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【關鍵詞】 生物黃酮; 心血管作用; 消化系統作用

近年來生物黃酮化合物的研究取得了很多可喜成果，尤其在心血管、消化系統以及鎮痛作用方面。本文就近年來相關研究及其臨床應用進展綜述如下。

1 心血管系統

1.1 沙苑子總黃酮沙苑子總黃酮(total flavonoid fractiono Astra)是從豆科植物扁莖黃芪的干燥成熟種子中分離而得， 早在20世紀80年代尹鐘洙等［1］曾初步觀察到靜脈注射沙苑子水煎劑及其總黃酮可引起血壓明顯下降， 李景新等［2］報道沙苑子總黃酮對腎血管性高血壓大鼠（RHR）有明顯降壓作用， 其機理可能與其降低血管緊張素（Ang）水平有關。吳捷等［3］認為沙苑子總黃酮能抑制心肌細胞鈣離子內流。

1.2 沙棘總黃酮(TFH)沙棘在許多藥理作用方面與銀杏相近，而銀杏（TFG）抗心腦缺血作用已在臨床上廣泛應用，王立群等［4］實驗表明，TFH和TFG對離體大鼠工作心臟缺血后心功能及血流動力學各指標有不同程度的改善作用，主要表現在能明顯減輕缺血后LVPSP，+dp/dtmax下降，TFH作用明顯優于TFG。

黃酮具有抗氧化、消除自由基作用。吳英等［5］研究表明沙棘總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷時能明顯減輕缺血再灌損傷區超微結構的病理改變，顯著提高大鼠心肌組織SOD活性并減少MDA的生成。TFH對大鼠心肌缺血再灌損傷的保護作用可能與提高自由基清除酶活性及抑制脂質過氧化反應有關。

1.3 羊藿總黃酮許蘭之等［6］研究了羊藿總黃酮(TFE)對腎上腺素能受體阻斷作用，發現TFE選擇性阻斷離體及整體動物心肌β1受體，對氣管β2受體和血管平滑肌α受體無阻斷的作用， 此研究為臨床應用羊藿治療冠心病心絞痛提供了理論依據。

1.4 水杉總黃酮程虹等［7］報道用水杉總黃酮10 mg/kg ip可推遲烏頭堿誘發的大鼠心律失常的出現時間，縮短持續時間；提高氯化鈣誘發大鼠心律失常的閾劑量;增加哇巴因誘發豚鼠心律失常的用量；還能對抗心肌缺血復灌所致的大鼠心律失常，表明水杉總黃酮具有廣泛的抗心律失常作用。水杉總黃酮能明顯減少甲狀腺素所致心臟肥厚大鼠心臟重量，縮短心肌纖維直徑，減少心室蛋白質及RNA含量，降低心室Na+-K+ATP酶及Na+-Ca2+ATP酶活性， 表明水杉總黃酮對甲狀腺素所致大鼠心臟肥厚具有抑制作用， 提示水杉總黃酮逆轉心衰致心肌肥厚有一定的意義［8］。

2 消化系統

2.1 黃芩莖葉總黃酮黃芩莖葉總黃酮可劑量依賴性地抑制膽鹽的吸收(P＜0.01)，其與考來烯胺的抑制膽鹽吸收的作用相比，沒有顯著性差異(P＞0.05)。提示抑制膽鹽的吸收可能是黃芩莖葉總黃酮調血脂作用機理之一。黃芩莖葉總黃酮應用于降血脂和防治冠心病可能會優于考來烯胺。但黃芩莖葉總黃酮抑制膽鹽吸收的同時，脂溶性維生素的吸收會不會受到抑制尚須進一步研究［9］。

我室近來研究表明皺皮木瓜提取物依劑量抑制胃腸運動; 抑制回腸自發性收縮反應和非競爭性拮抗乙酰膽堿誘導胃底平滑肌收縮的量效曲線;同時能減弱Ca2+所致兔回腸收縮， 木瓜提取物對胃腸平滑肌收縮的松弛與抗鈣作用有關［10］。提示皺皮木瓜具有解痙作用。

3 鎮痛抗炎

3.1 銀杏葉總黃酮

在小鼠扭體模型上，皮下注射銀杏葉總黃酮20～80 mg/kg，可顯著減少小鼠扭體數，并且呈劑量依賴關系;在小鼠熱板模型上，皮下注射和側腦室注射銀杏葉總黃酮均可顯著地延長小鼠舔足潛伏期，結果表明銀杏葉總黃酮有明顯鎮痛作用，其鎮痛作用可能有中樞機制的參與［11］。

3.2 蘆丁宋必衛等［12］對蘆丁的鎮痛作用研究結果表明蘆丁(6.25～100 mg/kg，ip)呈劑量依賴性的抑制小鼠扭體反應；蘆丁(50～100 mg/kg，ip)明顯提高小鼠嘶叫刺激閥值，顯著延長小鼠熱板舔足反應潛伏期，表明蘆丁有鎮痛作用。其鎮痛作用比阿斯匹林強， 但比嗎啡弱。

3.3 木瓜野木瓜系木通科野木瓜屬植物，具有祛風止痛功能。野木瓜對髓鞘和軸突膜有親和力，可引起髓鞘和軸突膜結構的變化，從而導致神經傳導阻滯［13］。我室實驗結果表明：資木瓜提取物對醋酸、溫度所致小鼠疼痛有較好的鎮痛作用，但對二甲苯所致小鼠耳腫脹消腫作用很弱［14］。

3.4 蕎麥葉總黃酮蕎麥葉總黃酮(TFBL)能明顯減輕肉芽腫的形成，降低毛細血管通透性和抑制耳腫，顯示TFBL具有明顯的鎮痛抗炎作用［15］。其機制可能與TFBL所含的主要成分蘆丁和槲皮素有關。據報道，槲皮素對12脂氧合酶的活性有很強的抑制作用，可影響花生四烯酸的代謝過程。蘆丁、槲皮素鎮痛機制還與鈣離子拮抗有關 。TFBL具有清除自由基，抗脂質過氧化作用［16］，可能也參與抗炎作用，有待深入研究。蕎麥葉資源豐富，其提取的TFBL幾乎無毒，值得進一步開發利用。

3.5 黃蜀葵花總黃酮(TFA)黃蜀葵花總黃酮TFA(ig或ip)可不同程度地抑制小鼠扭體反應；TFA(140，280 mg/kg，ig)可使福爾馬林致小鼠疼痛的Ⅰ、Ⅱ相反應明顯減輕，TFA(ip)對同側ip福爾馬林導致的疼痛可產生同樣抑制作用，但對側ip福爾馬林致小鼠疼痛無明顯影響；動脈注射TFA 200 mg/kg可明顯減輕KCl誘發的家兔疼痛反應；連續用藥可使TFA在小鼠跳躍實驗中陽性率為0。以上研究結果表明TFA有一定的鎮痛作用且局部給藥有效，連續用藥無成癮性。TFA的鎮痛機制可能既不同于阿片類藥物，也不同于非甾體抗炎藥，是一個鎮痛機制值得進一步探討的新型鎮痛藥物［17］。

3.6 蜂膠總黃酮(TFP)蜂膠總黃酮具有廣泛的生物活性如鎮痛作用等。注射TFP后能減少小鼠扭體次數。熱板實驗結果也表明TFP可延長小鼠舔足潛伏期，即延緩疼痛反應。甲醛致痛模型結果表明，注射TFP后在第一時相對小鼠疼痛反應無明顯影響，但可顯著降低第二時相的疼痛反應。說明TFP對炎癥所致疼痛反應有明顯鎮痛作用。icv TFP低劑量(為ip給藥劑量的1/20，即5 mg/kg)時，即可延長溫浴致小鼠縮尾反應潛伏期，提示TFP對小鼠具有中樞性鎮痛作用。已知NO在外周和中樞中以不同水平參與痛覺的調節。高劑量TFP在抑制小鼠熱板反應時能降低小鼠腦組織NO的含量，提示TFP鎮痛作用可能與抑制小鼠腦組織中NO的釋放有關；另外，ip TFP在抑制小鼠熱板反應同時，可降低腦組織、血清中MAD含量，提示TFP的鎮痛作用與抑制自由基及其過氧化物產生也有一定關系。PEGz是一種非常重要的疼痛介質之一，PEG 的外周致痛作用早已明確。ip TFP可降低腦組織和血清中的PEGz含量，提示TFP的鎮痛作用與抑制PEG 合成也有一定關系。TFP在多種疼痛動物模型中均表現出明顯的鎮痛作用，并可能通過降低腦組織中NO，MAD，PEG 含量和血中的MAD，PEG 含量而發揮鎮痛作用。至于其確切的鎮痛機制還有待進一步的研究［18］。

4 其他

金絲桃苷、蕓香苷及槲皮素等有良好的鎮痛作用［19］，其作用機制與Ca2+拮抗有關，尤其是Hyp不僅在多種全身鎮痛模型上有作用，而且在兔隱神經放電，兔耳K+皮下滲透等局部致痛模型上更有良好的局部鎮痛作用［20］，其作用機制與嗎啡和阿斯匹林皆不同，系一新型的鎮痛藥。

綜上所述，生物總黃酮來源廣泛，具有鎮痛消炎等多種藥理作用，有的甚至在臨床上得到廣泛應用，是一大類值得進一步研究和開發的藥物。

參考文獻

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［19］宋必衛，田 薇，劉穎雪，等.槲皮素鎮痛作用的研究［J］.安徽醫科大學學報，1994，29：168.

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關鍵詞：功能基因組；高通量數據；生物信息學

中圖分類號：Q933 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）10-0190-01

功能基因組學（后基因組學），是在結構基因組所提供的豐富的高通量信息資源以及大量各類生成產物的基礎上發展起來的基因組學的子學科。其通過在功能基因組水平或功能系統水平上全面地分析基因的功能，發展和提出了多種實驗手段和分析方法，使得生物學的研究對象由單一基因或蛋白質轉為多個基因或蛋白質組成的系統，進而得到關于基因表達、調控、功能以及生物的生長、發育的相關規律。

1 差異顯示反轉錄PCR技術

差異顯示反轉錄PCR（DDRT―PCR）技術是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝z電泳為基礎的功能基因組學的傳統方法。該方法的基本原理是：以1對細胞（或組織） 的總RNA反轉錄而成的cDNA為模板，利用PCR的高效擴增，通過5’端和3’端引物的合理設計和組合，將細胞（或組織） 中表達的基因片段直接顯示在DNA測序膠上，從而找出1對細胞（或組織）中表達有差異的cDN斷。DDRT―PCR具有周期短，功能多，靈敏度高，所需RNA的量較少并且重復性較高等優點。但是，在實際施行過程中， DDRT―PCR技術存在著假陽性率高、凝膠中單條cDNA帶成分不均一、所獲cDNA僅代表mRNA 3’UTR（非翻譯區）、一些低拷貝數mRNA不能有效呈現等問題。[1]

2 基因表達序列分析

基因表達序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一種快速高效地分析轉錄物的實驗方法。其理論依據是：基因組中95%的基因可以由來自cDNA 3’端特定位置的一段9―11bp長的序列加以區分。這一段特異的基因序列被記作SAGE標簽。基因表達序列分析通過對cDNA制備SAGE標簽，然后將這些標簽串聯起來并對其進行測定，可以顯示出各SAGE標簽所代表的基因在特定的組織中是否有表達，同時還可以將SAGE標簽所出現的頻率作為其所代表的基因表達程度的指標。但是，應用SAGE技術有一個重要前提條件：GenBank中必須有某一物種足夠多的DNA序列的資料（特別是EST序列的資料）。[2]

3 微陣列分析

DNA微陣列（microarray assay）技術包括cDNA微陣列和DNA芯片（DNA chip）兩種方法，這兩種方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸“探針”（cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸），該過程會用到光導化學合成、照相平版印刷和固相表面化學合成等技術。接著將寡核苷酸“探針”與來自不同細胞、組織或整個器官的用放射性同位素或熒光物標記的DNA或mRNA反轉錄生成的第一鏈cDNA進行雜交。最后對每個雜交點進行定量分析。定量分析的結果可以用于DNA測序、DNA突變和多態性分析以及對同一組織細胞在不同狀態下或在同一狀態下多種組織細胞基因表達水平的差異的檢測，還可以發現新的致病基因或疾病相關基因等。微陣列分析的優點是可以同時對大量的基因，甚至是整個基因組的基因表達進行對比分析，并且在核苷酸雜交技術的各個方面應用。其在同時比較同一組織在不同狀態下或各組織之間DNA序列分析以及基因的表達狀況等方面具有極大的優越性。

4 反義RNA分析

反義RNA是能與靶RNA互補配對的，用來定點分析某一段DN段（基因）功能的小分子RNA。反義RNA分析即是利用反義RNA來進行功能基因組分析的方法。該方法首先分離基因片段的mRNA，合成其mRNA的互補RNA（反RNA）。然后給反RNA加上基因表達必需的元件（如啟動子等），接著插入T-DNA。將其轉化到植株中，那么合成的基因就會在植株中表達，并表現出相應性狀。因為反義RNA與靶RNA堿基配對的結合方式，反義RNA可以在DNA復制、轉錄和翻譯水平上對基因表達加以調控。

5 蛋白質組分析

蛋白質組分析方法主要涉及兩個步驟：蛋白質的分離和蛋白質的鑒定。用于蛋白質分離的技術主要是雙向凝膠電泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是細胞抽提物在電泳過程中蛋白質個體首先依據所帶電荷然后依據分子大小被分離。這種方法的最大缺點是重復性差，使得幾乎不能同來自其他實驗室的資料進行比較。

6 生物信息學

生物信息學將DNA和蛋白質作為研究對象，以計算機等計算工具為基礎，發展更新各種軟件，收集、整理和儲存DNA和蛋白質的序列和結構數據，并加以分析進而發現藏在基因序列中的規律。應用生物信息學可以對功能基因組研究過程中產生的高通量，高維度的數據進行處理，應用數理統計的方法，以計算機的快速運算能力，找到功能基因組的相關信息。常應用生物信息學將未知DNA序列與數據庫中收集的DNA序列進行同源性比較，或應用相關軟件進行核苷酸及氨基酸序列的同源性比較，以此來獲得未知DNA序列的功能信息。[3]

7 小結與展望

隨著發展，基因組學由結構基因組學向功能基因組學發展，由此也產生了大量應用于功能基因組研究的工具和方法。這些方法從不同的角度和方向挖掘基因本身蘊含的豐富信息資源。功能基因組學無論是應用于獲取大量基因功能信息，亦或是針對特定基因的研究都取得了突破性的進展，發展速度迅速。但隨著各類研究的不斷深入進行，這些方法的精確性和準確性會漸漸不再滿足條件，同時各項技術尚未解決的一些問題也會被放大，單個方法或技術可能難以對新的問題有較好的應用。結合各種方法，揚長避短，綜合應用各種技術可以對功能基因組有更全面、深入的研究。[4]

功能基因組學的應用十分廣泛，從動物、植物到微生物群落分析都可以取得較好的研究成果，也可以應用于醫藥、毒理等領域。隨著計算機技術的發展，將生物信息學應用于功能基因組學，借助計算機強大的計算能力，功能基因組學將能取得更大的突破。

參考文獻

[1]趙錦榮，閻小君，蘇成芝.差異顯示反轉錄PCR 技術研究進展[J].生物化學與生物物理進展，2000，27（1）：28-32.

[2]常青山，余增亮.基因表達分析方法及其研究進展[J].生物技術通報，2002，（6）：27-31.

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關鍵詞：生物信息學；合作式教學；教學模式；教學改革

作者簡介：劉慶坡（1976-），男，河北曲陽人，浙江農林大學農業與食品科學學院，副教授。（浙江 臨安 311300）

基金項目：本文系浙江農林大學“農學類核心課程教學團隊”項目（項目編號：TD1201）、浙江農林大學研究生優質課程建設項目《生物信息學》的研究成果。

中圖分類號：G642.0 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0079（2013）16-0110-02

生物信息學是20世紀90年代由多學科知識相互滲透、融合而興起的一門新興交叉學科，現已成為當今生命科學和自然科學的重大前沿領域之一。[1]基于本學科在現代生命科學研究中的重要地位，現在國內外許多高校都紛紛設置了生物信息學專業或開設了“生物信息學”課程。[2]為培養具有創新精神和創業能力的應用型、復合型人才，浙江農林大學近年來面向農學等本科專業及作物、森林培育、林木遺傳育種等研究生專業開設了“生物信息學”選修課程。

生物信息學是理論概念與實踐應用并重的學科，具有開放性、發展性、交叉性、綜合性、應用性等特點。鑒于此，盡管國內的生物信息學科學研究開展得如火如荼，但由于受到師資、教材、授課對象、教學條件、教學法等因素限制，[3，4]開設該課程的高校尚未真正形成一套成熟的、科學的教學體系。近年來，各高校根據自身特點，不斷探索將CM法、PBL法、探究性、啟發性教學、雙語教學等教學法與手段引入課堂，并革新教學內容及考核方式等，取得了不錯的課程教學效果。[3，5-9]

現代教學改革與實踐證明，在教學過程中必須要突出“學生是教學活動的主體”，既要注意張揚學生“個性”，更要強化學生團隊合作意識及創新、創業能力培養，以保證人才培養質量。楊瑞等[10]調查發現，現在大部分學生比較“獨”，不愿意與人合作，這導致學生間人際關系淡漠，學習、做事效率低下。隨著各種“組學”計劃的開展，產生了數以萬、億計的序列數據，生物信息學得到了空前發展。在這種情況下，傳統的“填鴨式”、“布道式”教學模式已與當前社會快速發展的局面格格不入，迫切需要變革。合作式教學法是20世紀70年代興起于美國的一種參與式或協作式教學法，它以學生為中心，在教師恰當的組織、引導和有效調控下，使學生成為教學過程中的積極成分，通過“師生”、“生生”積極合作完成教學任務。[11]為激發學生的學習積極性和教學參與熱情，在采用啟發式、案例式和研討式教學基礎上，嘗試將合作式教學法引入“生物信息學”教學課堂。

一、開展合作式教學的必要性

“團結就是力量“、“獨學而無友，則孤陋而寡聞”、“三人行必有吾師”等至理名言很好地闡釋了團隊合作的重要性與必要性。浙江農林大學于2008年開始在農學、種子科學與工程等專業開設“生物信息學”課程。農學是生命科學領域的重要學科之一，基因組學和生物信息學的發展極大地促進了農學等生物科學研究的進步。因此，系統學習并掌握生物信息學的基本知識、基本理論和基本技能，不僅是學校培養“兩創型”高素質農業科技人才的需要，也是國家發展現代高新農業對農學相關專業學生的基本要求。

但是，經過幾年教學實踐發現，浙江農林大學農學相關專業學生學習“生物信息學”課程主要存在以下2個問題：

一是學生的重視程度不夠。有些學生對該課程的認識比較偏頗，不清楚其教學目的及學后有何用處，因而學習目的不明確，學習動力不足。

二是學生的知識水平參差不齊。由于本課程理論性與實踐性并重，前后知識點的銜接相對比較緊湊，且生物信息學相關網站、數據庫和軟件等均使用英文，有些學生數理化、計算機和英語等基礎知識不太扎實，在不能有效掌握某些知識點后，久而久之會產生厭學情緒。因此，采用教師講授、預設問題，學生提問，學生組隊分析和解決問題，教師點評加總結等“師與生”、“生與生”合作式教學，不僅可以使學生明晰本課程的學習目的，增強他們的參與意識與學習熱情，更重要的是，可以使學生之間優勢互補、互通有無、集思廣益，達到“以活動促合作，以合作促發展”的目的。

二、合作式教學的組織與實施

1.教學目標與設計

（1）教學目標。根據現代教育教學規律，以“生物信息學”優質課程建設為依托，以課堂建設為抓手，以培養“兩創型”高素質應用人才為根本任務，以多媒體、網絡、教學平臺為載體，深化改革，通過師生、生生間相互影響與合作，突顯學生教學主體地位，切實提高課堂教學效果。

（2）教學設計。因為“生物信息學”課程涉及的知識點比較多，而課時有限，所以正規的合作式教學法即小講課加分組活動不太適合。根據“生物信息學”課程性質及農學相關專業學生的學習特點，本課程采用在教師教學過程中加入合作式教學法元素的形式進行教學。教學過程中，避免過多講授數據庫開發、軟件算法等純理論性內容，堅持以解決生物學問題為主線，講授解決問題的思路與方法；堅持以教師為主導，以學生為主體，結合教師自身科研工作及本學科領域最新研究進展等案例教學，組織、引導和啟發學生開展自主與合作學習，培養學生獨立思考、分析問題和解決問題的能力及團隊合作精神與創造力。

2.教學組織與實施

合作式教學的關鍵是調動學生學習興趣，使其積極參與其中，即教師應用靈活多樣的教學手段，鼓勵學生積極參與教學過程，并通過實踐演練、課堂報告、研討、課上和課下實時交流等為載體強化教學效果。經過近幾年教學實踐，總結調動學生學習積極性的基本要素，主要圍繞以下幾方面開展合作式教學：

（1）實例為導，強化練習。在講授完每個知識點后，教師結合自己的科研工作在網絡上進行案例示范演示，然后由學生兩兩臨時搭配組隊上臺操作，完成規定任務，鞏固所學知識。比如在講解完“用關鍵詞或詞組檢索生物信息學數據庫”后，在2個自然班中分別臨時組建4個兩人小組，每個小組中一人負責出題，另一人負責解題，然后負責出題的學生對解題過程及答案進行點評，最后其他同學和教師進行點評及總結，加深了學生對相關知識點的理解。

（2）預設問題，開放教學。在講授新的知識點前，教師預先設置知識點相關問題，讓學生課后自學和探究思考，期間學生之間討論，亦可請教教師。比如在講到系統進化部分時，布置思考題“有哪些證據證明人類是從非洲走出來的？”或者教師預設一些本學科熱點問題或尚未解決的問題（無固定答案），讓學生自由組隊，通過課下查閱相關文獻資料、獨立思考及組內成員討論等探討相關問題的解題思路與方法，從而激發學生學習熱情。比如“蛋白質和DNA的進化問題，是先有‘雞’還是先有‘蛋’？”“除了農學及醫學外，生物信息學還有哪些應用領域？”等等。學生帶著問題去查找資料，通過集體討論達成共識。在各小組匯報時，首先由組內成員做補充說明，然后由其他組同學進行質疑。在相互質疑、討論中，使學生獲取靈感，擴大視野。

（3）角色互換，學生提問。改變過去教師“一言堂”教學局面，鼓勵學生隨時就相關問題進行提問，由學生或教師解答，真正做到師生互動，啟發學生思考，活躍課堂氣氛。

（4）注重實踐，關注效果。因為本學科知識點間連貫性較強，所以在講授2-3個知識點后，教師要布置綜合性的題目，由學生組隊在網絡實驗室里現場完成教學任務。學生組隊是半自由型的，即教師提出一定要求，在此前提下學生組隊，以避免“優優”或“差差”組合等情況發生，使學生間做到優勢互補，且既有分工，又有合作。比如，在講完系統進化樹重構章節后，要求學生根據研究興趣每5人一組，完成同源基因的搜集、多序列比對、系統進化樹構建、分析及解讀等所有環節，然后各小組進行課堂報告。學生組隊必須滿足教師提出的要求，即成員必須分別來自不同的自然班且成員間學習成績差異要比較明顯；成員中最好有英語、計算機或生物學成績較好的學生；成員間必須有分工，分別負責查資料、制作PPT、匯報等，且又必須通力合作，共同完成任務等，從而激發學生的創新思維和創新意識，增強學生的團隊合作意識與協作能力。

（5）全員參與，分類評價。本課程為專業選修課。課程成績以平時成績70%，期末考試（開卷）30%來計算。平時成績主要由學生出勤、課堂參與度、實驗報告、課堂報告等組成，其中實驗及課堂報告環節均以小組形式進行，重點考查學生的學習態度和完成質量等。在涉及到分組考核時，要求小組間分別評分，教師采取一定措施保證各組間打分相對客觀、公平，實現全員參與評價。

（6）實時溝通，解惑釋疑。學生課后可通過課程網絡教學平臺或QQ、MSN、E-mail、手機短信等實時聊天、溝通工具，與教師及時交流自己的學習心得或學習中遇到的困難等，教師不僅可為學生解惑釋疑，而且還有利于掌握學生對本課程的學習情況。教師可據此及時調整授課方案，達到更好的教學效果。

3.教學效果與評價

經在2010級2個自然班55名農學專業學生中進行合作式教學試點發現，學生最終成績中最低72分，最高95分，平均為86.1±5.08分。經T檢驗分析，顯著高于27名2008級學生的平均成績（83.2±5.13分；p=0.023）。因此，在“生物信息學”課程開展以課堂活動為特征的合作式教學，不僅活躍了課堂氣氛，增強了學生的參與意識，還極大地調動了學生主動學習的積極性，明顯提高了學習成績，培養了學生的科研創新能力和團隊合作意識。“教學結合實際”、“講課時經常會舉些有關知識的例子，很能提高同學的學習熱情”、“老師時常會講授有關的科學前沿知識，很能調動同學積極性”、“注重培養學生自主學習能力”、“上課與其他老師的方式不一樣，利于我們聽課”、“始終讓我保持上課興趣”、“上課有活力！”等是學生對“生物信息學”課程教學模式與教學效果的客觀評價。

三、結束語

生物信息學是一個不斷發展中的學科。實踐證明，只有緊跟學科發展步伐，及時更新、豐富教學內容；堅持“以生為本”，立足授課對象的實際需要，不斷調整和革新教學模式與教學方法，改進和完善學科教學體系，才能穩步提升本課程課堂教學效果，保證教學質量，從而為我國農業現代化培養更多高素質、強能力的應用型人才。

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篇4

關鍵詞：品種真實性鑒定 分子標記

1、農作物品種真實性鑒定分子檢測技術的研究進展

目前在品種真實性鑒定中使用的主要分子檢測技術是分子標記技術。自從1980年Botstein等首次提出RFLP作為遺傳標記構建遺傳連鎖圖譜以來，分別出現了20多種分子標記技術。目前在品種真實性鑒定中應用到的分子標記為RFLP、AFLP、RAPD以及SSR標記技術。

1.1 RFLP技術是1974年Grodzicker發明，是以Southern雜交為核心的分子標記技術，該技術原理是檢測DNA由限制性內切酶切后形成的DN段的大小差異。RFLP標記技術的優點是標記量大，等位基因間共顯性可區分純合子和雜合子；缺點是工作量大，成本高，要求的DNA量大且純度要高。

1.2 AFLP技術是1993年Zabeau等發明，通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測DNA酶切片段長度的多態性。結合了限制酶切和PCR技術，可在一個反應內檢測大量的限制性片段，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。但是AFLP技術操作復雜，成本較高，并且該項技術受到專利保護，只能用于非盈利性的科學研究。

1.3 RAPD技術是Willims、Welsh、McClelland等分別獨立建立。用一種由10個核苷酸組成的隨機引物，采用PCR技術對基因組的幾個區域進行擴增，產生大小不同的DNA，即為隨機擴增多態性。RAPD標記技術的優點是僅需少量DNA，簡單快速，成本低；缺點是穩定性差，重復性不好，顯性，不能鑒定雜合子。

1.4 SSR技術室根據微衛星重復序列兩端的保守序列設計引物，用PCR來擴增重復序列的多態性。SSR主要依賴于基本單元次數的變異，而這種變異在生物群體中是大量存在的。SSR標記的優點是具有大量的等位差異，多態性十分豐富，并且操作簡便，穩定可靠。此外，maize GDB、PANZEA等數據庫不斷提供和共享SSR引物，主要農作物如水稻等的基因組測序計劃已經完成以及其他作物的基因組測序計劃將陸續實施，生物信息學軟件以及高通量分子技術的開發等都為SSR標記在品種真實性鑒定上的應用開拓了更廣闊的空間。

2、水稻、玉米、棉花、小麥及等主要農作物品種真實性鑒定分子檢測技術研究進展

2.1 水稻是我國的主要糧食作物，在品種真實性分子檢測技術研究方面經過10多年的系統研究，目前已經形成了國家及地方的相關標準。中國農業科學院水稻所和作物所分別對參加水稻南、北方稻區國家水稻品種區域試驗的材料構建了DNA指紋圖譜，四川、重慶、遼寧、安徽等省市也分別對參加省區試和歷年推廣的水稻品種構建了DNA指紋圖譜。

2.2 玉米品種真實性分子檢測技術研究中，北京市農林科學院玉米研究中心趙久然、王風格等已經建立了SSR技術鑒定玉米品種真實性的標準實驗體系，并提出了SSR核心引物理論，已構建2000多個玉米品種（或組合）和自交系標準指紋，初步形成DNA指紋庫的管理和查詢計算機管理系統。

2.3 相對于水稻和玉米，小麥和棉花品種真實性分子檢測技術的研究相對滯后，但也已取得了初步的進展。小麥已經建立部分品種的DNA指紋圖譜數據庫。棉花SSR引物的開發正在快速進行，僅在CMD上公布的引物已有9000多對，且仍在不斷的增加中，這為利用SSR標記技術進行棉花DNA指紋圖譜的構建和應用奠定了良好的基礎。

篇5

2006年，第二次全國殘疾人抽樣調查結果顯示，關節病是目前我國肢體致殘的兩大主要原因之一，遠遠高于脊髓灰質炎、腦癱及交通事故等，而在這些關節病中類風濕性關節炎（RA）的致殘率高居首位。RA是我國常見的一種慢性致殘性自身免疫病，相關專家預計，目前我國類風濕關節炎患者超過440萬人。遺憾的是，大量患者未得到規范有效的治療。

張鵬，中國科學院深圳先進技術研究院轉化醫學研究與發展中心執行主任，師從我國著名骨科專家戴尅戎院士，主攻類風濕性關節炎發病機理和治療。

作為知名骨科專家秦嶺教授領導的轉化醫學中心的核心成員，張鵬博士研究團隊以骨科炎癥性疾病為研究重點，從病因、發病機理、治療以及康復等方面進行系統研發。以對發病機理的探討作為基礎研究提升水平的基石，以對該類疾病治療手段的創新以及相關產品或技術的臨床應用和產業化作為最高目標，以服務廣大骨科患者作為宗旨，正在走一條具有自身特色的骨科轉化研發之路。

“老藥新用”，攻堅類風濕

張鵬曾在導師戴尅戎院士的指導下，在國際上首次驗證了手術懸吊方式刺激迷走神經進而激活“膽堿能抗炎通路”對于RA模型早期炎癥發展的抑制作用。研究結果發表在SCI 期刊《Inflammation Research》上。隨后該論文陸續被《Nature Review Rheumatology》和《Nature Review Immunology》等高端雜志引用，截至目前該文章已被引用11次。

針對目前全球范圍內新藥研發遇到“冷冬”的大環境，張鵬課題組聯合計算機化學及生物信息學相關的專家，通過計算機輔助藥物預測結合目前骨關節炎基礎研究中的最新成果，在臨床用藥中篩選具有治療RA及骨關節炎等疾病的藥物新功效，即“老藥新用”在骨關節炎癥中的應用。

張鵬曾在《Inflammation Research》、《Therapeutic Advances in Musculoskeletal Disease》、《ScientificWorldJournal》等雜志發表文章，闡述了RA治療中的“老藥新用”策略：以膽堿能受體作為潛在的治療靶點，通過應用最新的藥物靶點檢索手段—“蛋白質折疊碼”技術，在臨床用藥中篩選新的抗風濕功效，進而通過臨床前實驗手段（體外細胞學、動物模型體內）驗證其生物學特性，從而提出了一整套基于現代生物信息學最新技術的“老藥新用”策略，并在RA治療中進行具體實施。

目前，基于神經內科用藥GTS-21（膽堿能受體激動劑）探討其治療RA的研究已經獲得國家自然科學基金的支持，進展順利。該項目是張鵬博士倡導的骨關節炎癥“老藥新用”策略的具體實施之一。

研究小組基于傳統中藥在RA治療中的特殊療效，從祖國醫學理論出發，結合現代藥理學的開發，從具有“舒筋活絡，祛風除濕”的中藥品種中提取若干有效成分，用于對RA療效的觀察。從臨床前研究的角度，采用體外細胞及動物模型為研究對象，進行了前期實驗。目前已經篩選到了若干有效的中藥活性成分，推進下一步的機理研究，最終期望將有活性的成分開發成RA治療中的療效確切的藥用品種。

本項目應用研發團隊核心成員楊家安博士具有自主知識產權的“蛋白質折疊碼”技術，可將復雜的蛋白空間三位信息轉成具有一維結構的編碼，并對藥物結合靶點特性以及藥物數據庫進行掃描比對，具有高效準確的特點。張鵬博士主導聯合楊家安博士等核心人員建立了一整套“基礎研究靶點—蛋白質折疊碼技術掃描分析—臨床用藥數據庫比對篩選—生物學有效性驗證”的“老藥新用”研發策略體系。

據張鵬介紹，該研究策略在目前原創性化學新藥研發遇到巨大挑戰的大背景下，可為新藥研發提供重要借鑒。“老藥新用”的策略可為新藥（1.6類新藥）的研發提供捷徑。由于“老藥”已經在臨床中廣泛應用，在安全性上具有保障，可避免藥物上市后因不良反應而“退市”的情況，同時可大大降低藥物研發成本及臨床用藥價格，進而惠及大眾。

除此之外，張鵬研究團隊對于膠原誘導性關節炎模型（CIA 模型）的創新性發現完善了對該疾病模型的認識。在此項研究中，張鵬發現了先前文獻中未作報道的CIA模型發病足爪關節破壞規律以及特殊的組織病理學表現，為全面了解CIA模型發病的特點和規律提供了實驗依據。通過放射學和組織學觀察，進一步完善了對其發病特點的描述，明確了該模型距下關節以及距舟關節為最早受累足爪關節的發病特點，在組織學觀察中發現了相鄰關節軟骨的“融合”現象，并在“融合”部位發現了新生血管的侵入以及新骨的生成，進而提出了“炎癥影響關節軟骨的終末分化狀態進而啟動軟骨內骨化”的科學假設，為研究RA發病中關節軟骨在骨贅生成中的作用提供了重要的實驗支持。相關成果發表在風濕病領域國際SCI期刊《Rheumatology International》 上。

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篇6

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsVDAC5；可溶性表達；親和層析

中圖分類號：S511；Q816 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2921-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.054

電壓依賴性陰離子通道蛋白（Voltage-dependent anion channels，VDAC）是線粒體外膜上具有高度保守性的孔狀蛋白，由一種小的多基因家族編碼，廣泛存在于真核生物中[1]，并在能量代謝、細胞凋亡、物質運輸和信號轉導過程中起著決定性作用[2-4]。VDACs最早從草履蟲（Paramecium aurelia）線粒體外膜上分離得到[5]。哺乳動物中主要有3種VDAC亞型[6]，真菌中主要有2種亞型[6]，而在植物中，煙草中至少有3種VDAC亞型，大豆、蒺藜苜蓿、百脈根和擬南芥中至少有5種不同的亞型[7-10]，水稻中存在8個VDAC基因[11]。與哺乳動物和真菌相比，植物中有更多的VDAC異型體，表明植物VDAC具有多種不同的功能，但它們都有著相同的離子選擇性和電壓依賴性特性，并且具有相似的電生理學特征，說明VDAC在結構和功能上具有一定的保守性[12]。近年來，研究發現植物VDAC在植物的生長和發育階段以及在生物和非生物脅迫響應方面都發揮著重要作用[10，13，14]。擬南芥中AtVDAC3能同葉綠體蛋白AtTrx m2相互作用，參與ROS信號通路，以應答鹽脅迫[15]；AtVDAC1能同CBL1相互作用，在種子萌發與植物發育過程中負調控植物對外界溫度的應答[13]。超表達OsVDAC3顯著提高了水稻的抗鹽性和抗旱性[16]。前期研究表明，OsVDAC5基因在YTA水稻生殖生長期達到最高表達水平[17]，表明OsVDAC5基因可能在水稻YTA的生殖發育期發揮重要功能。

在體外以大腸桿菌為宿主菌高效表達外源基因時，表達蛋白常常在細胞內凝集，形成包涵體。以包涵體形式存在的蛋白質分子無定形，呈非水溶性，無生物活性，為后續研究帶來諸多不便[18]。VDAC蛋白為線粒體外膜蛋白，在原核表達時由于無法形成正確的次級鍵，大多以包涵體形式存在。雖然可以通過包涵體蛋白變性、復性等方法獲得可溶性蛋白，但蛋白質的復性效率低，得到的可溶性蛋白常常會在結構上發生改變，不利于后期進一步研究蛋白質的功能[19]。研究表明，全長的OsVDAC5基因在體外表達時以包涵體形式存在[20]，因此，本研究擬通過生物信息學分析，將OsVDAC5基因截短為可溶性肽段，構建pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）基因片段的原核表達載體進行體外表達，以獲得可溶性目的蛋白，為OsVDAC5互作蛋白的研究及其在水稻生長發育過程中的生物學功能分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 原核表達載體pGEX-4T-1、大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）以及pET-32a-OsVDAC5質粒均由中南民族大學武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑 限制性內切酶Quick CutTM BamH Ⅰ、Quick CutTM Xho Ⅰ，T4-DNA連接酶，Ex Taq酶，DL15 000和DL2 000 DNA Marker，GST Fusion Protein Purification Kit均購自Takara公司。DNA凝膠回收和清潔試劑盒均購自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder購自Thermo公司。GST Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠購自Abbkine公司。超敏ECL化學發光即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司。引物合成及測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.1.3 試驗儀器 C1000 Touch Thermal Cycler 型PCR儀和凝膠成像分析儀，購自美國Bio-RAD公司；Model 1 000分子雜交箱，購自美國Robbins Scientific Corporation；752N型紫外可見分光光度計，購自上海精科公司；Centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機，購自德國Eppendoff公司；CR22G型高速離心機，購自日本Hitachi公司；Soniprep 150型超聲破碎儀，購自日本SANYO公司；半干式碳板轉移電泳槽、DYY-5型穩壓穩流電泳儀和膠片觀察燈，購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 OsVDAC5跨膜結構預測 利用生物信息學分析方法和不同在線生物學軟件（PRED-TMBB：http：//bioinformatics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/；BOCTOPUS： http：//boctopus.cbr.su.se/）對OsVDAC5蛋白質的二級結構及跨膜情況進行初步預測和分析。

1.2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體的構建 根據OsVDAC5基因序列，以BamHⅠ和XhoⅠ作為酶切位點設計引物，以pET-32a-OsVDAC5質粒為模板，擴增目的片段。引物為Fw（5′CGCGGATCCATGAGCAAAGGCCCAGC3′）、Rv（5′CC GCTCGAGAGATTCACTATCAATCTTGACATCA3′）。采用20 μL體系進行PCR反應，各反應物濃度：15.3 μL ddH2O，2 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3 μL Fw（10 mmol/L），0.3 μL Rv（10 mmol/L），1 μL稀釋100倍的pET-32a-OsVDAC5質粒，0.1 μL Ex Taq酶。

PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復34個循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增反應完成后使用AxyPrep DNA清潔試劑盒對PCR產物進行清潔回收，詳細操作參考試劑盒說明書，并進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時雙酶切目的片段和pGEX-4T-1空載體，37 ℃酶切3～4 h，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對酶切產物進行切膠回收。用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和pGEX-4T-1載體，16 ℃連接過夜并轉化DH5α感受態細胞，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養過夜。挑取單克隆，采用堿裂解法提取質粒，進行PCR擴增和雙酶切鑒定，將對應陽性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序分析。

1.2.3 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導表達

1）融合蛋白的誘導。將pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質粒和pGEX-4T-1空載體轉化BL21（DE3）表達菌株，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養過夜。分別挑取單克隆于3 mL含Amp+的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，第二天按1∶100的比例（V/V）接種于5 mL含Amp+的LB液體培養基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養至OD600 nm為0.6左右，加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，分別于10、15、25、37 ℃條件下振蕩培養誘導蛋白表達，分別在誘導4、6、8 h時取樣5 mL，檢測誘導溫度和誘導時間對可溶性蛋白表達的影響。同時，誘導不加IPTG的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和加IPTG的pGEX-4T1空載體的BL21菌株作為陰性對照。

2）融合蛋白的SDS-PAGE檢測。將誘導表達的菌液轉入10 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，向菌體中加入1 mL預冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液，緩慢用槍頭吹打菌體使菌體重懸，冰水混合物中進行超聲波細胞破碎，每管破碎10 s，間隔10 s，共破碎2～3 min，收集空載體混合液。其余蛋白混合液于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，分別收集蛋白上清液。向蛋白沉淀中加入1 mL蛋白沉淀變性液（10 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0）室溫放置1 h，期間混勻2～3次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，即為沉淀液。取出各樣品200 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進行12% SDS-PAGE檢測。考馬斯亮藍染色液染色3 h后換脫色液，進行脫色觀察。

3）融合蛋白的Western Blot檢測。對15、25、37 ℃條件下誘導8 h的蛋白上清液和沉淀液點樣進行Western Blot檢測。半干式轉膜儀80 mA恒流轉膜2.5 h后，加入40 mL蛋白封閉液室溫封閉1 h，按1∶5 000的比例（V/V）向封閉液中加入GST抗體， 4 ℃振蕩過夜，第二天按1∶10 000的比例（V/V）向封閉液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱內25 ℃振蕩孵育1.5 h后進行ECL化學發光檢測。

1.2.4 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化 采用金斯瑞GST Fusion Protein Purification Kit對蛋白進行親和層析。向層析柱中加入2 mL Glutathione Resin懸浮液，用10 mL預冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液平衡層析柱，將3 mL破碎后蛋白上清液加入層析柱，4 ℃緩慢振蕩孵育過夜。第二天收集流出液，加入32 mL預冷1×PBS（pH 7.4）緩沖液洗脫未和谷胱甘肽結合的蛋白，每次加入4 mL，孵育3 min，收集最后一次洗脫液。最后加入7 mL 10 mmol/L還原型GSH洗脫柱子上的蛋白，每次加入1 mL，孵育5 min，收集洗脫液。取出各樣品100 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進行12%SDS-PAGE檢測。考馬斯亮藍染色液染色3 h后換脫色液，進行脫色觀察。

2 結果與分析

2.1 OsVDAC5跨膜結構預測

前期構建了全長OsVDAC5基因原核表達載體，但是表達的蛋白以包涵體的形式存在，因此本研究利用生物信息學軟件預測了OsVDAC5的跨膜方式，將PRED-TMBB和BOCTOPUS這兩個專門預測蛋白質二級結構中β折疊結構的生物學軟件的預測結果進行對比（圖1）。預測結果表明，OsVDAC5在線粒體外膜上可能分別以十二次跨膜（PRED-TMBB）或十八次跨膜（BOCTOPUS）的結構存在，而且OsVDAC5蛋白的N端和C端有可能均位于線粒體雙層膜之間的膜間隙內。因此，僅保留OsVDAC5蛋白75個氨基酸殘基，構建只含N端75個氨基酸的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體。

2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體的構建

PCR擴增鑒定pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質粒，檢測到目的基因的大小為250 bp。利用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質粒，檢測到大小為5 000、250 bp的兩個條帶，與預期的條帶大小相同。將構建好的載體測序，測序結果100%匹配，表明pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體構建成功（圖2）。

2.3 SDS-PAGE檢測GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導表達

將陽性重組質粒熱激轉化BL21表達菌株，經過IPTG誘導后，用12%SDS-PAGE檢測表達產物，經過考馬斯亮藍染色，可觀察到在10、15、25、37 ℃誘導表達條件下，4、6、8 h時在35 kDa的上清液和沉淀中均有蛋白表達，其大小與預測的GST-OsVDAC5（1-75aa）的蛋白產物大小相同，且不同溫度在8 h時蛋白的表達量較4、6 h高，15 ℃時上清液中的表達量較沉淀高。結果表明，OsVDAC5（1-75aa）基因在pGEX-4T-1系統中得到了高效表達，其表達產物為部分可溶性蛋白（圖3）。

2.4 Western blot檢測GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導表達

用GST單抗對10、15、25、37 ℃誘導表達條件下誘導8 h的蛋白進行Western blot檢測，IPTG誘導后的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在35 kDa左右處的上清液和沉淀中均出現單一的信號條帶，而未加IPTG誘導的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和空載體蛋白樣品在35 kDa左右處未見表達（圖4）。此結果進一步表明pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）載體構建成功，且GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白可在上清液中高效表達。

2.5 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化

GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價親和，利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標簽的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白能夠與凝膠上的谷胱甘肽結合，從而將該蛋白與其他蛋白分離開。由于GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在上清液中高效表達，因此通過10 mmol/L還原型GSH洗脫后進行SDS-PAGE檢測，在35 kDa處可觀察到較為單一的蛋白條帶，得到純化的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白（圖5）。

3 小結與討論

在植物中VDACs高度保守，但對不同VDAC的特定功能知之甚少。OsVDAC5互作蛋白的研究對揭示OsVDAC5蛋白的功能有重要意義。同時，進行體外Pull-down試驗時通常需要可溶性的VDAC蛋白。因此，獲得外源表達的可溶性蛋白至關重要。

試驗室前期構建了帶有His標簽的pET-32a-OsVDAC5和pET-302a-OsVDAC5原核表達載體以及帶有GST標簽的pGEX-4T-1-OsVDAC5原核表達載體，但是體外表達的OsVDAC5融合蛋白幾乎都以包涵體的形式存在，暫時無法純化出可溶性的目的蛋白[20]，即全長的OsVDAC5基因在體外可能較難表達可溶性蛋白。因此，通過生物信息學的方法分析OsVDAC5的二級結構及跨膜區域，將OsVDAC5基因截短為只含N端的75個氨基酸進行體外表達。通過優化表達條件，結果獲得了純度較為理想的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白，也為OsVDAC5互作蛋白的研究和其在水稻中相關功能的研究奠定了基礎。

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關鍵詞：高性能計算；應用；中醫藥

中圖分類號：R-3 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5707（2016）06-0010-03

Abstract： High performance computing （HPC）， as a new and important research tool， has been applied in many fields successfully. Application of HPC in the TCM field is still in the exploratory stage. HPC in the future may be innovatively applied in the field of genomics Chinese herbal medicine， virtual medicine screening of new TCM， TCM data mining and big data analytics， modeling and simulation and so on.

Key words： high performance computing （HPC）； application； TCM

高性能計算是計算機科學的一個分支，研究并行算法和開發相關軟件，致力于開發高性能計算機。高性能計算是世界各國競相發展的前沿技術，是體現一個國家綜合實力和科技競爭力的重要指標。

科學計算作為科研方法變革的產物，已經發展成為與傳統的理論、實驗并駕齊驅的第三種科研方法，并且日益成為越來越重要的科研方法。科學計算方法的運用，是高性能計算應用的基礎和前提條件，而使高性能計算真正發揮作用主要取決于高性能計算的應用研究水平[1]。本文對于促進高性能計算未來在中醫藥領域的應用、豐富中醫藥信息學的研究內容及由此產生的中醫藥科研方法的創新具有推動作用。

1 高性能計算應用概況

1.1 我國在高性能計算應用領域仍處于落后水平

在高性能計算的研發和應用領域美國一直處于世界領先水平，日本和歐洲國家緊隨其后長期位居世界先進行列。近年來，我國在高性能計算硬件的研發方面取得了突破性進展，通過自主創新逐步掌握了一批硬件研發的關鍵技術。中國國防科技大學研制的天河系列超級計算機連續多次在世界超級計算機排行榜中名列首位，標志著我國高性能計算的硬件研究水平目前已經接近國際先進水平。但在應用軟件方面的發展嚴重滯后于硬件的發展水平，自主開發的高性能計算應用軟件嚴重匱乏，需要大量購買和引進國外開發的應用軟件，重要和關鍵部門的應用受制于人[2]。應用軟件是高性能計算應用的基礎，由于應用軟件研發水平的嚴重落后，目前我國在高性能計算應用領域仍處于落后水平。

1.2 國內外高性能計算主要的應用領域

高性能計算作為嶄新和重要的科研工具，目前已經在眾多的領域得到了成功應用，各種前沿科學研究、技術開發和工程設計都越來越多地使用了高性能計算，高性能計算已經日益成為科技創新的重要力量。目前主要的應用領域包括氣象數值模擬與預報、地震預報、納米技術、生物醫學、環境科學、空間科學、材料科學、計算物理、計算化學、流體力學、地震三維成像、石油勘探、天體星系模擬、大氣與海洋模擬、固體地球模擬、工業設計、核武器研究、全球氣候模型、湍流分析、飛行動力學、海洋環流、流體力學和超導模型等[1]。在生物醫學領域的應用目前主要集中在人類基因組學、蛋白質組學、藥物設計、分子動力學模擬等方面。

1.3 高性能計算應用的瓶頸

高性能計算雖然已經在眾多領域得到了成功應用，但由于技術難度等的限制，仍然屬于高投入高產出的非普及型應用。目前制約高性能計算應用的主要問題包括軟件開發的技術難度非常大，系統使用成本過高，不僅體現在軟硬件購置費用昂貴，而且系統運行維護成本過高，大型系統的年電費需上千萬元[2]。比較高精尖的應用范圍、非常高的技術要求和過高的使用成本，這些都限制了高性能計算的廣泛應用。

2 高性能計算在中醫藥領域應用的可行性分析

2.1 高性能計算在領域應用的前提條件

高性能計算在領域應用的條件首先需要應用領域具有較高的科研水平，特別是能夠通過科學計算的方法建立相應的數學物理模型和應用軟件來解決實際問題，利用高性能計算才有可能促成應用領域研究水平的大幅度提高。通過對高性能計算應用領域的最高學術獎戈登獎獲獎項目的分析，這些獲獎的應用項目絕大多數都具有多學科交叉融合的背景，這反映了高性能計算的應用需要應用領域與計算機科學、數學等學科的跨學科合作[3]。隨著高性能計算的應用，近些年高性能計算與應用學科的交叉學科不斷涌現，產生了計算化學、計算物理學、計算生物學等許多新興學科，這些交叉學科的產生標志著高性能計算在這些領域得到了高水平應用。

2.2 計算生物學的啟示

計算生物學是一門以生命科學中的現象和規律作為研究對象，以解決生物學問題為最終目標，通過模擬和仿真的方法對生物學問題進行定量和定性研究的新興學科。計算生物學與生物信息學比較，最大的不同之處在于生物信息學側重于生物信息的采集、存儲、處理和分析，而計算生物學側重于對生命現象進行研究、解決生物學問題[4]。目前計算生物學領域的研究主要集中在蛋白質行為的模擬、藥物分子的篩選、基因測序等方面。

雖然目前中醫藥領域還不滿足高性能計算的應用條件，但通過借鑒計算生物學的研究方法，未來有可能在中醫藥領域開展具有創新性的高性能計算的應用研究。

3 高性能計算在中醫藥領域應用的展望

3.1 中藥植物藥的基因組學

基因組學是遺傳學的一個分支，研究生物基因組和如何利用基因，涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析，研究內容包括以全基因組測序為目標的結構基因組學和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學。基因組學是高性能計算應用的一個重要方向，沒有高性能計算人類的基因組計劃就不可能實現，高性能計算已經成為基因組學研究不可或缺的科研工具。隨著基因組學研究的深入、技術的成熟和成本的大幅度下降，使得基因組學的研究逐漸由人類的基因組學擴展到動物、植物等多個相近領域。利用高性能計算在基因組學方面成熟的應用軟件開展中藥植物藥的基因組學研究未來有可能是高性能計算在中醫藥領域的重要應用。

3.2 中藥新藥的虛擬藥物篩選

利用高性能計算進行虛擬藥物篩選目前已經成為西藥新藥開發的一條嶄新和重要的途徑。新藥研發的核心工作之一是從大量的化合物樣品庫中發現有藥理活性的化合物，計算機虛擬篩選輔助新藥開發是利用統計學和分子模型化技術來指導新的先導結構的發現或設計，從而減少實驗室的工作量，縮短開發周期、降低開發成本。近年來對多靶點藥物的研究已經成為國際上新藥開發的一個重要的研究熱點，中藥是天然的多靶點藥物，蘊含著巨大的新藥創制的潛力[5-6]。應用高性能計算開展中藥新藥的虛擬藥物篩選有可能成為中藥新藥開發的嶄新途徑。

3.3 中醫藥數據挖掘和大數據分析

數據挖掘是從大量的、不完全的、有噪聲的、模糊的、隨機的實際應用數據中，提取隱含在其中的、人們事先不知道的、但又是潛在有用的信息和知識的過程。大數據分析是指對規模巨大的數據進行分析，目前世界各國對大數據分析技術高度重視，大數據被視為國家重要的戰略資源。數據挖掘和大數據分析是高性能計算應用的重要領域之一。目前中醫藥領域的數據挖掘和大數據分析主要集中在對方劑配伍規律、中醫證治規律等的研究，現有的研究水平還不能構成對高性能計算的迫切需求。隨著數據挖掘和大數據分析在中醫藥領域應用水平的提高，數據研究的內容、方法和結果的日趨豐富，隨著數據量的積累和研究方法復雜度的提高，中醫藥數據挖掘和大數據分析未來有可能成為高性能計算在中醫藥領域富有潛力的應用。

3.4 模擬與仿真

模擬與仿真是依靠計算機通過數值計算和圖像顯示的方法，對工程、物理、生物等各類問題進行研究。高性能計算不僅具有強大的計算功能，還可以模擬或代替由于受經濟或者其他條件限制不能進行的實驗。2013年10月，哈佛大學教授Martin Karplus、斯坦福大學教授Michael Levitt和南加州大學教授Arieh Warshel因“為復雜化學系統創立了多尺度模型”而獲得諾貝爾獎，評委會聲明中稱這一成果意味著對于化學家來說計算機已經成為同試管一樣重要的工具[1]。

計算機模擬方法在生命科學中已經得到了迅速的發展和廣泛的應用。高性能計算應用領域的最高學術獎戈登獎獲獎項目“在20萬CPU核和異構體系結構上的千萬億次持續性能血流模擬”，該項目模擬了血液流動狀態，可以輔助血栓的早期病理學診斷及抗血栓藥物的研究。另一項獲獎項目“呼之欲出的貓：包含109規模神經元、1013規模突觸的大腦皮質模擬”，對神經元和突觸規模與貓大腦相當的大腦皮質功能進行了模擬，并以此為基礎開展了認知計算的研究[3]。此外國內外大量的高性能計算被用于分子動力學模擬，分子動力學模擬是一種數值模擬方法，通過將分子抽象為由化學鍵連接的質點按照基于牛頓力學的數學模型迭代求解分子體系的行為。利用高性能計算進行分子動力學模擬已經成為化學和生物學研究中與實驗手段相當的標準研究方式[7-8]。模擬和仿真技術在中醫藥研究中的應用未來有可能成為高性能計算在中醫藥領域創新性的應用。

4 小結

高性能計算的應用是使高性能計算真正發揮作用的軟實力，是高性能計算領域重要的研究內容。高性能計算的應用需要多學科的交叉與合作，計算生物學的產生標志著高性能計算在生物醫學領域得到了成功應用。

高性能計算在中醫藥領域的應用目前還處于探索階段，尚不具備大規模應用的條件和基礎。未來有可能通過借鑒計算生物學的研究方法在中藥植物藥的基因組學、中藥新藥的虛擬藥物篩選、中醫藥數據挖掘和大數據分析、模擬與仿真等領域進行開創性的應用研究。高性能計算在中醫藥領域的應用將會對中醫藥科研方法的創新與發展產生深刻的影響。

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篇8

關鍵詞：統計遺傳學；在線開放課程；創新人才

隨著科技競爭的日趨激烈和人才國際化程度的不斷加快，我國拔尖人才日益緊缺。當前高等教育工作的根本問題是人才培養質量問題，其核心是學生創新精神和創新能力的培養。建立拔尖創新人才培養的有效機制，促進創新人才脫穎而出，促進高校探索創新型人才培養的新模式，促進高校探索并建立以問題和課題為核心的教學模式，倡導以學生為主體的本科人才培養和研究型教學人才改革，調動學生的學習積極性、主動性和創造性，激發學生的創新思維和創新意識，是建設創新型國家，實現中華民族偉大復興的歷史要求，也是當前對教育改革的迫切要求。

高等醫學院校主要是以專業為依托，全面提高學生綜合素質。但是在限定學時的情況下，按部就班的講解已不能滿足學生對知識的需求，不能滿足創新人才培養的需要。由于統計遺傳學教學學時相對較少，教師要完成教學計劃，所以學生創新能力的培養只依靠課堂理論教學不會有顯著效果。學生可以利用課余時間在網絡上繼續拓展學習、深入學習、實踐學習。但是學生如何獲得優質的學習資源，如何對學生創新能力的培養起到促進作用？這就需要一個學習、交流和實踐的平臺，統計遺傳學在線開放課程平臺建設就顯得尤為重要。

一、統計遺傳學在線開放課程建設的必要性和重要性

在線開放課程模式與傳統課堂教學模式相比，具有顯著的優勢，學習不受時間段的限制。學習者可以合理安排進行個性化的學習，反復觀看教學視頻，可以分析具體的問題，直到理解掌握為止。統計遺傳學在線開放課程建設將以服務平臺建設的形式，使學習者可以充分利用平臺資源，高效參與完整的教學過程。因此，統計遺傳學在線開放課程教學模式更方便學習者對知識點的學習，彌補課堂教學的不足。在線開放課程教學模式增強了教學吸引力，激發了學習者的學習積極性和自主性，擴大了優質教育資源受益面，拓展了教學時空，有著傳統課堂教學模式無法比擬的優勢，給高等醫學院校教學改革帶來了新的機遇和挑戰。

統計遺傳學是利用統計學的方法，借助計算機的實現手段，研究生命體基因組遺傳和變異的一門應用型課程。它是我校生物信息學專業重要的專業課，教學效果的好壞，直接影響到學生后續畢業設計的完成效果。其目標是通過課程學習，培養學生利用統計遺傳學方法解決生物信息學相關問題，而這恰恰是一個從理論到實踐的過程。如果統計遺傳學在線開放課程得到建設并實踐應用，它的相關理論和方法可以幫助遺傳學、臨床醫學和預防醫學等專業解決實際問題，醫學院校其他專業的學生也可以利用網絡資源學習統計遺傳學知識，并成為其他專業學生了解生物信息的一個前導課程，提高統計遺傳學的應用價值。因此，在線開放課程是培養學生生物信息學創新思維能力的重要途徑和手段，是高等醫學院校人才培養的需要和交流溝通的平臺。

二、統計遺傳學在線開放課程建設的主要平臺

結合高等醫學院校的特色，滿足高等醫學院校的統計遺傳學教學和學習者利用閑暇時間學習的需要，并以使統計遺傳學在線開放課程在實踐中得到應用為目標，以學生自主創新實踐為中心，建立與學生創新思維能力相適應的統計遺傳學開放課程體系。擬解決理論與實踐相脫離、學生合作意識差、缺少學生自主構建知識與能力的實踐活動、缺少科學探究氛圍和缺乏對學生綜合能力的評價等問題。達到高等醫學院校對創新人才培養的目的。

（一）統計遺傳學在線開放課程的資源庫平臺建設

統計遺傳學在線開放課程的課程資源庫包括基礎教學資源和學術拓展資源。基礎教學資源包括統計遺傳學的重要理論知識講解視頻、統計遺傳學常用軟件講解及介紹、統計遺傳學相關內容（連鎖分析、關聯分析、群體遺傳學等）的分析實例及數據等資源，給學生提供統計遺傳學基礎理論的學習平臺，數據集庫是常用的分析數據集及數據庫鏈接，供學生練習和測試用。理論和實例相結合，提高學生分析問題和解決問題的能力；學術拓展資源包括統計遺傳學的應用領域、用統計遺傳學可以解決的科學問題、統計遺傳學研究進展及近期前沿熱點問題等資源，開拓學生視野。

（二）統計遺傳學在線開放課程的學生測試平臺建設

建設統計遺傳學在線開放課程的學生測試平臺，調用數據集庫中的數據，應用學到的統計遺傳學知識解決實際問題，通過理論和實驗的方式進行測試，考核學生對基本理論知識的掌握程度，及時發現問題，彌補知識欠缺。使統計遺傳學在線開放課程在教學中得到很好的實踐應用。

（三）統計遺傳學在線開放課程的實踐與創新平臺建設

建設統計遺傳學在線開放課程的實踐與創新平臺，定期留一些具體分析實例的題目，讓學生自由分組，開展自主探究活動，各組自行設計方案，最后對應的各個題目進行分組匯報，激發學生的主動探究精神，培養團隊精神，提高學生的創新和實踐能力。

三、統計遺傳學在線開放課程建設具體思路及實施方案

（一）組建團隊建設統計遺傳學在線開放課程資源庫

統計遺傳學教學團隊由教學經驗豐富的5名教師組成，統計遺傳學在線開放課程建設資源庫的建設包括基礎教學資源和學術拓展資源，由基礎到實踐再到學術前沿應用。基礎教學資源包括教學章節理論內容視頻、實驗課常用軟件講解和常用分析的實例演示。按照教學大綱要求的重點和難點，團隊中的教師根據各自擅長的章節內容的知識點進行視頻錄制，教學視頻要根據知識點難易程度去設計，每一個知識點錄制成一段微視頻，一個教學視頻一般不超過20分鐘；挑選典型性內容做實例分析演示進行視頻的錄制等。學術拓展資源是統計遺傳學相關領域的研究成果，教師每周都查找國內外文獻，搜集最新的科研成果放在統計遺傳學在線開放課程的學術拓展資源中，讓學生了解統計遺傳學在生命科學中的應用，激發學生的學習興趣，體現該課程的重要性。

（二）組建統計遺傳學在線開放課程技術團隊

為了取得更好的統計遺傳學在線開放課程設計效果，聘請專業人員給課題組人員進行視頻錄制、頁面設計等方面的技術培訓。讓統計遺傳學在線開放課程平臺更具特色、更吸引人眼球。同時對課程內容及環節進行整體設計，使其內容豐富、精彩、精練，知識體系銜接緊密、結構合理，提高課程吸引力和授課效果，給人一種耳目一新的感覺，激發學生的學習興趣。

（三）建立統計遺傳學在線開放課程的實踐與創新平臺

篇9

關鍵詞：分子生物學；植物抗性基因；基因組

生物學研究正進入一個前所未有的新時期。大量數據、信息的獲得，使得生物學研究各領域均有很大轉變，其中包括植物抗性基因的研究。目前基因組研究已開始對植物生物學產生深遠的影響，再過數年，人們將從當前的描述性研究很快過渡到從已有的大量數據信息中提出假說，經計算機模擬分析，最后針對性地設計實驗來驗證新的基因分析方法。實驗將不再僅僅是分析基因――基因、蛋白質――蛋白質的相互作用，而是將獲取大量的RNAs，蛋白質和相關代謝物等數據。

1 植物抗性基因研究現狀

1.1 植物自身抗性基因以等位基因系和基因簇形式存在

經典遺傳學研究表明，在不同植物品系的同一基因位點上可能具有等位基因，這些等位基因對各種病原具有不同的特異性。此外，抗性基因往往在某一特定區域成簇存在。事實上，在特定的染色體區域常常不能分辨抗性基因位點上真正的等位基因和有關聯的成簇基因。利用具有不同抗性基因的植物進行雜交可以澄清這一問題。

1.2 植物抗性基因的作用機制

Flor是第一個在植物和病原中同時研究抗性遺傳的植物病理學家，他研究亞麻和亞麻銹病病菌之間的相互作用。通過這些研究，他提出了基因對基因假說。研究表明，植物和病原的遺傳組成和一株植物成功地進行防御是密切相關的。植物―病原相互作用的專一性是由病原的一個顯性無毒基因產物和植物抗性基因產物間相互作用來決定的。因此，這兩個產物之間特異識別是植物抗性作用的基礎。這種識別觸發了進一步的生理防御作用并導致超敏細胞死亡和對病原具有毒性的分子的積累。

1.3 植物抗性基因克隆

植物抗性基因的克隆目前主要采用轉座子標記和定位克隆的方法，迄今為止，用這2種方法已克隆出22種抗性基因，其中用定位克隆方法得到16種，用轉座子標記法得到6種。最近，有人又提出利用抗性基因類似序列（resistancegeneanalogs）通過PCR來特異擴增抗性基因的方法。

1.4 轉基因改良植物脅迫耐性的困難及改進措施

盡管轉基因改良植物脅迫耐性已取得一些進展，目前仍存在以下困難：目的產物表達量不夠或時空表達不協調；目的產物翻譯后修飾（加工或折疊）不適當，影響功能表達；目的酶所催化的代謝反應前體物質不足；細胞內目的酶活性受制于pH、溫度及鹽離子濃度等因素；有些目的表達產物對宿主細胞產生毒副作用等。進一步改進措施有以下幾方面： ①選用來自近緣物種的目的基因；②構建高效表達體系；③表達產物的胞內區域化；④增加目的酶催化的前體物質含量；⑤目的產物翻譯后修飾的調控；⑥抑制目的產物的副效應。

2 植物抗性基因研究趨勢

基因的研究是指在許多基因同時存在的基礎上對多個基因同時進行研究，分析各自與它們之間的結構與功能的相互關系。因而它至少涉及3個相關領域：結構基因組――主要關心DNA堿基序列水平上的基因結構；比較基因組――尋找種內、種屬間產生基因結構差異的分子基礎，以期獲取與目的性狀相關的基因；功能基因組――著重研究基因與其表達產物及功能活性的調控關系。結構基因組是其它領域的基礎，比較基因組為功能基因組研究提供等位基因，蛋白質組則是在蛋白質水平上分析基因表達的功能基因組研究的派生分枝。生物信息學是在前面3者研究的基礎上，獲取、整理、綜合分析提取大量已有復雜生物數據的新學科，對相關學科的研究有很大的推動作用。

基因組學（Genomics）的出現，使生物學研究進入一個新的時期，即由僅對一個基因的研究轉向在基因組規模上同時對大量基因的結構和功能進行系統的研究。無論從思想上還是技術方法上，基因組學已經影響生命科學的各個領域，植物的抗逆性研究也不例外。利用基因組學的方法，不但可以挖掘大量的抗性基因，對其功能進行詳細的研究，而且有助于全面理解植物的抗逆機理，為利用遺傳工程提高植物抗性提供基礎。

以基因組為研究對象的基因組學是常規的以基因為對象的分子生物學研究的一次飛躍。已有報道說明，基因組學方法在植物抗逆研究中的應用處于起步階段，但隨著基因組學研究的發展，我們獲得大量與抗逆性有關的序列信息和生物功能信息，從而對植物抗逆復雜性會有更全面的理解。植物的抗逆性能往往不是由單基因決定的，而是由一系列相關的直接或間接作用的基因形成一個復雜的調控網絡。在這個復雜的調控網絡中，任何一個環節都可能是至關重要的。因而對植物抗逆性的提高，尤其對一些屬數量性狀的抗逆性，僅靠轉移一個基因得到耐逆植物有一定的難度，轉入一系列基因也許是必需的，即利用基因組工程，而不只是基因工程來提高植物抗性。基因組學的研究為植物抗逆遺傳工程提供大量的全新基因，從而為抗逆育種提供了更廣闊的前景。

3 展望

我們正經歷一個快速發展的階段，與幾年前相比，已有許多那時想都不敢想的工具與能力。目前已開始從單個抗性基因的鑒定克隆轉移到抗性基因表型的全面分析。可以預測，在不久的將來，不用通過實驗鑒定，我們在計算機上通過序列比較和功能模擬分析，就能預測新克隆的抗性基因的功能。大規模的新方法、新技術的應用，將為我們獲取新抗性基因并使之變成可操作利用提供機會。

參考文獻

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篇10

【摘要】 抗生素的大量使用和濫用所造成的細菌廣泛的耐藥性迫使科研人員要加速尋找結構新穎的抗生素。抗生素作用靶點的發掘對藥物發現非常重要，本文綜述了近幾年來國際上運用基因組學、基因芯片等現代生物信息學技術，利用細菌體內的各種酶反應與理化特性，發掘抗生素傳統作用新靶點如脂肪酸合成酶、非傳統作用新靶點如雙信號轉導調控系統、群體感應器等的研究進展，這對新抗生素的發現具有一定的指導意義。

【關鍵詞】 抗生素； 新靶點； 耐藥性； 基因組學

ABSTRACT Widespread bacterial drug resistance originated from massive uses and abuses of antibiotics drives drug discovery in a remarkable speed path. At the same time， finding functional target of antibiotics was extremely important to the drug evaluation. Novel targets can be found through modern biological information technology such as gene chip technique and genomics， along with bacterial enzymatic reactions in vivo and the physiological characteristics. In this paper， we summarized some novel antibiotic targets from traditional bacterial functionality and nontraditional domains in these last few years， including fatty acid synthases， two-component signal transduction systems and quorum-sensing systems. These new research progresses on novel targets will be a positive strength in novel antibiotic discovery.

KEY WORDS Antibiotics; Novel target; Drug resistance; Genomics

1941年人類首次實現青霉素的工業生產，啟動了抗生素應用的歷史。隨后30多年的研究先后發現了β-內酰胺類、四環素類、氨基糖苷類、大環內酯類和多肽類、多烯類等幾大類抗生素，并成功地應用于治療各種病原微生物感染。科學界一度樂觀地認為，持續不斷地發現新抗生素藥物將最終使人們徹底擺脫感染性疾病。然而，隨后的40年，盡管藥物研究的投入越來越大，卻很少有新碳骨架化合物作為臨床藥物得以開發。近些年來，由于過度使用抗生素，特別是濫用抗生素，病原菌日益廣泛的耐藥性已成為藥物治療中越來越常見的問題［1～3］，人們迫切需要尋找新的抗生素藥物。

為了克服細菌的耐藥性，特別是多重耐藥性問題，人們需要運用新的思路去發掘新的抗生素。20世紀90年代以來，隨著基因組學、蛋白組學和生物信息學的迅猛發展，人們獲得了豐富的基因信息與數據，闡明了上千個蛋白新靶點。一些影響細菌生長和致病的關鍵基因的發現以及以此為靶點的相應篩選模型的構建是發現抗耐藥細菌的新抗生素的關鍵。本文綜述了近年來科學家們發掘抗生素作用新靶點所采取的方法、主要靶點類型和有關作用機制。

1 運用基因組學來開發抗生素新靶點

基因組學是為了闡明各種生物基因組中堿基對的序列信息，破譯相關的遺傳與功能而形成的一門基礎學科。目前，國際上已經完成了人類、多種細菌等微生物、多種昆蟲、多種嚙齒類動物的全基因組序列測定工作。從致病與非致病微生物的基因組序列與功能研究中發掘抗生素的新靶標，是生物信息學、病原微生物學和藥物化學等多學科綜合、交叉的研究領域，有關研究不僅開辟了藥物研究的新領域，也將為微生物及其活性產物的利用開辟新的研究熱點。目前運用基因組學開發抗生素新靶點的主要研究方法概括如下。

1.1 尋找細菌致病開放閱讀框

為成功研發新藥，人們不斷運用各種手段來篩選抗菌藥物作用靶點［4］，一般首先考慮以下三個篩選標準：①運用生物信息學尋找所有潛在藥物靶細菌體內保守的開放閱讀框(ORFs)；②發現一些只在原核細胞中出現，而不在真核細胞特別是高等真核細胞中出現的ORFs；③運用藥物靶細菌體內功能基因敲除技術來驗證這些ORFs是否決定了一個或多個病原菌的致病力。符合以上三個篩選標準的基因就是最佳的備選靶標基因。

Rosamond等［5］通過30多個微生物基因組的生物信息學分析尋找到了多個藥物作用靶點，這些靶點影響微生物的生存與繁殖，在病原菌中高度保守，而在人體內或者完全缺失，或者截然不同。他們將大腸埃希菌的4289個基因與七種呼吸道疾病致病菌(包括銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和肺炎鏈球菌等)的基因組進行比對，發現所有這些細菌中都有246個基因高度保守，其中68個基因人類缺失；經進一步比對發現，這68個基因中有34個功能未知，其中16個是非關鍵基因，另外18個則特別重要，包括喹諾酮和大環內酯抗生素的作用靶點。他們選擇這18個基因中的3個作為靶點基因用于藥物篩選，尋找治療呼吸道疾病的新藥，取得了很好的結果［5］。

1.2 確定關鍵基因的功能

采用各種遺傳變異方法確定未知保守基因的功能，如熱敏變異、堿基標記誘變、反義RNA系統表達以及功能基因敲除等方法［6］，以及鑒定蛋白質性質，確定其是否具有用于藥物篩選的潛力。

日本研究者從臨床分離到耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐萬古霉素金葡菌Mu50(VRSA)［7］，它們有70多個代表基因(總共2600個基因)與新的毒性因子有關，這些毒性因子能增強耐藥菌株對人的致病力，當然也是更為廣泛的潛在抗生素靶點。

1.3 闡明關鍵基因產物的功能

有研究者采用高通量基因組結構分析方法［8］闡明蛋白質X衍射結構，根據結構將它們進行分類，在一級結構基礎上進行折疊，考察二級結構，并預測三級結構與功能。也有人使用細菌基因芯片或基因表達圖譜［9］，評價不同條件下的mRNAs表達水平。通過不同濃度抗生素的作用，挑選出最敏感的基因。例如，在含有97%結核分枝桿菌基因的基因芯片上添加抗結核藥物，測試藥物對結核分枝桿菌基因表達的影響，了解關鍵基因產物的生物學功能。

1.4 通過基因體內表達確定靶標基因

作為基因學方法的補充，確定關鍵基因后，一般還要通過實驗來確定病原菌感染脊椎動物的必需基因，因為有時細菌在培養皿中生長的非必需基因可能是感染動物和人的關鍵基因。基因如何在體內表達和哪些基因是細菌致病所必需的，一般都要通過體內表達來確定［10］，細菌的基因雖然很多，但在感染動物時只打開特定基因來實現自我生存和繁殖，例如有的基因負責啟動生物合成和指導鐵離子螯合劑的重新攝取，因為所有脊椎動物宿主的胞內或胞外運鐵蛋白上都螯合鐵離子。除此之外還需考察篩選得到的抗生素在臨床上是否真正有效，以及耐藥菌株出現的速率是否降低。總之，通過對細菌基因組的深入研究，可以發現新的藥物作用靶點，使藥物更特異地作用于特定的位點。

2 對某些典型靶點的重新發掘

隨著基因組研究和對微生物細胞結構與分子機制認識的深入，新靶點不斷涌現，為抗生素的研發提供了新的途徑，使我們可以深入研究復合靶標的不同部位，以增強篩選的特異性，減少過篩量，提高篩選效率。在細胞壁生物合成、蛋白質生物合成和DNA復制與修復過程的傳統藥物靶點中還是有希望找到一些新靶點，這引起了研究者們的高度興趣。

2.1 抑制細胞壁生物合成的新靶點

細菌細胞壁生物合成，尤其是肽聚糖(PG)的合成是第一類天然化合物篩選靶點，也是傳統抗菌藥物最早的靶點之一，對這類靶點的合成途徑和抗生素作用機制的研究比較透徹。那么，針對抑制細胞壁和細胞膜合成是否還存在新的靶點？這里展示幾個具有開發價值的研究實例。

(1)葡萄球菌糖肽酶 在葡萄球菌PG層的生物合成中，肽鏈之間不是通過Lys3和D-Ala4直接相連，而是通過五甘氨酸橋聯［11］。主要的表面抗原蛋白、S.pyogenes的蛋白M、咽炎與皮膚損傷的致病因子和金葡菌的蛋白A都是通過一段保守的C端四肽(LPXT)和五甘氨酸橋共價相連。由于五甘氨酸是在fem基因指導下加入的，所以fem基因可以成為輔助藥物靶點基因，阻斷糖肽酶的作用，有望成為降低鏈球菌感染致毒的好方法。生物信息學分析表明，革蘭陽性菌基因組中除了fem基因外，還有多個糖肽酶基因。糖肽酶結構闡明后，加快了基于結構的藥物設計技術的發展步伐［12］。

(2)糖基轉移酶 多年來人們一直認為糖基轉移酶在二糖酰五肽單元聚合到PG鏈上起著關鍵作用，但由于缺乏實驗底物，膜的性質又不是很清楚，分離純化和結構表征比較困難［13］，沒能對之進行系統研究。基因序列分析表明，大腸埃希菌中有4種糖基轉移酶，而且在初級病原菌中數量眾多，有的是糖基轉移/轉肽復合酶，有的則是單功能糖基轉移酶。

Ye等［14］采用酶聯化學法，利用I型脂的類似物和糖基轉移酶MurG作用，獲得多種脂-二糖酰-五肽II型脂的類似物，并進行關于膜的糖基轉移酶實驗。如果能夠合成出較大的碳水化合物庫［15］，就能找到抑制糖基轉移酶的特異性配體化合物。半合成的N-芳酰衍生物(如N-氯二苯-萬古霉素和N-chlorebiphenyl-chloroeremomycin)對VRE菌的活性要比它們的糖肽類母體強80倍左右。由于這些N-芳酰糖肽類與N-酰基-D-Ala-D-Lac結合的強度沒有萬古霉素或Chloroeremomycin的牢固，有人認為，N-芳酰糖肽類進攻的是糖基轉移酶［16］。

2.2 抑制蛋白質合成的新靶點

在第二類傳統抗菌藥物靶點即蛋白質合成抑制藥物的靶點中，我們也有機會發現新的抗生素靶點。這方面的研究以Belova等［17］和Huntington等［18］的工作比較突出，其中肽脫甲酰酶已經成為用于新藥臨床實驗的少數幾種抗菌靶點之一。

(1)核糖體作為抗生素的靶點 抗生素一般結合的是16S或23S rRNA分子中的關鍵位點。23S rRNA第五結構域包含了從肽酰轉移酶活性位點到初生肽鏈［19］的轉運出口肽酰轉移酶中心，還包含紅霉素(erythromycin)和泰洛星(tylosin)的結合位點［20］。第五結構域還與其他抗生素如鏈陽菌素(streptogramin)和林肯酰氨克林霉素(lincosamide clindamycin)等的結合位點有部分重疊，所以在研究結構時可能找到與RNA中一個或多個亞基結合的新抗生素。

天然產物晚霉素(eveninomycin)的靶位也是非典型核糖體結合位點［18］。晚霉素是一種兩端結合著酚酰羧基酯的糖，與23S rRNA的89號和91號螺環結合，阻止起始因子IF2蛋白與之結合，終止起始氨基酸fMet tRNA的轉運。

以硫鏈絲菌素(thiostrepton)、諾西肽(nosiheptide)和GE2270A為代表的天然抗生素硫蛋白族［21］通過阻斷一種核糖體伴侶蛋白而抑制蛋白質生物合成。硫鏈絲菌素和諾西肽攻擊23S rRNA的A1087結構域，同時阻斷延長因子EF-G在肽酰轉移酶位點與核糖體的結合。GE2270A通過攻擊GTP酶EF-Tu因子來阻斷核糖體的肽酰轉移反應。從這個基礎上研究EF-Tu的結構對抗生素的結構與性能優化是非常有意義的。

(2)肽脫甲酰酶與甲硫氨酸氨肽酶 細菌在起始因子IF2的作用下，以fMet tRNA作為起始氨酰tRNA開始蛋白質的生物合成。甲硫氨酰的N-甲酰化保證fMet在肽鏈形成時作為電子供體而非受體，加強了合成起始的方向性。當延長肽鏈出現在核糖體上時，肽脫甲酰酶(deformylase)酶解掉其N-甲酰基［18］，然后甲硫氨酸氨肽酶(methionine aminopeptidase)水解脫去甲硫氨酸的N端。通過大腸埃希菌的基因敲除分析，認為肽脫甲酰酶和甲硫氨酸氨肽酶是蛋白質合成所必需的，所以它們可以作為抗菌劑的有效靶標。肽脫甲酰酶是一種金屬蛋白酶(metallopeptidase)，可被具有金屬螯合作用的配體［22］譬如天然的二肽酰-羥氨酸-放線酰胺素(dipeptidyl hydroxamate actinonin)中的羥氨酸所抑制。這些化合物常用作細菌抑制劑而非殺菌劑，雖然可以降低變種的適應性，但變種出現的頻率仍然較快，所以尋找更廣譜長效的肽脫甲酰酶抑制劑將成為研究目標。

(3)氨酰-tRNA合成酶 天然產物莫匹羅星(mupirocin)能通過抑制Ile-tRNA合成酶的作用使異亮氨酸不能參與蛋白質合成。莫匹羅星與金葡菌的Il-tRNA合成酶的復合物的分子結構已經闡明［23］，證明它與活性位點配位，并與Ile-AMP相互競爭。對其他細菌和真核生物tRNA合成酶進行篩選，發現有的化合物對純化的tRNA合成酶具有一定活性，目前暫時還沒有發現具有臨床價值的類似物，但仍然不失為一個有潛力的靶標。

2.3 DNA復制與修復的新靶點

DNA是生物的遺傳物質，具有穩定、多樣和自我復制的特點。DNA的雙螺旋結構和半保留復制保證了DNA在進行準確地復制時，將遺傳物質正確地傳給下一代，同時保持核酸鏈的完整性。DNA實現其功能時需要一系列酶參與反應，包括DNA回旋酶。DNA回旋酶是細菌特有的一種拓撲異構酶，其抑制劑在臨床上的應用也越來越廣。

(1)DNA回旋酶：新喹諾酮和非喹諾酮的作用靶點 DNA回旋酶是喹諾酮抗菌劑的典型靶點，也是新喹諾酮分子的作用靶點。新喹諾酮分子層出不窮，包括群體獲得性肺炎中抗青霉素肺炎鏈球菌的抑制物左氧氟沙星(levofloxacin)等。曲伐沙星(trovafloxacin)在1998年獲批，但因為肝臟毒性而限制臨床使用。8-甲氧基喹諾酮莫西沙星(moxifloxacin)和加替沙星(gatifloxacin)在1999年獲批，它們抗葡萄球菌活性大大增強，可以用于治療群體獲得性肺炎、支氣管炎和鼻竇炎［24］。各種含有橋頭N，具有2-吡喏酮環系統的喹諾酮對抗喹諾酮的變異回旋酶仍然具有抑制活性。據報道，克林沙星(clinafloxacin)和西他沙星(sitafloxacin)對回旋轉亞基GyrA和拓撲異構酶第Ⅳ結構域ParC的突變型均具有抑制活性［25］。

(2)RNA解旋酶 在RNA的代謝動力過程中，RNA與DNA、RNA與RNA、RNA與蛋白質之間能形成并且必須形成具有特異性和較高動力學效率的過渡態復合物。一定長度或全長RNA經過折疊、展開和重新折疊，才能實現其生物功能。能將RNA分子展開的酶稱為RNA解旋酶(helicase)［26］，它利用NTP水解釋放的能量來驅動譬如雙鏈RNA的展開。RNA解旋酶有時作用于原核生物的基因轉錄、核糖體生物合成、翻譯起始和RNA降解等過程，有時也作用于真核生物的mRNA編輯、拼接和RNA向細胞質的轉運。分析認為，既然RNA解旋酶是細菌功能所必需的，那么它可以成為抑制物的作用靶標。

3 其他非傳統的抗生素作用新靶點

前面提到某些新靶點是通過基因組學方法尋找，或從傳統靶點中發掘的，除此之外，細菌的酶系反應和生理過程也可作為抗生素的靶點［27］。目前已發現幾百個新靶點，通過一系列高通量和自動化的篩選實驗以及對同簇基因產物的復雜性分析(如某些基因產物在動物體內是毒性因子，在培養基上卻不能產生)，可以確定其功能并用于藥物篩選。以下介紹幾個比較典型的非傳統靶點。

3.1 脂肪酸合成酶

脂肪酸的合成對細菌的生存與發育至關重要。研究結果表明，在I、II構型亞基中的脂肪酸的合成與聚酮類天然產物的生物合成途徑非常相似。在真核細胞中的I型酶系中，脂肪酸合成酶(FASs)由多個亞基組成，而大多數細菌的II型酶系中FASs則為單個亞基，找到特異性抑制物是完全可能的。具有抑制FASs活性的天然產物淺藍菌素(cerulenin)，通過烷基化作用使FASs中的酮基合成酶經過環氧化物的開環而造成親核性Cys活性位點失活。選擇性更高的抑制物對細菌酮基合成酶會更有效。

最近，有人發現三氯森(triclosan)類抗菌防腐劑可阻斷大腸埃希菌烯酰-ACP還原酶Fab I催化脂肪酸合成酶的烯鍵飽和作用，這說明FASs是較好的靶點。

3.2 異檸檬酸裂解酶

結核分枝桿菌的各種脂肪酸代謝過程都有可能成為新靶點，這是因為碳的轉化方向是從脂肪酸經過乙醛酸轉化為葡萄糖。盡管乙醛酸分支酶［如異檸檬酸(isocitrate)裂解酶］對平板培養的結核分枝桿菌的生存關系不大，但對動物體內的毒性至關重要［28］，這表明病原菌在體內感染時依靠脂肪酸作為能量來源。這是一個毒性篩選的例子，但同樣可以發展為潛在的新靶標。以前沒有報道過異檸檬酸裂解酶的選擇性抑制物，可以對它進行藥物篩選研究。

3.3 雙信號轉導調控系統

細菌通常使用雙信號轉導系統(two-component signal transduction system)來感受體外瞬時化學變化(圖1)，其中兩個蛋白分別作為感受器(sensor)和響應控制器(response regulator)［29］。感受器是一種典型的跨膜組氨酸激酶，響應控制器是一種DNA轉錄激活子(activator)。感受器的細胞周質環型蛋白和跨膜蛋白感受到配體后，引起感受器胞質組氨酸激酶結構域中組氨酸活性位點的自磷酸化，然后磷酸官能團從P-His轉移到響應控制器氨基酸亞基上的一段保守的Asp-β-羧基上。響應控制器P-Asp的形成會引發DNA作用域的變構效應，然后激活子阻遏目標基因的轉錄(假如它的基態是阻遏物)并啟動響應程序。

VRE菌的VanS-VanR雙信號轉導系統是一個典型的感受/傳導系統，雙信號轉導系統對細菌毒性起

圖1

雙信號轉導系統示意圖(根據文獻［30］重繪)

決定作用。有人使用基因組學的方法來表征肺炎鏈球菌的雙信號轉導系統，并檢測到14個雙信號基因對［30］。如果金葡菌體內雙信號轉導srhS-srhR基因對遭到破壞，將導致大鼠腎盂腎炎(pyelonephritis)模型中金葡菌突變株的生長降低1000倍。mRNA序列分析表明雙信號基因對關系到病原菌的生長能力，特別是當病原菌從氧濃度低的環境轉向厭氧代謝時。金葡菌兼性厭氧的特征，使得它能進入深層組織進行持續的感染。這些結果為分析8對雙信號感受/傳導基因在致病機制中的特殊作用提供了基礎，包括黏附和自融過程等等，并能幫助我們優選出最佳的雙信號基因對作為抗菌靶標。

3.4 群體感應器的生物合成

細菌使用群體感應系統(quorum-sensing systems)來感受群體的密度，做出基因介導的信號響應并產生毒性因子，包括抗生素。金葡菌的agr基因座構成了全面毒性響應的一個方面。如圖2所示，由5個基因組成的agr操縱子指導合成的AgrC和AgrA蛋白，分別是跨膜感受激酶和響應控制器［31］。AgrB是一個多肽輸出泵，作用于蛋白水解過程和自誘導肽(AIP)的成熟前體肽(agrD基因產物)的分泌。蛋白水解和分泌后，AIP就成為了AgrC的外來配體，開啟發育細胞和臨近發育細胞agr基因座的進一步轉錄。密度依賴型群體感應作用是由AIP分泌濃度及其特異受體AgrC的多少來決定。

當細菌群聚生長為生物膜，譬如在住院患者的各種導管內，群體感應系統就會成為細菌形態和信號轉導的決定因素。在這種情況下，使用抗生素都難以控制細菌，因為此時細菌多糖被膜的滲透性極差［32］。所以，更直接有效的抑制作用就是阻斷群體感應器(quorum

圖2

金葡菌的群體感應系統(根據文獻［32］重繪) sensor)的生物合成，一些信號分子可激發生物膜的形成。如果一個多肽起信號分子作用，那么它就是產生自誘導前體肽的AgrD酶，或具有AgrB輸出泵的蛋白酶活性。一般情況下，革蘭陽性菌以酰基高絲氨酸(acylhomoserine)［33］內酯為細胞間群體信號感應分子，所以可將LuxI族合成酶作為靶標。Pseudomonas stewartii內酯合成酶的X衍射結構已經闡明，為藥物的結構設計提供了好的開端。

3.5 外排泵作為靶點

為降低氟喹諾酮(fluoroquinolone)的外排，有人針對銅綠假單胞菌的MexA-MexB-OprM、MerC-MexD-OprJ和MexE-MexF-OprN外排泵(efflux pump)系統和大腸埃希菌的AcrA-AcrB-TolC外排泵，開展了外排泵阻遏劑的篩選。能阻遏外排泵的抑制物，可以降低細菌的內源性耐藥和獲得性耐藥，也可以降低回旋酶耐藥變種出現的速率［34］。植物天然產物5′-甲氧基大風子素D(methoxyhydncarpin D)就是這種具有阻斷氟喹諾酮泵出的活性阻遏物［35］，由于改變了外排泵的結構而引起功能與活性的變化。類似地，四環素的結構修飾物氯丙硫(chloropropylthio)四環素，可以阻遏Tet外排泵蛋白。新出現的甘氨酰四環素(glycylcycline)也是Tet外排泵蛋白阻遏物，它們甚至對具有核糖體保護蛋白因子TetM和TetO的菌株都有抑制活性［36］。同樣我們還可以開發出其他抗生素外排泵阻遏物。

4 展望

由于新藥研發費用的不斷增長和新結構藥物發現數量的逐年減少，藥物作用新靶點的研究已成為藥物相關研究的熱點。隨著化學信息學和基因組學的興起，新藥的研發模式也將發生革命性的改變。人們可以利用已知靶點的三維結構進行合理設計，實現基于結構和作用機制的藥物設計，也可對未知結構的新靶點進行藥物分子藥效團的統計分析，進行高通量篩選并發現新的先導化合物，加快新藥研發進程。總之，研究者們采用各種新技術、新策略發掘新靶點，推出新的高效抗生素藥物，為人類重大疾病提供突破性治療，最終將帶來巨大的經濟效益和社會效益。

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