa）。

1.3 ICAN引物 由上海生工生物技術委托IDT公司合成（引物序列見下表）

1.4菌培養、DNA模板的制備和DNA濃度純度的測定

1.4.1細菌的培養 從半固體培養基中挑取菌落接種于普通瓊脂平板上37℃培養18h，再從平板上挑取典型單菌落，用LB肉湯培養液37℃培養過夜。

1.4.2 DNA模板的制備 用細菌基因組DNA小量純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0）制備，其步驟為：

1.取1～4ml的過夜培養菌液，10000rpm離心2min，棄上清；

2.用150μl的SP Buffer（含RNase A1）充分懸浮細菌沉淀； 注：注意不要殘留細小菌塊，可以使用振蕩器（Vortex）等劇烈振蕩使菌體充分懸浮

3.加入20μl的Lysozyme溶液，均勻混合后室溫靜置5min；

4.加入30μl的EDTA Buffer，均勻混合后室溫靜置5min；

5.加入200μl的Solution A，劇烈振蕩后65℃保溫10min；注：①若Solution A出現沉淀，請于65℃加熱溶解，待恢復至室溫后使用；②65℃保溫10min后，溶液將由乳濁液變成透明液。如果此時溶液沒有變成透明，說明細菌沒有裂解基因組DNA將不能釋放；

6.加入400 μl的Solution B，劇烈振蕩15s； 注：若Solution B出現沉淀，請于65℃加熱溶解，待恢復至室溫后使用；

7.加入650 μl的Solution C，上下顛倒均勻混合；

8.12000 rpm離心1min；

9.先棄去上層有機相，然后將水相溶液（無色下層）移入預先置于1.5ml離心管上的Filter Cup中，12000rpm離心1min； 注：有機相（上層）請務必除盡，否則會阻礙DNA結合到DNA制備膜上；

10.棄Filter Cup，在濾液中加入450μl的DB Buffer，混合均勻；

11.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；

12.將上述操作11的混合液轉移至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液；

13.將500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液；

14.將700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12000rpm離心1min，棄濾液； 注：請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份；

15.重復操作步驟14；

16.將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入60μl的滅菌蒸水或Elution Buffer，室溫靜置1min； 注：把水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率

17.12000rpm離心1min洗脫DNA。

1.4.3 DNA濃度和純度的測定 其步驟為：

1.打開儀器DU800紫外/可見分光光度計后部（電源處）的開關，指示燈亮；

2.打開儀器輔助電腦，雙擊進入DU-800軟件的主界面，此時儀器自檢；

3.待檢測完成后，點擊"Continue"進入操作界面；

4.點擊"UV"打開紫外燈，此過程中會顯示"UV LAMP IS WARMING"，從黃色的UV燈不閃動開始需預熱20min左右，才能開始下一步操作；

5.向石英杯內加入對照樣本（DNA提取中用到的無菌去離子水），放入池架中，點擊軟件中的"BLANK"按鈕，設置一個空白對照（加樣過程中槍頭不能碰到樣品槽透明面）；

6.取出石英杯，吸去對照樣本，將樣品（9月22日提取DNA樣品）以1：3（50ul樣品：150ul去離子水）比例充分混勻，加入石英杯并點擊軟件界面的"GO"按鈕，讀出OD值（A260，A280），記錄結果；

7.打開杯蓋，取出樣品槽，吸除液體，并用無菌去離子水洗滌三遍（每測一個樣品后都需進行此操作），放回杯盒中；

8.關閉DU-800軟件，此時軟件提示："是否關閉燈"，若短時間內不用，請點擊"YES"關閉， 關閉電腦后再關閉儀器后部電源。

1.5 ICAN擴增的方法和步驟 ICAN反應體系參考Hiroyuki Mukai[8]，反應體積25μL，反應體系成分為：2mM IF3、2 mM IB3、0.5U TLiRNaseH II、2.75U BcaBEST DNA聚合酶、32mM Hepes-KOH buffer（PH 7.8）、0.5 mM dNTPs、100 mM KAc、4 mM Mg（Ac）2 、0.11%BSA、1%DMSO、100ng DNA模板，不足25μL部分用無菌去離子水補足。離心（5000rpm，1min）混勻，63℃等溫擴增1h。將陽性和陰性對照于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在生物凝膠成像分析儀（BIO-RAD）下觀察結果。

1.6 使用PCR緩沖液進行invA基因的恒溫擴增 只用Takara Ex Taq buffer代替Hepes-KOH buffer（PH 7.8），其他的反應液組成及操作步驟都與ICAN擴增相同

2 結果

2.1不同溫度下鼠傷寒沙門菌的ICAN反應 對ICAN反應溫度的初步試驗，得到反應溫度為62.8℃時擴增效率較好（見圖1）。

圖1 不同溫度下84年鼠傷寒沙門菌的ICAN實驗電泳結果圖

注：1.59.6℃，2.61.1℃，3.62.8℃，4.64.7℃，5.68.5℃，6.70.1℃，7.72.2℃，8.陰性對照

2.2鼠傷寒沙門菌的ICAN反應

圖2 不同年份鼠傷寒沙門菌的ICAN實驗電泳結果圖

注：1.06年鼠傷寒沙門菌（N-06），2.84年鼠傷寒沙門菌（N-84），3.95年鼠傷寒沙門菌（N-95），4.陰性

2.3用Takara Ex Taq buffer代替的恒溫擴增情況 使用Takara Ex Taq buffer 代替Hepes-KOH buffer（PH7.8）時，對反應溫度、Mg2+濃度、TLiRNaseH II濃度進行優化，得到反應條件為：擴增溫度55℃、Mg2+濃度為100mM、TLiRNaseH II為0.5u時條帶最亮。

圖3 沙門氏菌和其它腸桿菌科細菌恒溫擴增實驗電泳結果圖（緩沖液用Takara Ex Taq buffer代替）

注：1.鼠傷寒沙門菌（N-84），2.鼠傷寒沙門菌（N-95），3.鼠傷寒沙門菌（N-06）4.鴨沙門菌（W-1），5.腸炎沙門菌（W-2），M.marker，6.陰性對照，7.耶爾森菌（W-3）8.陰溝腸桿菌（W-4）9.福氏志賀菌（W-5），10. 奇異變形桿菌（W-6），11.大腸桿菌（W-7）

3 討論

ICAN是日本學者Hiroyuki Mukai[1]等人于2007年發明的一種核酸恒溫擴增新技術。該方法使用一對5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物，耐熱的RNaseH酶和具有鏈取代活性的BcaBEST DNA聚合酶，通過多引物反應和模板轉換反應兩個機理實現等溫條件下基因快速擴增，具有擴增反應快（只需1個小時）、靈敏度高（PCR所要求的DNA量的1/5對ICAN來說已足夠了）、特異性強、不需要昂貴的儀器（普通電熱恒溫水浴鍋即可）等優點。ICAN的高效率得益于三個關鍵因素。第一個因素是嵌合引物可以高效地與模板DNA雜交形成dDNA-引物復合體。與PCR不同，嵌合引物不需要與互補模板鏈競爭以獲得靶模板鏈。在PCR中，引物與互補模板鏈的競爭是DNA擴增反應的限制因素，尤其是在DNA擴增的后期階段[10]。第二個因素是由于RNaseH的作用，從同一模板上同時進行的反應可以達到PCR的兩倍或更高倍數。這是因為，RNaseH可以在DNA-RNA嵌合引物上切開每一個RNA殘基的5'端，繼而引導模板鏈的擴增反應。第三個因素是由Bca BEST DNA聚合酶引導的多引物反應與RNaseH和嵌合引物共同作用。在ICAN擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖像中，可以看到三條特異性條帶：最大的條帶含有兩條引物序列；中間大小的條帶含有其中的一條引物序列；最小的條帶不含引物序列。基于ICAN的高效率，我們可以在需要提供大量已知DNA序列作為模板的情況下采用ICAN，這是ICAN優于其他擴增方法的一個很大的方面。因為PCR所要求的DNA量的1/5對于ICAN來說已足夠了。由于ICAN采用恒溫擴增系統，所以我們可以簡單地增加反應液的體積而不需改變反應條件。目前為止，已經證實當反應體積從50ul增加到5ml而不改變反應條件時，每體積反應液的效率是相同的。但是PCR要求精確的溫度循環，在反應中就很難達到這一點。我們期待著ICAN的這一特性可以在"DNA產業"開啟一片新天地[9]。

侵襲蛋白普遍存在于沙門氏桿菌表面[11]，它決定沙門氏桿菌的侵襲力，是毒力決定因子。編碼侵襲蛋白的基因包括invA，invB，invC，invD和invE等。Rahn[12]等以侵襲蛋白基因（invasion protein A，invA）為目的基因，對630種沙門氏桿菌（包括100多種血清型）和142種非沙門氏桿菌（包括21個菌屬）進行檢測，結果除2個利齊菲爾德沙門氏桿菌（S.1itchfield）和2個山夫登堡沙門氏桿（S.senftenberg）外，其他沙門氏桿菌均檢出陽性，而142種非沙門氏桿菌中沒有1種菌擴增出目的條帶。因此他首次提出invA基因適于做PCR 檢測沙門氏桿菌的靶基因。我們對該擴增片段進行分析，在GenBank已公布的序列里，只有沙門菌具有該擴增片段，大腸桿菌、福氏志賀菌、耶爾森氏菌和陰溝腸桿菌等其他腸桿菌科細菌均沒有該擴增片段。另外，使用引物分析軟件對擴增此片段的兩條引物F3：5'-GGCGATATTGGTGTTTATGGGG和B3：5'-AACGATAAACTGGACCACGG分析，其Tm值與Hiroyuki Mukai[1]等人研究中引物的Tm很接近，因此本項研究選擇invA基因作為檢測沙門菌屬目的基因。invA基因全長244bp，根據ICAN的反應機理，結果應得到一條244bp的片段（含兩條引物序列）；一條224bp或222bp的片段（只含其中一條引物序列）；另一條202bp的片段（不含引物序列）。

反應溫度對擴增特異性的影響--使用PCR擴增時，可以通過調節退火溫度得到最佳反應條件。因此，可以設想：擴增溫度也是影響ICAN反應的一個重要因素。如圖1所示：鼠傷寒沙門菌DNA在7個不同的溫度下擴增，擴增產物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳顯像可見，當擴增溫度為61.1℃或62.8℃時，在目的片段大小處有條帶，擴增效果較好。因此，我們可以通過調節擴增溫度對ICAN進行優化。

ICAN反應體系組成對擴增結果的影響--觀察圖2，不同的鼠傷寒沙門菌ICAN擴增后都在目的條帶附近有連續的條帶，但并不是三條清晰的條帶。這個問題應該可以通過改變反應條件加以解決。但是我們在嘗試了很多次之后，結果并不理想，當使用與2.2完全相同的實驗條件做重復試驗時，也沒有重復出圖2所示的結果。因此，我們猜想：首先，自己配制的緩沖液穩定性不夠好，所以實驗的重復性一直不好。另外，研究中用到的KAc、Mg（Ac）2也是自己配制的。最后，因為我們無法購得TLiRNaseH酶，所以就用TLiRNaseH II代替了。這兩類酶在特性方面的差異可能也會影響實驗結果。

用PCR緩沖液代替Hepes-KOH buffer（PH7.8）做ICAN--由于前期實驗結果一直不穩定，猜測是緩沖液不好的緣故。保持原實驗條件不變，換用Takara Ex Taq buffer做ICAN，結果沙門菌都在稍大于8023bp處擴增出了單條片段，而陰性和其他腸桿菌科細菌都沒有該片段，如圖3。AbouHaidar[13]對Mg2+的催化特性進行研究，發現當溫度高于55℃或PH值大于7.5時，Mg2+催化RNA水解的活性增強。我們對此反應的Mg2+濃度優化，得出當Mg2+濃度為100mM時效果較好。對反應的擴增溫度和TLiRNaseH II優化，得到擴增溫度55℃、TLiRNaseH II為0.5u時擴增效果較好。對沙門菌，如副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、鴨沙門菌及腸炎沙門菌等，使用blast對IF3、IB3兩條引物比對后，發現各菌都沒有擴增出大于8000bp片段的可能性。因此我們猜想，實驗得到的大于8023bp的片段是多條小片段疊加的結果，為了驗證這種可能性，最好對這條片段測序。

參考文獻：

[1]Hiroyuki Mukai，Takashi Uemori，Osamu Takeda，et al. Highly Efficient Isothermal DNA Amplification System Using Three Elements of 5'-DNA-RNA-3'Chimeric Primers，RnaseH and Strand-displacing DNA Polymerase[J].J Biochem，2007，142（2）：273-281.

[2]Kamenskaia IN， Markina EIu， Chernysheva NA， et al. Biological characteristics of Salmonella typhimurium obtained from different sources 1975-1980[J].Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol，1983，（3）：26-32.

[3] Mead， P. S.， L. Slutsker， V. Dietz， L F. MeCalg， J. S. Bresee，et al. 1999. Food-related illness and death in the United States[J].Emerg. Infect Dis，5：607-625.

[4]Nassjb TA，El-DinMZ，El一Sharoud WM.Assessment of the presence of Salmonella spp.in Egyptian dairy products using various detection media[J].Lett Appl Microbiol，2003，37（5）：405-409.

[5]Pangloli P，Dje Y，Oliver SP，et al.Evaluation of methods for recovery of Salmonella from dairy cattle，poultry，and swine farms[J].Food Prot，2003，66（11）：1987-1995.

[6]Valentin-Bon IE，Brackett RE，SEO KH，et al.Preenrichment versus direct selective agar plating for the detection of Salmonella enteritidis in shell eggs[J].Food Prot，2003，66（9）：1670-1674.

[7]Cocolin L， Manzano M， Cantoni C， Comi G.Use of polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis to directly detect and identify Salmonella typhimurium in food[J].J Appl Microbiol，1998， 85（4）：673-677.

[8]Bohaychuk VM， Gensler GE， McFall ME， et al.A real-time PCR assay for the detection of Salmonella in a wide variety of food and food-animal matricest[J].J Food Prot，2007，70（5）：1080-1087.

[9]Uemori T，Mukai H，Takeda O，et al.Investigation of the Molecular Mechanism of ICAN a Novel Gene Amplification Method[J].J Biochem，2007，142（2）：283-292.

[10] Odelberg， S.J.， Weiss， R.B.， Hata， A.， and White， R.Template-switching during DNA synthesis by Thermus aquaticus DNA polymerase I[J].Nucleic Acids Res，2005，23：2049-2057

[11] Kwag SI， Bae DH， Cho JK，et al.Characteristics of persistent Salmonella Enteritidis strains in two integrated broiler chicken operations of Korea[J].J Vet Med Sci，2008，70（10）：1031-1035.

篇10

關鍵詞：轉基因食品 檢測技術 應用 發展

一、對轉基因食品的認識

轉基因食品是使用現代的分子生物技術，把某一些生物的基因移到其他不同類的物種中去，從而改變生物的遺傳信息，讓并讓其在營養品質、消費品質、形狀等等方面向人們需要的方向轉變。而以轉基因生物直接為食品或者為原材料加工生產而出的食品就是人們所說的轉基因食品。并且伴隨著現代科學技術的快速發展，一些以基因工程作為代表的生物技術同樣取得了非常矚目的成績，尤其是和人們的生活密切相連的轉基因食品更是受到了全世界范圍的關注。轉基因技術的飛快發展，在一方面推進了生產力的強力發展，但是另一方面，轉基因食品的安全問題也是一直存在著爭議。它是否會對人們的身體產生一些不良的反應，以及它是否會對生態環境產生一些負面的影響，各學界都一直爭論不休。

二、轉基因食品的利與弊

1、轉基因食品的好處

通過轉基因技術可以培育出高產、優質、抗蟲、抗寒、抗旱、抗鹽堿和抗除草劑等等特性的新品種，還可以減少農作物對農藥化肥與水的依賴，大大的降低農業成本，并且大幅度地提高了單位面積的產量，緩解了世界糧食短缺的矛盾；轉基因食品還可以擺脫氣候、季節的影響，可以讓人們在一年四季里都可吃到新鮮的蔬菜。與此同時，科研人員還發現轉基因作物長出的果實，不管是外形還是味道都有特別的風味；在過去要想改變植物的品種大多是通過育種，而這種比較傳統的育種方式要的時間要長一點，而且雜交出的那個品種也是不易控制的，即雜交的目的性差。但是轉基因技術就可以克服這些缺點，通過它可以隨意選擇一個目的基因轉移進去，在這之后就可得到一個想要的新品種，不需用花費那么長的時間再去篩選了。

2、轉基因食品的危害

有一些研究人員認為外來的基因會用一種人們現在還不是很了解的方式去破壞原食物中的一些營養成分。例如美國倫理與毒性中心的實驗報告上面說，和一般的大豆相比，在耐除草劑的大豆中，異黃酮的成分減少了；同時大量的轉基因生物步入大自然界后可能會和原野生物種進行雜交，從而造成基因污染，甚至影響到生物多樣性的持續利用和保護，而且這種污染對生態系統和環境造成的危害是比其他任何一種因素造成的污染都難以消除；根據有關報道，有些科學家還研究發現，某些轉基因生物產品有可能含有一些特定的有毒物質與過敏源，這會對人體的健康產生一些不利的影響，嚴重的話甚至有可能會致癌或者導致遺傳疾病。盡管現在為止還沒有一些有說服力的實驗報告表明這些優良品種是有毒的，但是有一些研究人員認為，對于基因的添加和人工提煉，有可能在達到某些效果的同時，也集聚和增加了食物中的微量毒素。這種毒素的累積是個相當漫長的過程，但是它確實有可能正在進行中，所以現在誰也不能擔保這些改良品種是沒有毒的。

三、轉基因食品的檢測技術

因為轉基因物質會在耕種、收割、加工與儲存的過程中混入食品當中去，并且對食品造成一些偶然的污染。所以，不管是對轉基因食品貼上標簽，還是對非轉基因原料與轉基因原料分開運輸，舊食品與新的轉基因原料的檢測是不可缺少的；除此之外，還要區分非轉基因與轉基因食品，要對轉基因食品進行選擇性的標記，并且對食物中轉基因的含量的多少要加以限制，同時也需要有效準確的轉基因檢測技術。

1、蛋白質印跡法

蛋白質印跡法是將電泳的顯色酶反應的靈敏性、抗體的特異性與較高的分離能力全部結合起來，這是檢測比較復雜混合物中的特異蛋白質最有用的工具之一，且普遍是用于檢測、分離某些特異的蛋白質，其靈敏度為1～5ng。而且它還可以確定一個樣品中是否有超過或者低于限值水平的目的蛋白，比較適用于目的蛋白的定性檢測，特別是用于那些不可溶蛋白質的檢測。

2、外源蛋白質的檢測

外源蛋白質的檢測就是從蛋白質的水平上對那些轉基因食品進行測定，在實際應用中大多數采用的是免疫學檢測法。這種方法可以檢測出有抗原性蛋白質類的存在，它的基本原理是通過抗體與抗原之間的一些特異反應來完成的。外源蛋白質檢測法比較快速，且具有一定的靈敏度，并且也能進行半定量，不需要一些特殊的儀器，適用于現場刪選與檢驗，但是外源蛋白質檢測法還是有其局限性。

3、核酸水平檢驗法

這種方法主要包括兩種：核酸印跡法和PCR檢測法。核酸印跡法的具體操作就是將要被檢測的樣品的DNA固定于尼龍膜上面，然后再用被標記的核酸探針與之雜交，最后對標記探針進行檢測來檢驗樣品中到底是否含有某些轉基因的DN段，但是這種方法的靈敏性比較低。PCR檢測法主要是對一些目標進行擴增，然后采用某些方法對已擴增的產物進行檢測。

4、Western雜交法

Western雜交是基因工程中檢驗外源基因有沒有表達出蛋白質的一種權威方法，其將蛋白質的印跡、電泳和免疫測定融為了一體，所以具有很高的靈敏性。使用這種方法可從植物細胞總蛋白中檢測出50ng左右的特異蛋白質。不過其操作較麻煩，且費用較高，不適合用于檢疫機構大量樣品的快速檢測。這種雜交檢測的關鍵在于抗體的制備。假如外源基因正常表達的時候，該植株細胞中就含有些許的目的蛋白。在植物細胞當中提取總蛋白質，然后將蛋白質樣品溶于含有還原劑和去污劑的溶液中，經過電泳讓蛋白質按分子的質量大小分離，最后把分離出的各個蛋白質條轉移到固相膜上面，膜在較高濃度的蛋白溶液中溫浴，達到封閉非特異性位點的效果。通過抗體和固相支持物上面的靶蛋白的抗體抗原特異性反應進行檢測。

5、電化學發光技術

電化學發光指的是通過電化學方法生產一些特殊的東西，然后這些物質之間或者其它物質與電生物質之間更進一步反應所產生的一種發光現象。這是電化學方法和化學發光相互結合的產物。

6、凝膠電泳

凝膠電泳是一種最簡單的檢測方法。但是因為和靶序列的大小相近的其余DN段也有可能會被擴增出來，因此用凝膠電泳檢驗后的PCR產物最少還應該接受限制酶的切割檢驗。

7、其他檢測方法

伴隨著國內外對食品的安全問題的關注度持續上升，轉基因食品的檢驗技術也在持續不斷的發展與更新，檢測的水平也是在不斷地提高。比如近紅外波譜技術最先是用于對谷物的溫度、淀粉含量和蛋白質的含量進行檢測的一種方法，但是近幾年以來，這個技術主要是應用在對轉基因食物的檢測，這種方法在檢測過程中比較方便的是不需要對那些需要被檢測的食物進行處理，外加操作快捷簡便，而且還能夠實現自動化的處理。食品企業為了能夠走出國門，進入國際市場，必須要加大檢驗轉基因食品的研究與投入。在檢測技術不斷更新之外，還必須要健全我國轉基因食品的安全監督機制，并且完善有關的法律和制度，這樣才能夠保證轉基因食品的檢測向著高品質、高靈敏度和低成本的大體方向發展。

四、轉基因食品的發展

那些關于轉基因作物的爭討應該是一種非常正常的現象。首先是現在新開發的一些品種本身還不是很完善，人們表示擔心還是有正當理由的。其次，不管怎樣總會有一些意識比較保守的人對一些新科技產物不太習慣，甚至拒絕接受。再就是受貿易利益的影響，有些國家的利益集團和政府利用轉基因食品不是很夠完善而強打貿易戰，讓事情變得更加復雜了。不過科學的腳步是不會因此而停頓的，科學家們必會向人類奉獻出更完滿的轉基因食物。

參考文獻：

1、曹澤虹，轉基因食品的檢測方法，中國食品添加劑，2005