導語：如何才能寫好一篇那就是愛，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

五年六班

杜曉琦

7月8日下午，我從書店出來，只見傾盆大雨是下個不停啊！就連書店門口都淹成了一條小河。這時已經(jīng)6點半了，在書店門口的我焦急萬分，正巧有沒帶任何雨具，還騎了車來，心想：這下糟了，什么都沒帶，還帶了這么一大包的作業(yè)來，有什么用啊！反而拖我后腿嘛。

后來，我還是挽起褲管，光著腳丫穿過馬路去學校牽車。當我走到馬路邊時，道路兩旁的水長得非常快，又很急，瞞過了半個小腿兒，險些兒把我沖倒。

我騎著車，從學校后門冒雨直沖回家，在路上，雨不斷地襲擊我的全身，又像一個又一個的導彈向我襲來。一到新村小學那一條路段，積水就足已淹沒一個一歲小孩。雨不停的下著，我坐在自行車上，就好似坐在一葉方舟上漂泊，又好像耍雜技一般，一會兒歪到這邊；一會兒倒向那頭；一會兒又向前傾。

路多難行呀！每前進一步都很艱難！但是，越是艱難險越要前進，騎著自行車往前沖，“沖啊??”我大聲喊道。當時，我還發(fā)明了一個蛙泳式騎車法，因為是腳都是完全浸在水中的，所以就讓腳以蛙泳式使車更快的前進。一轉(zhuǎn)眼就被沖道廣平倉的一家米店旁。雨越下越大，水越長越高，根本無法回家，只好停車去找公用電話。我淌在水中，漫步前行，看到水面上漂浮著一些很惡心的東西，比如：死蟑螂，，死老鼠，木塊等垃圾。一不小心，腳拌到了一塊大石頭上，絆倒在湍急的黃泥水中，就要被水沖走。在這千鈞一發(fā)的時刻，幸巧米店老板救了我，把我拉了上來。被拉上來時，我的衣服濕漉漉的，渾身發(fā)抖，牙齒“咯咯咯”地在打仗，我多么想回家換上干衣服，溫暖溫暖我這瘦弱的身軀。哎，這真是老天爺在捉弄我，被困在米店，想回家又回不了家，大人來家又來不了，真是‘恨鐵不成鋼’啊！

正巧，遠處來了幾個巡邏的民警，米店老板看到了，放聲大喊：“嗨，前面的民警，這里有個小孩，先把她送回家吧！”又對我說“快回家吧！別著涼了，這是要感冒的！”這句話，使我的心頓時暖了些。聞訊趕來的民警攙扶這我往回家的路走去??走到半路上，突然停電了，那時天很黑，雨又下得很大，我邊走邊打著哈欠。因為水太急了，所以我差不多是高抬腿式走路的。只見一張方桌隨誰飄來，重重地撞了我的大腿和腳趾一下，我忍這痛繼續(xù)前進，民警似乎看出了什么，把他的風衣披在我肩頭，說“再忍忍，就快到了！”這時我感受到了 民警無私的愛，這愛使我溫暖。不一會兒，我終于到了，到了小山新村的大門前，我興奮地向民警敬了個禮，奔回了家！

篇2

與己尾隨 去承載背影

有沒有一種深凝的眼神

會劃破天空

讓她辛酸

有沒有一種深刻的情感

劃過記憶

又仿佛成了生活

愛 離去了

卻 感覺還在

那是 因為內(nèi)心不停顫動

永恒吧！ 你走去的遠方……

那將會是靈魂空間的生還

已習慣 心里掛念著你

已習慣 無時無刻心疼著你

已習慣撫摸著你的頭 叫你小乖乖……

曾經(jīng) 每一次用力的牽你

都是對你深深的愛

今夕

每一次想你的時候

心都 依然 那么用力

憂傷啊！！！

要丟棄 一個熟悉的世界

永恒吧

顫動的靈魂在深深的思索

走入另一個世界

就如愛你一般

去撫摸

那些貧窮和需要關愛的人們

篇3

具體分別為：

1、百變歌姬：濱崎步；

2、傳奇歌姬：安室奈美惠；

3、性感歌姬：幸田來未；

4、國民歌姬：島谷瞳；

5、魅惑歌姬：鈴木亞美；

6、全才歌姬：大冢愛；

7、治愈歌姬：持田香織；

8、清新歌姬：奧村初音；

篇4

我狠狠地瞪了他一眼，可這家伙視而不見，依然坐在那看電視模特大賽。這個節(jié)目已經(jīng)重播3遍了，可他還是盯著電視里的模特。

上個月，我的女上司因為老公長期不回家而離婚了，而女朋友的老公幾天前也被發(fā)現(xiàn)有外遇，難道做老婆的都是這么命苦，抵不過時間的摧殘？男人婚前婚后怎么差距這么大呢？看著花園里泛黃的枯草，我有一種悲涼的感覺。突然，兩只貓跑了過來，它們在草地上嬉戲，互相追趕親昵，其中一只貓還伸著懶腰，打個滾。它們在夕陽下的幸福、快樂的神情，讓人覺得十分溫暖。而我，跟老公有多久都沒有像這兩只貓一樣快活地擁抱了？即使功課，也是例行公事。對，我現(xiàn)在必須把老公漠視的念頭消滅在萌芽之中，我的家庭絕不能發(fā)生情感悲劇。

老公覺得我一定會跟往常一樣，只要一生氣睡覺時就會給他一個冰冷的后背。他倒樂得我不去“騷擾”他，然后酣然大睡，讓我的火氣自消自滅。但那天，他一打開臥室門就發(fā)現(xiàn)自己錯了！出現(xiàn)在他面前的是一只妖嬈的“貓”，頭頂皮紋雙耳發(fā)帶，豹花低胸緊身內(nèi)衣，半露白頸細胸，高臀低腰輕俯在床，充滿誘惑的眼神，一臉的嫵媚中還帶著絲絲嬌柔的鼻息。老公立刻驚呆了，瞬間眼神發(fā)亮，仿佛變成了一只饑渴的野貓。他弓身上床，有力量的身軀半擁半抱，給我一個體貼的依靠。他溫柔的手臂在我的蠻腰與嬌胸間游移，彈性的身體輕彈慢跳、前騰后躍、左閃右扭與我的美臀共同譜寫交響曲，仿佛夕陽下一只貓與另一只貓的親密糾纏。我們互相擁抱、按壓、輕咬，互相交付、給予融合……溫暖的被褥、彈性的大床和我貓一樣柔軟的身軀，與老公的激情和努力相得益彰。他貓咪一樣的輕喚更如漫天花香，讓我迷醉勢不可擋，最終一切在巔峰中落下帷幕。而我這只呢喃的小貓，也安靜地趴在老公的肩頭美美睡去。

第二天清晨，當我睜開眼睛，老公已經(jīng)做好了早餐。他說，為了獎勵我這只“饞貓”，以后早餐都由他來做。其實，男人就這么簡單，回報總是來的現(xiàn)世及時，他滿心歡喜就會陽光燦爛。從這以后的日子，我時而用黑筆給熟睡的老公畫出貓一樣的胡子，時而偷偷在廚房里走著貓步吸附他的身體，時而如貓咪一樣蜷縮在沙發(fā)上用誘惑的眼神向老公索吻，當他焚身，然后我再如貓一樣地逃開……幾番逃離，最終被這只“公貓”勝利俘虜，抱在懷里，大戰(zhàn)盡酣。如果以前我跟老公的只是一種填飽肚子的喂養(yǎng)，而現(xiàn)在我們經(jīng)常享用情調(diào)十足的盛宴。夜晚沒有陽光，燦爛的星星是引爆兩只貓激情最理想的武器。

又一個周末，電視里又在播放模特大賽的比賽實況。那些美女們高挑美貌，讓我看得都直流口水，我便喊正在廚房做飯的老公來看。他說，我正給自己家的“貓”備食，哪有時間看那些電視里的模特走貓步！我偷偷笑了，不懂救贖自己已褪色愛情的女人是傻子，有方法救贖暗淡時光的女人才是天使。女人一定要像花一樣努力綻放，即使老公的腳步已經(jīng)挪移，但彌留的香氣總會讓他停下腳步更珍愛自己。

篇5

1

第一次看到她，她正在一個房間里舞蹈，舒緩的輕音樂，有些頹廢，有些孤單，還有些曖昧。房間里沒其他人，就她自己。干凈的木質(zhì)地板，她穿著粉色的薄紗吊帶裙，光著腳，慢慢地搖擺著。她伸展著雙手，好像懷里抱著一個英俊的情人。房間里的風扇吹著她短短的裙擺，露出白色的底褲，撩撥得我渾身是汗。后來，她慢慢褪去了身上的薄紗，滑潤的肌膚，曼妙的身姿，在我的瞳孔里漸漸放大，仿佛自己也身置其中，與她一同起舞。我的手不由自主地觸碰到自己的身體，欲望正一點點從各個部位襲來。

而她，仿佛應和著我的節(jié)奏，停止了舞動，躺在白色的床單上開始扭動自己的身體。濃密的黑發(fā)鋪在偌大的床上，如一朵黑色的玫瑰，慢慢地盛開。她開始撫摩著自己的身體，就如我的手，帶著電，火辣辣地在皮膚上滾出花來。她的動作越來越大，伴隨著音樂的部分她的聲音也宛如一首婉轉(zhuǎn)千尋的歌，低落上揚著，直到身上有亮晶晶的汗珠滾下，然后緊繃扭動的雙腿終于伸展開來。這時，音樂終止，而我，也大汗淋漓，仿佛完成了一段奇妙的旅程。

躺在汗?jié)竦牡匕迳希挠白愉佁焐w地而來。我昏昏沉沉睡著，一覺醒來，房間里已漆黑一片，夜，不知不覺中來臨。

我打開燈，懶散地找些方便面煮來吃。看著水冒著泡，由細微的一點到沸騰的一片，我又忍不住想到她。就在這時，我又聽到聲響，那種動靜應該不是一人，我顧不得面，又湊過去看。此時，她赤條條的身上正壓著一個肥壯的男人，男人的臀部在燈光下擺動，白得直晃眼，她的臉埋在白色的床單里，看不出任何表情。偌大的床仿佛大海里的一帆小舟，在男人的使勁顛簸里如遇到狂風暴雨般快要支離破碎的樣子。男人不顧她的感受，雙手亂抓，只顧著沖刺，她粉嫩的背上頓時出現(xiàn)紅紅的抓痕。很快，男人就坍塌在她的背上，如一條死魚滑下來。她下床，無事一般坐在電扇前，海藻般的長發(fā)揚起，而我這邊海浪又撲面而來。

這就是我的見聞，在我搬到這間房子的第三天，無意發(fā)現(xiàn)的一個小洞讓我看到了隔壁的一切。后來，我知道她叫嵐，那個男人在床上這樣叫她。

2

她不工作，整天呆在家里，幾乎足不出戶。吃的用的，男人差不多隔兩天就會買一些過來。男人一般都是傍晚的時候來，開著車，而車總是停在弄堂外。他也從不帶她出去，來了就鉆進門，直接爬上她的床。她從不看他，而他也仿佛特別熱衷于突然襲擊的方式。有時，他進來的時候，她正在睡覺，他也不說話，三下五去二，就直奔主題。她仿佛習慣了這樣的對待，木然地應對，被動地接受。

他們很少說話，他的聲音也大部分來源于床上，而她，在他離去后，洗手間里的水就嘩嘩響起。

我想，她一定不愛他，或者她只是他包的女人，或者她只是貪圖他的錢吧。

她的衣柜里有很多漂亮的衣服，只是他走后，她才穿在身上，然后在舒緩的音樂翩翩起舞。舞蹈很優(yōu)美，仿佛她只在一個人的時候，腳步才如此輕快。在音樂里，她會再一次把自己舒展來，一個人陶醉在自我的世界。

我不上班， 把觀察她作為我生活的一部分。我有時感覺自己有些下作，曾試圖堵上耳朵，把那個洞緊緊地粘住，但她的影子仿佛被敲進了腦海，隔壁有一點聲響，我就迫不及待把耳朵貼上去，然后把那個洞重新撬開。

夏天的日子，悶熱。我的心開始浮躁，心情一天比一天糟糕。每當看到那個男人壓在她的身上，我就有沖進去把他拉起來狠扁一頓的沖動。而她，也多次出現(xiàn)在我的夢里，琴瑟合鳴。醒來，悶熱的空氣席卷而來，心里莫名升騰起怒火，灼燒著我的身體。

我被她莫名的吸引，那種感覺是從未有過的。我想，她需要拯救，不論是身體還是心靈。突然某一天，我覺得自己有了一種使命感，不知是欲望作祟還是男人的英雄主義，讓我蠢蠢欲動。

3

就在那天晚上，天氣尤其悶熱，仿佛要下大雨似的。那個男人已經(jīng)一個星期沒來了，我躺在床上翻來覆去睡不著。

我又撬開那個洞，她的房間還是那樣的音樂，她趴在床上睡著，風扇吹起她細薄的裙子，讓我在房間里走來走去。最終，理智開了小差，我跑出門去。外面很黑，沒什么人。我推下她房間的門，竟然開了。我小心翼翼地走進去，輕輕關上門。站在她床邊的時候，她還沒反應。看著翻滾的裙子下面她光潔的皮膚，我不顧一切地爬上了床。她依然趴著，面掩在床單里。我把男人的行為熟稔于心，學著男人的樣子，不敢面對真實的臉。匆匆完事后，我又學著男人的樣子離開。

回到隔壁，我覺得自己很不男人，說是拯救，而我最終做了竊玉偷香的人。透過那個洞，我看到她抱著雙膝在流淚，眼淚順著潔白的面頰往下滑，流在白色的床單上，如外面下起的雨。這讓我更加感到自己的可恥。

我不知道她是否感覺到是另外一個人走進了她的房間，我不能面對她。我把那個洞重新填了起來，我想自己應該找個工作，或者我應該離開這個地方。

隔了天，隔壁的動靜又來了。這次，和往常不一樣，我忍不住看去，男人正在打她，打過之后又抱著她說愛她，她沒什么表情，依然淡淡的樣子。我突然想到自己，自己不是也做著同樣欺凌的行為？

男人走后的那天晚上，我又走進了她的房間。親吻她的時候，她突然扭過頭來。我忙亂不知所以，而她淡淡地問我，上次是你吧。我不知道該如何回答，我撫摩著她被打青的眼角，說，為什么不反抗呢？她湊上來，吻住了我。

我想，她是渴望愛的，她抱著我的時候，我第一次感覺到她的無助和需要。她不問我從哪里來，也不問我為什么來，只是狠狠地抱緊我。

后來，我告訴她那個洞，她沒說話。我叫她嵐，她說還是我叫樂吧，音樂的樂。

我說，我喜歡看你跳舞，舞姿特別美。她說，好多年不跳，生疏了。

我抱著她旋轉(zhuǎn)，隨著音樂，我仿佛跳進了天堂。她第一次笑了，很美，也很憂傷。

自此，只要男人不在，就是我們約會的時間。一次，我說，跟我走吧。她點點頭，又搖搖頭，沒有說話。

4

還沒等我弄明白她點頭搖頭的意思，小婭就挺著大肚子尋來了。

小婭說，劉天明，孩子是你的，你要負責。

我不知道該如何對小婭解釋，不是我不負責，而是我過不了她需要的日子。我只是她爸爸手下的一個小職員，她的喜歡讓我感覺到負擔，我覺得我們不是同類人。

面對她的示好，我只能逃避，并裝出一付玩世不恭的模樣來。我說，玩玩可以，但不要試圖改變我。我以為她會對我失望，然后落荒而逃，沒想到，她說，好啊，我們玩玩吧。

只一次，就玩出了火，小婭說她懷孕了。而我，只能悄然離開公司，選擇蒸發(fā)。沒想到，還是被逮個正著。

和小婭在門口糾纏的時候，樂開了門。看到我們，又關上門。

我對小婭說，讓我想想吧。小婭走了，回頭的時候狠狠地說，劉天明，孩子是你的，你逃到哪里我都能把你找出來。

我把自己鎖在房間里整整一天。再見樂的時候，她說，其實愛一個人要用很低很低的姿態(tài)，別因為自己的自卑傷害了愛你的人。

我說，樂，我們走吧，我們才是同類人。

她大笑著說，其實我只是和你玩玩，為了打發(fā)寂寞。你倒認真了？

你愛他嗎？他打你，連在床上都不看你的臉，你覺得他愛你嗎？我問。

愛。她堅定地說。不管他怎么對我，我都愛他。他不看我，叫我另外的名字，那是他走不出對妻子的愧疚，他妻子叫嵐。我愛他，所以寧愿做他的替補。另外，他能給我豐衣足食的生活，你能嗎？

我看著她，仿佛看到了不認識的人，我想，我是看錯她了，她只不過找我做他身體的替補，而我卻荒唐地認為我能拯救她。說到底，我們只不過是彼此逃避現(xiàn)實的結(jié)果，欲望的補充罷了。

三天后，我隨小婭離開了那個地方。我想，至少，小婭是愛我的，更何況，我需要對孩子負責。

那天，她的門一直沒開。

5

我和小婭隆重舉行了婚禮。幾個月后，孩子出生，我想我的生活也就這樣平穩(wěn)安逸地過下去了。

不久，一個偶然的機會，讓我知道小婭懷的孩子并不是我的，那所謂的親近和喜歡只是為了她的肚子和名譽，而我莫名其妙做了頂缸爸爸。

我沒有聲張，時間教會了我隱忍，我也不再相信什么愛情。我更加努力地工作，出色的表現(xiàn)，我成了小婭爸爸公司最年輕的經(jīng)理。

三年后，我和小婭平靜分手，并開了新公司。

一次偶然的機會，在一個洽談會后的晚宴上，我碰到了那個男人。他的臂彎里，挽著一個精致的女孩，不是她。

篇6

其實很久以來，很多的網(wǎng)球迷已經(jīng)習慣甚至愛上了李娜這種直爽、有一說一的性格，然而這樣一番話還是在中國大陸網(wǎng)絡上激起了一番爭吵。但細細想來，李娜的話并沒有什么問題，因為她正在以個人身份參加職業(yè)巡回賽，而不是在代表國家隊參加奧運會或者聯(lián)合會杯的時候來說這些。就事論事，一個職業(yè)球員在參加一場商業(yè)運作賽事的時候這么說沒錯。而從網(wǎng)管中心單飛后李娜的身份就是一名職業(yè)球員，她這么說并不代表她不愛自己的國家。

近年來，越來越多的人提出“讓體育回歸體育本質(zhì)”的呼聲，有意無意問把“為國家比賽”和“為個人比賽”而對立了起來，其實毫無必要。以李娜法網(wǎng)折桂來說，李娜站在了羅蘭加洛斯的球場上，一方面她為奪取第一個大滿貫，另一方面她中國人的身份也吸引了大量中國觀眾，李娜的奪冠也讓他們感到高興和自豪。“讓體育的歸體育”，的確是個美好的愿望，因為它確實能做到的更多，撫平戰(zhàn)爭的創(chuàng)傷、團結(jié)國家精神……

體育雖然不能回歸到純粹的體育，但也不應該承受更多的體育以外的東西。中國體育長期以來就代表國家、代表人民，無形中給了運動員莫名的壓力。1997年金州“十強賽”，為了國家、為了人民沖擊世界杯，限制隊員日常外出，最終場上隊員心理壓力過大，技術動作變形。最近的例子就是2010年冬奧會，周洋奪冠后沒有“感謝國家”就遭到了體育總局領導的批評。當場上的運動員想的不僅僅是比賽，還有其他雜七雜八的東西，自然很難保證為了國家、為了人民爭取些什么榮譽?

篇7

1 長鏈非編碼RNA概述 

1.1 非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)與分類 

19世紀初，人類基因組計劃研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成人體基因組的堿基對中，有約98%的核酸序列不編碼蛋白質(zhì)，研究者曾一度認為它們是“無功能序列”，但是現(xiàn)階段，研究結(jié)論日漸傾向于這些無編碼蛋白質(zhì)的核酸序列能夠在高等物種體內(nèi)以特異性方式轉(zhuǎn)錄成核糖核酸（RNA）且這一結(jié)論日漸被證實，而這些不具備蛋白編碼潛能的RNA轉(zhuǎn)錄本即被稱為非編碼RNA。 

非編碼RNA具有很高的異質(zhì)性，尤其是在序列和結(jié)構(gòu)上，目前，非編碼RNA參考生物學功能、亞細胞定位、是否有poly結(jié)尾等要素可分為多種，長鏈非編碼RNA是依據(jù)轉(zhuǎn)錄本長度進行劃分的，同組核算序列還有小分子非編碼RNA。 

1.2 長鏈非編碼RNA的定義與特點 

長鏈非編碼RNA通常是指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。這一物質(zhì)組織表達譜廣泛，對比mRNA，其細胞表達特異性強，但表達豐度不高。長鏈非編碼RNA多存在于亞細胞結(jié)構(gòu)中，尤其以細胞核中定位最多，依線粒體基因組編碼不同可分為多種，如，IncND5、IncCytb等均由3個線粒體基因編碼。長鏈非編碼RNA與同類物質(zhì)相比，序列相似性同intron區(qū)域類似，但相似性不足70%，序列保守性偏低。但是其啟動子區(qū)域保守型通常高于蛋白編碼基因。 

2 長鏈非編碼RNA在食管鱗癌中的研究進展 

2.1 長鏈非編碼RNA與腫瘤間關系 

長鏈非編碼RNA在發(fā)現(xiàn)之初，曾被研究者當作轉(zhuǎn)錄噪音，但隨著現(xiàn)階段基因領域研究不斷地深入，對長鏈非編碼RNA的認識已經(jīng)由“無功能序列”轉(zhuǎn)變到參與生物學進程中來，尤其是機體生理、病理之中。Wapinski O、Esteller M等學者研究證實，鏈非編碼RNA異常可導致腫瘤類疾病，雖誘發(fā)機制尚不明確，但長鏈非編碼RNA在許多腫瘤中兼具致癌、抑癌功能這一結(jié)論已經(jīng)初具苗頭[1，2]。基于此，探究腫瘤形成發(fā)展這一過程中，長鏈非編碼RNA的分子生物醫(yī)學論文機制對于臨床探究癌癥治療方法而言意義重大。 

2.2 長鏈非編碼RNA在食管鱗癌中的研究 

2.2.1 長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1 

每年，全球新增食管癌患者多超過40萬例，為提高食管癌臨床診斷水平，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，臨床需進一步研發(fā)分子標記物，為臨床診斷食管癌提供依據(jù)和參考。目前在食管鱗癌的臨床科研中，僅有少數(shù)長鏈非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)與該疾病相關，與其它腫瘤類疾病相比，長鏈非編碼RNA在食管鱗癌中的研究和探索起步較晚，亟待深入研究。2013年，Bhagat TD等研究者發(fā)現(xiàn)，與正常食管上皮細胞相比，患有食管鱗癌的細胞株中長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1異常，其主要表現(xiàn)為啟動子區(qū)CPG島甲基化程度低進而使得其呈高表達狀態(tài)[3]。當siRNA介導以后，這一異常狀態(tài)便能抑制鱗癌細胞增殖，使其侵襲或轉(zhuǎn)移，因此，長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1在食管鱗癌研究中被視為促進其發(fā)展的一個重要因素。 

2.2.2 長鏈非編碼RNA HOTAIR 

HOTAIR是利用高分辨率芯片技術，由Rinn為主的研究團隊于2007年于纖維細胞中鑒定中發(fā)現(xiàn)的，當時其位于HOXC基因11與12之間的位點上，共編碼核苷酸2158個，含6個外顯子，2個結(jié)構(gòu)域，具有序列保守性差、結(jié)構(gòu)保守性高的特點。近年來，科研領域開始注重長鏈非編碼RNA HOTAIR的基因表達并致力于探究其在消化道腫瘤形成、轉(zhuǎn)移中的作用。Lv XB、Lian GY等通過研究食管鱗癌發(fā)現(xiàn)，食管癌患者長鏈非編碼RNA HOTAIR表達水平均高于正常人群，且升高程度同TNM分期有關平[4]。線性回歸研究分析結(jié)果顯示，長鏈非編碼RNA HOTAIR水平高者5年生存率降低，結(jié)合其它腫瘤的長鏈非編碼RNA HOTAIR可以得出結(jié)論，長鏈非編碼RNA HOTAIR可配合腫瘤惡性化，促進其浸潤和轉(zhuǎn)移。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HOTAIR對食管鱗癌作用的發(fā)揮主要是通過抑制Hox基因表達的方式來進行性，當Hox基因異常時，則可能會導致組織發(fā)育異常突變，最后導致細胞惡性轉(zhuǎn)化，誘發(fā)癌癥。 

3 長鏈非編碼RNA在食管鱗癌中的臨床意義 

3.1 長鏈非編碼RNA在食管鱗癌中的作用 

食管鱗癌的發(fā)生是細胞惡性轉(zhuǎn)化的過程，在這一過程中，患者基因組的不穩(wěn)定可對腫瘤變化產(chǎn)生影響。例如：長鏈非編碼RNA ANRIL，當患者罹患食管鱗癌是，它可以采用調(diào)控抑癌基因P15的方式來參與腫瘤變化。

正常細胞在轉(zhuǎn)化成鱗癌細胞的過程中，不同長鏈非編碼RNA的不同表達對癌癥細胞的生長作用功效不同，長鏈非編碼RNA DQ786227可抑制BEAS-2B增殖和克隆，加速細胞凋亡，此時其表達上調(diào)。而當其處于過表達的狀態(tài)時，會促進腫瘤生長。NcNRFR不同于長鏈非編碼RNA DQ786227，其會在穩(wěn)定過表達狀態(tài)下會促進細胞惡化，鑒于不同長鏈非編碼RNA在食管鱗癌中的表象各有差異，今后在這一領域的研究還需深入而細致。 

3.2 過表達長鏈非編碼RNA-LET或具有抑癌功效 

長鏈非編碼RNA-LET即低表達長鏈非編碼RNA，經(jīng)細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及RT-PCR檢測、Transwell侵襲實驗及細胞劃痕實驗證實，缺氧誘導銀子可降低長鏈非編碼RNA-LET表達，其主要渠道是憑借去乙酰化酶3和泛素蛋白酶體途徑。當?shù)鞍妆唤到庖院螅毎忠u能力增強，患者預后越差。有實驗研究顯示，食管癌細胞中，長鏈非編碼RNA-LET表達比周邊正常組織要低，當長鏈非編碼RNA-LET呈過表達狀態(tài)時，則其可抑制癌細胞侵襲和增殖，即提示長鏈非編碼RNA-LET有抑癌功能，這與前文中提及的長鏈非編碼RNA有致癌、抑癌雙重功效觀點一致。但由于研究深入程度有限，長鏈非編碼RNA-LET抑癌作用的發(fā)揮途徑目前尚未可知，有待突破。 

4 結(jié)語 

既往生物學研究證實，食管鱗癌發(fā)病同蛋白編碼基因異常存在密切關聯(lián)。隨著研究的深入，現(xiàn)階段，曾被視為“無功能序列”的暗物質(zhì)——非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)也作用于腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機制中，影響食管癌的發(fā)病與治療。目前，長鏈非編碼RNA在腫瘤疾病中的作用與影響已經(jīng)逐步得到證實，但調(diào)控腫瘤機制的臨床研究尚少，在食管鱗癌機制中的研究更為鮮見，望今后臨床可充分借助熒光素酶報告基因技術、RNA免疫共沉淀等先進生物學技術進一步探究長鏈非編碼在食管鱗癌中的作用機制，為將長鏈非編碼RNA作為標記物開展食管鱗癌的臨床分子治療奠定理論基礎。 

參考文獻 

[1] Orly Wapinski，Howard Y，Chang.Long noncoding RNAs and human disease[J].Trends Cell Biol 2011，21（6）：354-361. 

[2] Esteller M.Non-coding RNAs in human disease[J].Nat Rev Genet 2011（12）：861-874. 

篇8

關鍵詞：乙酰肝素酶；小片段干擾RNA；亞砷酸；胰腺癌，侵襲力

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A文章編號：1673-7717(2011)12-2657-05

Research on Heparanase siRNA Combined with Arsenous Acid

Inhibiting Invasion of Pancreatic Cancer Cells in Vitro

ZHENG Jiaping1,2,YANG JianMin3,Ru QingJing1

(1.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hanghzou 310053,Zhejiang,China;

2.Zhejiang Tumor Hospital,Hangzhou 310022,Zhejiang,China;

3.Zhejiang People's Hospital,Hangzhou 310014,Zhejiang,China)

Abstract:Objective：To observe invasion inhibiting effect of Hpa small-interfering RNA (siRNA) combined with arsenous acid on pancreatic cancer cells, so as to provide the theoretical foundation for further clinical use in the cancer treatment. Methods：Target gene (Hpa1-siRNA，Hpa2-siRNA，Hpa3-siRNA) fragments were diluted, annealed and connected with linear plasmid expression vector pGenesil-1.1, then pGenesil1.1/Hpa1-siRNA, pGenesil1.1/Hpa2-siRNA and pGenesil1. 1/Hpa3-siRNA were reconstructed. The Hpa-siRNA was transfected into SW1990 pancreatic cancer cell by DOTAP Liposomes meanwhile the empty control and negative control group were designed. Those target genes were respectively transfected into Hpa-mRNA and Hpa protein expression was detected by RT-PCR and Western blot respectively. Transwell cab model was employed to test the ability of SW1990 cell. Results： Expression of Hpa-mRNA and Hpa-protein in SW1990 were obviously suppressed by Hpa1-siRNA, Hpa2-siRNA, and Hpa3-siRNA, and efficacy in Hpa2-siRNA better than in Hpa1-siRNA and Hpa3-siRNA（P

Key words:Hparinase; small interfering RNA; arsenous acid; pancreatic cancer；invasive ability

________________________________________

收稿日期：2011-07-19

基金項目：浙江省研究生創(chuàng)新科研資助項目(YK2008071)

作者簡介：鄭家平（1972-），男，浙江杭州人，博士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤。胰腺癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的1%~5%，近年來在世界范圍內(nèi)有明顯增多的趨勢，傳統(tǒng)的治療手段是手術切除為主，聯(lián)合放療和化學藥物治療。其五年生存率低于5%，超過90%患者在確診后1年內(nèi)死亡，平均存活期少于6月\[1\]。胰腺癌高度侵襲、轉(zhuǎn)移的生物學特性是其預后不良的關鍵。因此，積極探索和闡明胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，尋求有效抗侵襲、抗轉(zhuǎn)移的治療措施對改善預后具有重要意義。最近研究表明，Hpa高表達可促進胰腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，直接影響胰腺癌患者預后和生存時間\[2-6\]。

因此，Hpa基因有望成為胰腺癌生物治療的新靶點。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)\[7-12\]，亞砷酸對多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移性尚具有明顯抑制作用。因此我們觀察Hpa-siRNA聯(lián)合亞砷酸對胰腺癌侵襲聯(lián)合抑制效果。從而為將來亞砷酸聯(lián)合Hpa-siRNA治療胰腺癌患者提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

pGenesil-1.1質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α菌株由武漢晶賽生物有限公司構(gòu)建和制備。胰腺癌SW1990細胞株購自中國科學院上海細胞庫。亞砷酸凍干粉（10mg/支）由北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司饋贈。Hpa基因序列自行設計，序列為：Hpa-F 5'- GAAAGACGGCTAAGATGC -3' Hpa-R5'- AAATGGTAGTTTCCTGCTC -3' 擴增片段大小為361bp。GAPDH452內(nèi)參引物為：序列為GAPDH452-F 5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' GAPDH452-R 5'- TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' 擴增片段大小為452bp。紫外分光光度計（SHIMADZU），DNA Marker、Eco31I內(nèi)切酶、SacI內(nèi)切酶和T4DNA Ligase鏈接酶(TaKaRa)， 質(zhì)粒小抽試劑盒（北京博大泰恒生物技術有限公司），水平電泳儀 DYY-III（北京六一儀器廠），膠回收試劑盒（北京博大泰恒生物技術有限公司），動物RNAout（天澤基因工程有限公司產(chǎn)品），ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit （東洋紡上海生物科技有限公司），PCR引物（武漢博潔公司），PCR system 2700(美國AB公司GenAmp)，Taq DNA 聚合酶（MBI 公司），HRP標記的羊抗兔IgG和 Rabbit anti-Hpa抗體（武漢三鷹），Rabbit anti-GAPDH多克隆抗體（武漢晶賽），PVDF膜（Life Science, USA），SuperSignal化學發(fā)光試劑（Pierce, USA），Transwell小室(CORNING)。

[WT5”FZ〗中華中醫(yī)藥 學刊

1.2 方法

1.2.1 目的基因設計、合成、與質(zhì)粒連接、酶切 通過Pubmed網(wǎng)站搜索目的基因人肝素酶mRNA序列，并確定基因號為NM_001098540（1779 bp）或NM_006665（1810 bp）為本實驗的目的基因。委托武漢晶賽生物有限公司設計挑選3條靶序列和干擾序列dsDNA模板引物，分別命名為Hpa1、Hpa2、Hpa3，引物結(jié)構(gòu)：CACC+Sense+Loop+Antisense+終止信號+SacI。用30μL annealing buffer 溶解上述合成1OD Hpa1/Hpa2/Hpa3單鏈目的基因片段。取2μL（即2μL Hpa1/Hpa2/Hpa3A +2μL Hpa1/Hpa2/Hpa3-B）+16μL annealing buffer混勻。94℃水浴退火自然冷卻至室溫。取1μL退火產(chǎn)物+99μL H2O做100倍稀釋。將稀釋退火片段分別與線性化載體pGenesil-1.1的連接，分別命名為pGenesil-1.1/Hpa1-siRNA、pGenesil-1.1/Hpa2-siRNA、pGenesil-1.1/Hpa3-siRNA。各取5μL過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，分別涂布于含卡那霉素抗性（終濃度為30μg/mL）的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取單克隆菌落接種于3mL含卡那霉素抗性（終濃度為30μg/mL）的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床（250r/min）培養(yǎng)過夜。用小提試劑盒小量提取質(zhì)粒，并分別用SacI做酶切鑒定。

1.2.2 RT-PCR檢測Hpa-mRNA表達 將NC（空白質(zhì)粒組）、Hpa1-siRNA、Hpa2-siRNA、Hpa3-siRNA質(zhì)粒載體、HK（無特異性Hpa-siRNA質(zhì)粒陰性對照組）采用DOTAP脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SW1990胰腺癌細胞48h。取轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h的S W1990細胞，以TRIzol法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進行實驗。cDNA反應系統(tǒng)見表1～2，第一步反應條件：75℃ 5min，短暫離心后置于冰上。第二步反應條件：42℃ 60min, 95℃ 5min。將合成好的cDNA 第一鏈放置-20℃保存。取上述合成cDNA 第一鏈為模板，進行PCR擴增獲得361bp的Hpa基因片段，反應體系見表3。將上述反應體系置PCR擴增儀上 95℃變性5min，然后開始PCR循環(huán)：95℃ 25s50.0℃ 25s72℃ 22s，共35個循環(huán)，72℃延長3min，4℃保存。DNA電泳觀察鑒定：取200μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，用DL2000 Marker作DNA分子量標準帶，溴乙錠染色，紫外透射儀上觀察并照相。如出現(xiàn)361bp 的電泳帶，則為Hpa

2.4 亞砷酸聯(lián)合Hpa-siRNA對SW1990胰腺癌細胞侵襲力的影響

見表5，見插頁Ⅴ圖6。

隨著亞砷酸濃度從0.5，1.0，2.0mg/mL的遞增，侵襲抑制率升高，分別為：7.78%、46.8%、76.8%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=71.633，P

胰腺癌高度侵襲、轉(zhuǎn)移的生物學特性是其預后不良的關鍵。因此，積極探索和闡明胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，尋求有效的抗侵襲、抗轉(zhuǎn)移治療措施對改善預后具有重要意義。最近研究表明，Hpa高表達可促進胰腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，對胰腺癌患者預后和生存時間有重要的影響\[2-6\]。因此，Hpa基因有望成為胰腺癌生物治療的新靶點。我們的研究擬通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術沉默Hpa基因，觀察對胰腺癌侵襲性的影響。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指外源雙鏈RNA ( double-stranded RNA, dsRNA)導入細胞后，能特異性的誘導同源互補的mRNA降解，導致轉(zhuǎn)錄后水平基因表達沉默現(xiàn)象。RNAi作為一種沉默基因表達的新技術，能特異、有效的抑制靶基因的表達，已被廣泛的應用于基因功能研究、病毒感染和腫瘤的基因治療等領域。針對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用的癌基因、抑癌基因、凋亡相關基因、生長因子、受體表達基因以及侵襲轉(zhuǎn)移相關基因等，利用RNAi沉默靶基因的表達，可以抑制腫瘤細胞的增殖、誘導凋亡、增加藥物敏感性、抑制血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等作用，為腫瘤治療開辟了新的途徑。小干擾RNA ( small-interfering RNA, siRNA)作為RNAi效應分子，是RNAi作用的主要介質(zhì)。它呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，是一段長度約為21-23核苷酸的小雙鏈RNA，經(jīng)核酸酶降解mRNA而阻斷其編碼蛋白質(zhì)的表達，即通過RNAi實現(xiàn)基因沉默\[7\]。

到目前為止，尚不清楚利用RNAi技術是否靶向沉默Hpa表達進而抑制胰腺癌侵襲性。因此，我們進行探索性研究，首先我們自行設計合成Hp-siRNA，利用質(zhì)粒pGenesil-1.1作為載體有效轉(zhuǎn)染SW1990胰腺癌細胞，進一步檢測轉(zhuǎn)染pGenesil-1.1-Hpa-siRNA質(zhì)粒后SW1990胰腺癌細胞的Hpa蛋白和mRNA的表達，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pGenesil-1.1-Hpa-siRNA質(zhì)粒表達載體（含Hpa1，Hpa2，Hpa3三條干擾序列）的SW1990胰腺癌細胞蛋白和mRNA表達明顯降低，其中Hpa2抑制效果優(yōu)于Hpa1，Hpa3，具有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。NC和HK組Hpa-mRNA和蛋白的表達無明顯變化。因此，我們研究認為，Hpa2可靶向沉默Hpa基因的表達，且是特異性最高的Hpa-siRNA。另外，我們的研究結(jié)果提示Hpa基因還沒有達到完全沉默，可能是由于Hpa-siRNA只能抑制Hpa基因表達，而不是敲除該基因。因此單純siRNA療效有限，需要聯(lián)合其他有效的治療手段。

三氧化二砷 ( Arsenic trioxide,As2O3 ) 俗稱砒霜，人類用它治療疾病已有 2400 年的歷史。我國著名血液學專家陳竺等將三氧化二砷用于急性早幼粒細胞白血病的治療,研究發(fā)現(xiàn)其通過誘導白血病細胞分化和凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用\[8\],開創(chuàng)了惡性腫瘤治療的新紀元。

隨著人們對As2O3 的作用機理和適應證方面的衍生研究, 相繼發(fā)現(xiàn)其對多種實體瘤有抑制作用\[9\]，多項體外研究結(jié)果顯示可能的抑癌機制是通過多種途徑、多種機制如阻滯細胞周期、激活Caspase以及改變GA DD的表達，抑制 surviving、 bcl-2 基因表達，增加Fas、Fas-L表達抑制腫瘤細胞增殖促進腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮其抗胰腺癌的作用\[10-15\]。

體內(nèi)實驗進一步驗證三氧化二砷組移植瘤體積和質(zhì)量均顯著低于模型組，三氧化二砷具有抑制人胰腺腫瘤形成和生長的作用，且具有劑量依賴性，聯(lián)合紫杉醇具有協(xié)同作用\[16-17\]。

近年來人們發(fā)現(xiàn)三氧化二砷有抑制軟組織肉瘤\[17\]、鼻咽癌\[18\]、膠質(zhì)瘤\[19\]、宮頸癌\[20\]、肺癌\[21\]、胰腺癌\[22-23\]多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，可能機制與抑制MAPK信號通路或者下調(diào)轉(zhuǎn)移相關基因如MMP-2、MMP-9、CD44、nm23的表達有關。另外人們還發(fā)現(xiàn)中藥三氧化二砷 ( Arsenic trioxide,As2O3 )通過多種機制、途徑抑制胰腺癌的侵襲力，因此我們嘗試將Hpa-siRNA技術結(jié)合三氧化二砷，探討兩者的協(xié)同作用。

我們通過不同濃度梯度的亞砷酸進行體外細胞試驗，結(jié)果表明，亞砷酸具有抑制胰腺癌侵襲力的作用，隨著亞砷酸濃度從0.5，1.0，2.0mg/mL的遞增，侵襲抑制率升高，分別為7.78%、46.8%及76.8%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=71.633，P

但是，上述實驗結(jié)果需要將來在體內(nèi)實驗進一步驗證。另外尚有待于進一步研究揭示兩者協(xié)同放大作用的分子機制。

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篇9

關鍵詞 納洛酮 酒精中毒后意識障礙

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.12.108

資料與方法

2006年1月～2008年12月收治急性酒精中毒后意識障礙患者20例,男17例,女3例;年齡20～46歲,平均33歲;血壓98～165/60～84mmHg,脈搏60～108次/分;飲白酒量0.1～1.5kg,病程1～8小時。20例患者均有不同程度意識障礙,輕度中毒19例,表現(xiàn)為嗜睡、煩躁、顏面潮紅、共濟失調(diào);重度中毒1例,飲酒量約1.5kg,就診時表現(xiàn)為意識完全喪失、壓眶反射消失、腱反射消失、呼吸抑制、紫紺、血壓下降等。

治療方法:20例患者經(jīng)臨床確診為急性酒精中毒后意識障礙,給予常規(guī)治療維生素B1,保護胃黏膜、保肝、維持水、電解質(zhì)酸堿平衡,對癥等基礎上加用納洛酮治療。輕度中毒用納洛酮0.8～2mg,分2～3次,每次加入25%葡萄糖液20ml靜脈注射;重度中毒吸氧、氣管插管、用呋塞米、甘露醇基礎上加納洛酮2.8～5mg,分3～5次,每次加入25%葡萄糖液20ml靜脈注射。每2次間隔時間15～30分鐘。

結(jié) 果

20例患者神志完全恢復正常,用納洛酮至意識完全恢復時間為45分鐘～2小時,重者8小時內(nèi)。20例患者住院治療1～5天,全部治愈出院,用藥過程中無1例出現(xiàn)不良反應。

討 論

急性酒精中毒是臨床常見的癥狀,主要成分是乙醇,飲用酒中含乙醇2%～60%。成年人飲用過量可致中毒,成人引起中毒的乙醇量個體差異大,一般為75～80ml。乙醇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑,作用于大腦,抑制皮質(zhì)功能,以后漸及延腦和脊髓,抑制血管運動中樞、麻痹呼吸中樞及心臟,使血管擴張,最后致呼吸和循環(huán)衰竭而死亡。所以短時間內(nèi)使患者神志迅速恢復清醒很重要。

本組資料用納洛酮治療急性酒精中毒20例,患者神志均恢復正常,療效100%。納洛酮治療急性酒精中毒優(yōu)于傳統(tǒng)常規(guī)治療,據(jù)文獻報道,腦內(nèi)和外周組織中可產(chǎn)生內(nèi)源性阿片樣物質(zhì),認為內(nèi)源性阿片肽,特別是β-內(nèi)啡肽的生理效應是導致休克、腦梗死、酒精中毒、安定中毒的病理生理環(huán)節(jié)。內(nèi)啡肽還具有直接的細胞毒性作用,對感覺神經(jīng)傳入通路及運動神經(jīng)傳出通路均有抑制作用,并加重乙醇對網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和大腦邊緣系統(tǒng)阻斷神經(jīng)元之間的傳導,同時加重丘腦與大腦皮層之間沖動的交互傳導,導致病人意識障礙加深,所以盡快抑制阿片樣物質(zhì)的作用是挽救患者生命的關鍵。納洛酮是內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)的特意性拮抗劑,能逆轉(zhuǎn)β-內(nèi)啡肽而起抑制作用并能解除β-內(nèi)啡肽對中樞系統(tǒng)的抑制作用[1]。20例患者治療結(jié)果發(fā)現(xiàn)納洛酮在治療急性輕、重度酒精中毒過程中,能明顯縮短患者蘇醒時間快速降低血中毒物濃度水平,提示納洛酮是治療急性輕、重度酒精中毒的一種快速而可靠的良好藥物,而且不良反應少,20例病人未見有血壓升高及肺水腫等不良反應發(fā)生,并且治療劑量與高于治療劑量幾十倍的使用其發(fā)生不良反應的關系不明確。鑒于納洛酮半衰期短,血漿濃度衰減快,因此常需反復給藥,具體作用需根據(jù)其病情及其血漿半衰期(40～90分)決定以避免發(fā)生反跳現(xiàn)象[2]。

參考文獻

篇10

[關鍵詞]艾納香；廢渣；乙酸乙酯部位；佐劑型類風濕關節(jié)炎

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、進行性、以侵犯全身關節(jié)為主要特征的免疫性疾病，是一種常見的風濕性疾病。其發(fā)病率約為0.8%（0.3%～2.1%），女性發(fā)病率約是男性的3倍，家譜分析提示，患者具有遺傳素質(zhì)，可能與HLAD和DW抗原等相關。 然而其病因尚不清楚[1]，其主要病理特點是：骨膜慢性炎癥、軟骨吸收、骨破壞和骨纖維化。多種炎癥因子和細胞因子與RA密切相關，迄今尚無療效確切的藥物。

艾納香是菊科植物艾納香Blumea balsamifera （L.） DC.新鮮或干燥地上部分[2]。全草含揮發(fā)油，主要成分為左旋龍腦[3]，現(xiàn)栽培于貴州、云南、廣西，是苗、壯族的重要藥物，具有祛風除濕、溫中止瀉、活血解毒、鎮(zhèn)痛發(fā)汗、祛痰止咳、通經(jīng)止血等功效[4]。近年來國內(nèi)外對艾納香的報道大多圍繞艾納香的溫中止血功效探討其婦科用藥的作用機制[5-6]，而艾納香祛風除濕功效對治療風濕關節(jié)炎方面的影響卻鮮有報道。但是民間驗方中卻屢次出現(xiàn)艾納香治療風濕關節(jié)炎的案例，且效果確切。

艾納香為制取艾片的重要原料，主產(chǎn)區(qū)通常采其鮮葉和嫩枝用傳統(tǒng)的土制水蒸氣蒸餾法提取“艾粉”（為艾納香制取冰片的粗級產(chǎn)品），再經(jīng)提煉后可制得精制“艾片（天然左旋冰片）”。產(chǎn)地加工往往將提取“艾粉”后的葉子殘渣丟棄，影響了其資源的有效利用。相關試驗對艾納香葉制取揮發(fā)油后的廢渣進行了藥理活性研究，探討了其不同極性部位鎮(zhèn)痛抗炎止血活性的差異，試驗證明廢渣乙酸乙酯部位有較強的活性。本文根據(jù)之前的研究結(jié)果進一步闡明廢渣乙酸乙酯部位對類風濕關節(jié)炎的治療效果，并初步闡明其機制。

1 材料

1.1 藥物 艾納香干燥的葉，采自貴州羅甸。由南京中醫(yī)藥大學陳建偉教授鑒定為菊科植物艾納香B. balsamifera葉。經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油之后，收集葉的廢渣，烘干備用。

1.2 試劑 弗氏完全佐劑（FCA，美國Sigma公司）；吲哚美辛（美國Sigma公司）；50%，95%乙醇，乙酸乙酯均為分析純；ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物 清潔級SD雄性大鼠，體重（180±5） g，揚州大學比較醫(yī)學中心，許可證號SUXR（蘇）2012-0004。

2 方法

2.1 供試液的制備 將1.1項下所收集的葉子廢渣以5倍量95%乙醇浸泡3 h，回流提取2 h，重復2次，再以50%乙醇回流提取1次；合并提取液濾液，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，濃縮干燥取其乙酸乙酯部位（BBE），得率為2.43%，以0.5%CMC-Na稀釋成濃度適宜的混懸液備用。

2.2 動物模型 適應性喂養(yǎng)7 d后，除空白組外大鼠用微量注射器于右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（FCA）0.1 mL，7 d后在尾根部皮下再次注射FCA 0.1 mL加強免疫。約14 d左右可誘發(fā)成功佐劑型關節(jié)炎模型[7]。

2.3 動物分組和給藥 36只大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為6組，每組6只，根據(jù)成年人每日艾納香的用量（15～30 g）設計大鼠實驗用藥量，其中人使用的高劑量為大鼠實驗用量的中劑量，其中各劑量均未出現(xiàn)大鼠用藥死亡的現(xiàn)象。空白對照組（0.5%CMC-Na 10 mL?kg-1）、模型對照組（0.5%CMC-Na 10 mL?kg-1）、陽性對照組（3 mg?kg-1吲哚美辛）及BBE高、中、低劑量（21.6，10.8，5.4 mg?kg-1）組，各組動物均于第2次注射FCA加強免疫后開始灌胃給藥，連續(xù)給藥28 d。

2.4 體重和足腫脹度 于第2次注射FCA加強免疫后開始，每7 d（即給藥當天，給藥后第7，14，21，28 天）對所有大鼠進行體重檢測，觀察其體重變化，同時以測量足周長法觀察其足腫脹情況。

2.5 關節(jié)炎指數(shù) FCA所致多發(fā)性關節(jié)炎一般于注射FCA后10～14 d開始出現(xiàn)， 主要觀察各組大鼠4只足爪各關節(jié)的腫脹程度。于第2次注射FCA加強免疫后第3天開始，每4 d觀察并記錄各關節(jié)病變，按0～4分評分： 0分，正常；1分，關節(jié)稍紅腫；2分，關節(jié)輕度紅、腫、熱；3分，關節(jié)中度紅、腫、熱、輕度功能障礙；4分，關節(jié)重度紅、腫、熱、嚴重功能障礙，不能負重。每只大鼠4只足爪的最大積分為16分。

2.6 脾臟和胸腺指數(shù) 免疫28 d后，將各組大鼠都脫頸處死，取出脾臟和胸腺分別稱重。脾臟（胸腺）指數(shù)（mg?g-1）=脾臟（胸腺）質(zhì)量/體重。

2.7 病理切片 將大鼠處死后剪下膝關節(jié)，置于10%甲醛（福爾馬林）中固定。經(jīng)過2周的脫鈣，再進行包埋、切片、蘇木素和曙紅染色等一系列的處理后制成病理切片，顯微鏡下觀察其滑膜增生、炎癥、血翳形成、骨侵蝕等病理情況。

2.8 血液指標 免疫28 d，禁食一晚后對各組大鼠進行眼眶取血。血液樣本分為2組，一組取全血收集于含有EDTA的干凈試管中，進行血常規(guī)檢測；另一組去血清收集于不含有EDTA的試管中，用比色法測定血清中的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、羥基自由基（OH?）、堿性磷酸酶（ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、β-氨基半乳糖（NAG）、唾液酸（SA）水平以及采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定血漿中白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。

2.9 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)采用Excel 2013統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，統(tǒng)計結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，P

3 結(jié)果

3.1 體重和足腫脹度 空白組大鼠活潑，納食正常，體重穩(wěn)步上漲。模型組大鼠納食減少，體重增長緩慢，致炎側(cè)足跖和踝關節(jié)腫脹明顯，在12 d前后出現(xiàn)腫脹高峰，部分大鼠在造模后期出現(xiàn)下肢活動受限。BBE治療組給藥后體型較模型組大，較活潑，未見明顯活動受限，但體重變化較模型組無顯著性差異，在治療第15天前后不同程度地明顯抑制了致炎足腫脹度，較模型組有顯著性差異。BBE高劑量組和吲哚美辛陽性藥組在12 d前后足腫脹度較模型組有顯著性差異，見圖1，2。

3.2 關節(jié)炎指數(shù) 造模的第12天之前，模型組、BBE組和吲哚美辛陽性藥組的關節(jié)炎指數(shù)之間差異無顯著性意義，且高于空白組。此后模型組的關節(jié)炎指數(shù)逐漸升高。BBE高、中劑量組藥后關節(jié)炎指數(shù)逐漸降低，與模型組比較差異有顯著性意義

4 討論

據(jù)報道炎癥介質(zhì)像IL-1，IL-6，TNF-α等，在風濕病發(fā)病機制中扮演著很重要的角色，它們是由免疫細胞的浸潤和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的過度分泌所產(chǎn)生的。其中TNF-α尤為關鍵，它可以促進其他炎癥因子像IL-1，IL-6的分泌[8]。TNF-α和IL-1共同刺激纖維細胞過度表達IL-33，MMPs和趨化因子[9]，然而IL-1則表現(xiàn)出更多的對軟骨和骨關節(jié)侵蝕作用[10]，整個“超家族”中IL-1參與了整個破壞過程。這些過程又會導致組織基質(zhì)的破壞和炎癥的浸潤。BBE對TNF-α和IL-1有顯著的抑制作用，從而緩解風濕關節(jié)炎的各種癥狀。這種免疫抑制作用可以通過抑制CD4+來下調(diào)促炎因子的過度分泌[11]。而TNF-α和IL-1的下調(diào)與NF-κB 和MAPKs通道有著密切關系，有待進一步研究。

活性氧（ROS）是由正常的細胞代謝所產(chǎn)生，在對抗感染的防御體系中起著重要的作用。但是在風濕病理條件下，激活的單核白細胞核巨噬細胞大量聚集從而導致活性氧在關節(jié)和臟器內(nèi)過度表達，并對細胞膜產(chǎn)生直接損傷[12]。而這種細胞損傷又會引起相關酶的顯著增加，所釋放的溶酶體酶類對關節(jié)軟骨有著水解作用，水解產(chǎn)物，如SA的含量也會上調(diào)[13]。ROS還通過促進促炎細胞因子和MMPs的生產(chǎn)[14]對關節(jié)造成間接的損害。高濃度的NO阻礙了成骨細胞的生長和分化，這是由促炎因子對骨形成的抑制作用所引起的。BBE在體內(nèi)呈現(xiàn)良好的抗氧化作用，表現(xiàn)在通過其治療后，下調(diào)了血清中NO，MDA，OH?的水平，同時通過上調(diào)SOD和GSH水平來修復體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，從而保護滑膜不受侵蝕，關節(jié)及臟器細胞膜不被破壞。細胞酶，如ALP，AST和ALT的升高是器官指數(shù)和骨缺損的重要指標，受損傷細胞釋放的酶可以引起相關器官和骨的損傷。因此，BBE能夠下調(diào)這些酶的水平，表明它具有效的抗關節(jié)炎活性，并對內(nèi)臟和骨有針對性的保護作用。總之，BBE組治療后可恢復體內(nèi)緊張的氧化應激和過度增加的細胞酶，表明BBE具有抗氧化活性以及內(nèi)臟和骨的保護作用。

通過上述試驗和相關的指標分析發(fā)現(xiàn)，艾納香葉廢渣的乙酸乙酯部位確實具有抗風濕的效果，這歸因于其乙酸乙酯部位具有免疫抑制、調(diào)節(jié)細胞因子和抗氧化等共同作用，為下面進一步研究其作用通道和有效成分奠定了基礎。

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Anti-arthritic and anti-oxidative effect of ethyl acetate fraction of Blumea

balsamlfera residues in rat adjuvant-induced arthritis

XIA Yan， ZUO Jian， LI Xiang， CHEN Jian-wei*

（Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract]Objective： To study the effect of ethyl acetate fraction of Blumea balsamifera（BBE） residue on treating rats of adjuvant arthritis （AA） and its mechanism. Method： The rats were immunized with the Freund′s complete adjuvant （FCA）. After modeling， 28 days′ treatment with BBE was performed. During the experimental process， rat mass， toe girth， arthritic index （AI）， proliferation of immune organs and pathological section were measured. After treatment， blood samples were collected through fossa orbitalis vein for detection of serum SOD， MDA， GSH， NO， OH?， ALP， AST， ALT， NAG and SA content using colorimetric method and IL-1， IL-6， TNF-α content using ELISA method. Result： Administration with BBE （high dose） could significantly ameliorate joint swelling and arthritis index， effectively inhibit synovial hyperplasia， down-regulate the levels of MDA， NO， OH?， ALP， AST， ALT， NAG， SA， IL-1， IL-6， TNF-α and up-regulate the SOD and GSH levels in serum. Conclusion： The results suggested BBE possesses substantial anti-arthritis and antioxidant activities.