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篇1

【關鍵詞】熱休克蛋白70創傷熱應激PC12細胞

【中圖分類號】Q753 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484(2010)03-00-02

Effects of heat shock protein 70 in traumic stress of PC 12 cells

【Abstract】Objective: To investigate the changes of heat shock protein 70 (HSP70) expression levels in neurons in traumic stress. Methods: The expression amounts of HSP70 were determined of PC12 cells using immunocytochemical approach during heat stress. Results: The expression levels of HSP70 increased in heat stress. In the present study, the proliferations of PC 12 cells also increased. Conclusions: High level expressions of HSP70 is one of protective mechanisms in PC 12 cells.

【Key words】Heat shock protein 70;Trauma;Heat stress;PC 12 cells

熱休克蛋白 (heat shock proteins,HSP) 70 是一類廣泛存在于所有原核和真核細胞內,具有高度保守性的蛋白家族,在正常情況下基礎水平表達較低。當生物體受到應激刺激(如熱、機械力、缺血、缺氧以及感染等)和其它損傷因素作用而發生應激反應時,就會啟動HSPs臺成基因,促使HSPs的合成,以對細胞起一定的保護作用[1,2]。本實驗探究PC12細胞在熱應激狀態下表達HSP70的情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PC12細胞為本實驗室保存細胞株。HSP70單克隆抗體購自Sigma公司;SABC免疫細胞化學試劑盒由博士德公司提供,臺盼蘭染液等其它試劑為國產分析純。

1.2 細胞培養

細胞培養體系為含l0%胎牛血清和雙抗的MEM培養基,置于37℃,濃度為5%CO2的培養箱中。上述細胞培養試劑均購自GIBCO公司。

1.3 細胞存活率測定

實驗分為熱應激組和對照組。PC12細胞依3×104/孔密度接種于96孔板內,待細胞融臺成單層后,予以熱應激損傷刺激,即置于42℃水浴中20min,然后用培養液清洗三次,以除去脫落細胞;接著更換新鮮培養液在37℃恢復培養3h,用胰酶將細胞消化,臺酚蘭染色,計算細胞活性。

1.4 免疫細胞化學染色檢測HSP70

將PC12細胞按照1×106/孔密度接種于24孔板內的直徑為12mm的蓋玻片上。PC12細胞融合后,予以熱損傷刺激(同前述方法),應用免疫細胞化學方法分析HSP70表達變化。

1.5 統計學方法

熱應激損傷組和對照組數據使用SPSS 10.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結果

PC12細胞為貼壁細胞,呈梭形或多突起形扁平狀。一般地,接種24h后即可貼壁;培養48-72h即可達到增殖旺盛狀態,形成單層融合。

細胞生存率評價結果顯示,熱損傷組和對照組PC12細胞生存率分別為90.9±2.7%和93.2±2.4%,實驗組細胞存活率略低于對照組,但是,統計學分析兩組比較無顯著性差異(P>0.05)。

在實驗組,熱應激刺激后即可見PC12細胞漿內!HSP70表達,其表達一直持續在較高水平,即使當細胞長成單層時,HSP70的表達仍為陽性。與之相比較,對照組PC12細胞接種24h后細胞貼壁、伸展,HSP70表達基本為陰性;48h時細胞增殖旺盛,可見細胞分裂現象,胞漿及胞核內均可見HSP70著色;72h后長成單層細胞,HSP70表達又轉為陰性。

3 討論

作為一種非特異性細胞保護蛋白質,Hsp70主要通過提高細胞對應激原的耐受性、分子伴侶作用以及抗細胞凋亡等途徑達到對細胞的保護[3]。近年來,大量研究證實HSP70在哺乳類動物損傷局部迅速誘導產生,對機體有明顯的保護作用[4]。采用免疫組化染色可以直接觀察細胞和/或組織中HSP70的表達。

生物體在各種損傷后將啟動復雜的全身反應,導致機體內一系列特殊應激因子的基因表達,HSP70就是在各種刺激因素作用下細胞內誘導合成的蛋白質。研究報道HSP70在組織細胞損傷的過程中表達增強,并對細胞具有保護作用,同時也能反映細胞損傷的程度[5,6]。細胞內HSP70的表達是當今的研究熱點,研究認為細胞外的HSP70在機體的生理和免疫機制上起著主要的作用,其中包括保持自身遺傳的高度保守性、免疫應答的調節等。但其作用機制還需進一步的研究。有文獻報道,應激時大部分誘導型Hsp70位于細胞核內并包圍核仁,恢復后則移人胞漿,另外血液中的單核細胞、神經膠質細胞、動脈血管內皮細胞等能夠釋放HSP70[7]。

本研究以PC12神經細胞為實驗對象,研究熱應激損傷對HSP70的影響和作用。實驗結果表明在熱應激損傷作用下,神經細胞中HSP70作為細胞自我保護機制,HSP70蛋白持續較高水平表達,可能與早期免疫炎性反應及創傷愈合有關。數據顯示HSP70的表達變化與細胞和/或組織的增殖活性密切相關。即細胞增殖旺盛時,HSP70表達水平升高。換言之,在創傷的早期,HSP70的表達以炎細胞為主,當細胞/組織轉入修復階段時,HSP70開始在修復的細胞/組織中表達,在細胞/組織增生旺盛時,表達更為強烈;當創傷完全愈合后,HSP70的表達水平逐漸下降。其作用機制有待于在將來工作中從分子水平上深入研究,加以闡述。

4 結論

熱休克蛋白是細胞受應激原刺激后誘導產生的一組應激蛋白,一般認為HSP70可以提高細胞的應激能力,抵御各種損害因素的影響,起到保護細胞的作用。研究表明,HSP70在創傷后即開始在神經細胞中持續較高水平表達。

參考文獻

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篇2

[關鍵詞]熱休克蛋白90(HSP90);糖尿病;難愈創面;創面愈合

[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)05-0691-04

Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats

REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P

Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes

糖尿病造成的難愈創面已成為目前臨床治療的一大難題,研究表明,高糖會抑制人表皮細胞的遷移,從而導致創面上皮化延遲[1-2]。近來,Li.W的研究發現熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能夠有效促進人表皮細胞的遷移[3],而關于其是否能夠有效促進糖尿病性難愈創面的研究并未見報道。本實驗旨在將HSP90應用于糖尿病性難愈創面,并輔以胰島素作為參照,以觀察不同時期各組創面的愈合程度及創面中HSP90的表達含量。

1材料和方法

1.1動物及分組:選用健康清潔級雄性SD大鼠100只,由第四軍醫大學動物試驗中心提供,體重(200±3)g,分為A、B、C、D、E五組,每組20只。A組為正常創面但不予以任何治療,即對照組;B組為糖尿病大鼠難愈創面給予空白凡士林藥膏治療組,即空白組;C組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有HSP90的凡士林藥膏治療組,即HSP90組(HSP90濃度:1μg/ml);D組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有胰島素的凡士林藥膏治療組(胰島素濃度:30μg/ml)E組為糖尿病大鼠難愈創面給予含有HSP90及胰島素的凡士林藥膏治療組,即聯合用藥組(E組,HSP90濃度:1μg/ml,胰島素濃度:30μg/ml)。每組n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,

1.1.1 構建2型糖尿病難愈創面模型:采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法誘導2型糖尿病造模。各組提前4周高脂高糖飲食,饑餓12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并維持高脂高糖飲食,并于注射后48h用強生穩步血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,體重明顯下降(>50g)為造模成功[4]。三天后補注STZ(以10～20mg/kg體重劑量腹腔注射),并測量FBG值。切取全層皮膚暴露肉膜為準后以d=2cm的金屬環間斷縫合固定于創緣,防止創面攣縮。

1.1.2 給藥及分組:A組不涂抹任何藥物;B組為空白藥膏;C組為含有濃度1μg/ml HSP90的藥膏;D組為含有濃度30μg/ml胰島素的藥膏;E組為含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰島素的藥膏。各給藥組均以外用涂抹局部給藥,藥膏均勻覆蓋整個創面(約1g/次)為準(含有藥物的藥膏均委托金花生物制藥集團有限公司完成)。HSP90的濃度為我們參考了Li.W試驗中用于正常創面的治療濃度后[3],并以15只糖尿病大鼠給予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml進行了簡單的預實驗,發現三種濃度的效果并無顯著差異,所以取最小濃度。

6941,

2實驗過程及觀察設計

在創面形成后即時給予難愈創面藥物治療持續2天,A組則不治療,動物創面予以暴露。創面的固定環會于創面形成后的第10天予以摘除,因為此時皮膚攣縮力量較大,會導致縫合線斷裂,為統一標準予以摘除。并創面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進行大體觀察及活體取材做常規病理學觀察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5個時間點各取n1=3個標本,而在第21天取n2=5個標本,各標本取材時取全層厚皮膚,保留創緣約1～2mm的正常皮膚。

2.1 大體觀察指標:分別于用藥后第3、5、7、10、14、21 進行大體拍照觀察并采用ADOBE photoshop cs4 計算各時期的創面愈合率;

2.2 鏡下觀察指標:并于3、5、7、10、14、21天取創面標本,3、5、7、10、14天每組各時間點3只,21天時每組5只。皮膚標本剪成橫斷面,標本均用1%中爾馬林固定,石蠟包埋,連續切片,分別進行HE染色、并使用ABC法進行HSP90的免疫組化染色。并采用image pro plus 6.0彩色圖像分析系統, 每張切片選取5個有代表性的200倍視野,測量每個標本HSP90陽性表達密度及積分光密度IOD值的均值并記錄。

2.3 數據統計:所得試驗數據均采用SPSS11。文中數據以均數和標準差(x±s) 表示,并且對創面愈合率采用兩個獨立樣本t檢驗進行比較。

3實驗結果

3.1 大鼠創面愈合率差異比較:各組大鼠在各時間點創面愈合率比較見表1。由表可見,單獨使用HSP90(C組)及單獨使用胰島素(D組)均能夠提高創面的愈合率(與同期B組相比,P

3.2 各組創面第10天時HSP90的免疫組化對比:見圖1～5。由圖可見,聯合用藥組及正常創面對照組創面中,HSP90的陽性表達較為強烈。

3.3 HSP90陽性表達的比較:為更加客觀的反應HSP90在創面中的陽性表達狀況我們選取平均陽性率及積分光密度作為指標[5-6]。各組大鼠各時間點HSP90平均陽性率(Density Mean,DM)值的比較見圖6。各組大鼠各時間點創面中HSP90的平均積分光密度(Identical Optical density,IOD)的比較見圖7。

由圖6、圖7我們發現:①在糖尿病大鼠創面中,HSP90的表達明顯下調(同期對照組相比,P

4討論

美國創面愈合協會的資料顯示大約有66%的難愈性創面即使經過6個月的治療護理仍無法治愈[7],僅處理創面的材料每年就花費90億美元[8]。糖尿病創面的治療一直是難題,表皮細胞遷移遲緩也是其發生機制的一個重要特點。 在糖尿病創面的臨床治療中,胰島素的局部應用的療效及作用機制均得到了驗證,這一方法也成為了臨床治療糖尿病創面的經典方法。而其作用機制主要在于降低創面組織血糖濃度,加快糖尿病創面的新生毛細血管形成,促進上皮細胞的增殖與遷移[9-10]。

2007年DR. Woodley等發現人表皮細胞受到缺氧刺激后,會大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能夠有效促進人表皮細胞的遷移,并將其應用于正常創面,發現HSP90α能夠加速創面的再上皮化過程[3,11]。在此之前,人們對于HSP90的關注了解更多的集中在癌癥領域,作為重要的分子伴侶,它介導了多條調控細胞增殖、凋亡、遷移的信號通路[12],并保護細胞產生應激反應,抵抗各類損傷帶給機體的不可逆性傷害[13]

在本實驗中我們主要為了研究HSP90是否能夠促進糖尿病性難愈創面的愈合,并觀察HSP90在糖尿病性難愈創面中的表達,探索HSP90在創面中的表達是否與創面的愈合速率有關聯。我們的研究發現:在大體觀察下,①外源性給予糖尿病性難愈創面HSP90,同期的創面愈合率有所提高(與同期空白組相比,P0.05)。僅從大體實驗的觀察結果我們認為,創面中HSP90的表達與糖尿病難愈創面的愈合是存在相關性的。在鏡下觀察,我們發現:①糖尿病性難愈創面的高糖微環境明顯抑制了HSP90的表達(空白組與同期對照組相比,P

分析結果我們認為,高糖環境會降低HSP90在創面中的表達,減弱HSP90對細胞的保護作用。并且創面中HSP90的表達高低與創面的愈合速率具有相關性。雖然無論是局部給予胰島素改善高糖微環境,還是局部應用HSP90提高創面中HSP90的表達,均能夠提高糖尿病性難愈創面的愈合率,但是我們發現聯合應用后糖尿病性難愈創面的愈合效果最好。據此我們認為,胰島素改善了糖尿病性難愈創面的局部微環境,有利于創面中HSP90的表達提高,進一步局部給予HSP90,提高創面中HSP90的含量,從而激活部分HSP90參與調控的信號通路,提高創面中各類生長因子的表達,促進了糖尿病性難愈創面的愈合。

然而,我們的研究尚屬淺顯,對于HSP90在糖尿病創面愈合過程中的作用機制也未進行研究。但是,依然為我們尋找糖尿病創面的治療方向提供了一個具有臨床應用意義的思路。下一步,我們會對HSP90在糖尿病性難愈創面的作用機制進行進一步的研究,探索HSP90在糖尿病性難愈創面中所調控的與創面愈合密切相關的生長因子與細胞外基質的變化。并且HSP90的提取目前還很昂貴,所以進一步尋找到其穩定的上游信號分子或尋找一種能夠有效且廉價的提取HSP90的方法會成為我們今后的研究方向。

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篇3

【關鍵詞】 熱證／中藥療法

摘要：【目的】探討清熱復方對大鼠熱休克蛋白70(HSP70)表達的調控作用。【方法】將70只大鼠隨機分為熱休克模型組、熱休克加白虎湯組、熱休克加黃連解毒湯組、內毒素模型組、內毒素加白虎湯組、內毒素加黃連解毒湯組和正常對照組7組，每組10只。采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)對熱休克模型組、內毒素模型組和正常對照組大鼠的肝、肺組織進行了HSP70 mRNA表達的檢測，觀察清熱復方白虎湯和黃連解毒湯分別對兩種模型大鼠肝、肺組織HSP70 mRNA表達的影響。【結果】熱休克模型組、熱休克加白虎湯組和熱休克加黃連解毒湯組中HSP70 mRNA的表達高于正常對照組（P＜005）；熱休克加白虎湯組和熱休克加黃連解毒湯組均高于熱休克模型組（P＜005）；內毒素模型組、內毒素加白虎湯組和內毒素加黃連解毒湯組之間的HSP70 mRNA表達以及與正常對照組相比均無顯著性差異（P＞005）。【結論】提示不同因素導致的熱證狀態下HSP70的基因表達不一致，清熱復方可誘導熱休克大鼠肝、肺組織中HSP70表達的增加，從而提高細胞的耐受力，避免細胞組織的損傷。

關鍵詞：熱證／中藥療法；白虎湯／藥理學； 黃連解毒湯／藥理學；

熱休克蛋白70；疾病模型，動物

生物體在高溫或其他因素刺激下會誘導基因開放而合成一組新的蛋白質―熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。許多研究證實整體動物的熱處理可預防隨后的心、腦、肺、視網膜等損傷，并認為全身熱處理對這些器官的保護作用與HSPs的表達有關［1］。HSPs作為分子伴侶，在維持細胞的正常形態及功能中起著重要作用，參與其他蛋白質的折疊、轉運、合成等過程，與細胞內的其他肽類蛋白質結合，參與細胞的抗損傷、修復和熱耐受過程，其在多種疾病過程中的重要作用已經被大量證據證實。本研究主要采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR）觀察白虎湯和黃連解毒湯對熱休克、內毒素兩種大鼠熱證模型的HSP70基因表達的調控，以探討清熱解毒中藥對HSP70表達的影響。

1 材料與方法

11 研究對象

清潔級健康雄性SD大鼠70只，體重(200±10)g，由中山醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：2696001。

12 藥物與試劑

藥物：白虎湯(石膏30g、粳米9g、知母9g、甘草3g)，每劑水煎濃縮至50mL，相當于生藥1g/mL；黃連解毒湯(黃連9g、黃芩6g、黃柏6g、梔子9g)，每劑水煎濃縮至30mL，相當于生藥1g/mL，4℃保存備用。

主要試劑：總RNA提取試劑盒和逆轉錄PCR反應試劑盒(大連寶生物工程有限公司提供)；RTPCR引物(Canada，Stress Gen Corp，STM507);βaction引物(上海生工生物工程公司提供)；DL2000 DNA Marker(大連寶生物工程有限公司提供)。

13 主要儀器

TGL16G型臺式高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；DNA／RNA純度檢測儀(Gene Quant American Pharmacia Biotech Corp)；PE9600型PCR擴增儀(American Perkin Corp)；EDAS120電泳凝膠圖象分析系統(American Kodak Corp)。

14　動物分組及處理

70只雄性SD大鼠隨機分為熱休克模型組、熱休克加白虎湯組、熱休克加黃連解毒湯組、內毒素模型組、內毒素加白虎湯組、內毒素加黃連解毒湯組、正常對照組7組，每組10只。

141 熱休克組大鼠模型的制備與處理

將大鼠按不同組別分別用生理鹽水、白虎湯、黃連解毒湯灌胃(100g/kg)，1h后進行第2次灌胃，再經1h將大鼠置恒溫烤箱中進行熱休克處理，參考Cruiie方法［2］，溫度控制在約55℃，測量大鼠肛溫達到42℃，維持10～15min，密切觀察大鼠動態，大鼠出現煩躁、亂竄動、毛發豎立、爪底濕潤后，斷頭處死，取肺、肝組織備用。

142 內毒素組大鼠模型的制備與處理

將大鼠按不同組別分別用生理鹽水、白虎湯、黃連解毒湯灌胃(100g/kg)，1h后于尾靜脈注射內毒素(15mg/kg)，1h后再重復灌胃，3h后觀察大鼠出現煩躁、亂竄動后，斷頭處死，取肺、肝組織備用。

143 正常對照組

生理鹽水灌胃，不經其他任何處理，斷頭處死，取其肝、肺組織備用。

15 實驗方法

采用RTPCR法檢測各組大鼠肝、肺組織中HSP70 mRNA的表達。

βaction引物序列：Sense Primer 5′ ACCACAGTCCATGCCATCAC 3′；Antisense Primer 5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′。

HSP70引物序列：Sense Primer 5′ CTCCAGCATCCGACAAGAAGC 3′；Antisense Primer 5′ ACGGTGTTGTGGGGGTTCAGG 3′。

βaction擴增片段長度為450個堿基對(base pair，bp)，HSP70擴增片段長度為234bp。

RTPCR反應體系組成：MgCl2 60μL，10×RNA　PCR　Buffer 80μL，TaKaRa LA Taq05μL，HSP70上下游引物各1μL，βaction上下游引物各1μL，Rnase Free dH2O 615μL，總反應體積為80μL。PCR擴增反應條件為：前預變性94℃ 2min，1個循環；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共28個循環；后延伸15min。取出反應液約10μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙錠染色，將電泳結果置于EDAS120電泳凝膠圖象分析系統內掃描并攝片。采用Gelbase電腦軟件對HSP70 DNA與βaction DNA條帶進行光密度掃描，計算HSP70 DNA和βaction DNA吸收峰面積之比，即D值，以此估計HSP70 mRNA的表達情況。

16 統計學處理

用SPSS100軟件進行多組間兩兩比較。

2 結果

各組大鼠肝、肺組織中HSP70 mRNA轉錄水平的比較結果見表1。表1 各組大鼠肝、肺組織中HSP70 mRNA轉錄水平（略）

結果顯示，熱休克各組與內毒素各組大鼠的肝、肺組織中HSP70 mRNA表達不同，熱休克各組HSP70 mRNA表達均比正常對照組高（均P＜005），而內毒素各組的表達與正常對照組相比均無顯著性差異（P＞005）。說明熱刺激(熱休克)比致熱源更容易刺激細胞組織合成熱休克蛋白，從而增加對組織細胞的耐熱性和保護作用。熱休克加白虎湯組及熱休克加黃連解毒湯組的HSP70 mRNA的表達高于熱休克模型組（P＜005）；熱休克加黃連解毒湯組大鼠在肝、肺組織中HSP70的表達與熱休克加白虎湯組相比有顯著性差異（P＜005）。表明白虎湯和黃連解毒湯均能誘導HSP70表達的增加，從而增強對肝、肺組織的保護作用。相比之下，白虎湯較黃連解毒湯在肝、肺組織中更能誘導HSP70的表達。內毒素模型各組HSP70的表達與對照組相比差異無顯著性（P＞005），內毒素模型各組之間HSP70的表達亦無顯著性差異（P＞005）。表明給大鼠靜脈注射內毒素不能誘導HSP70表達的增加，中藥清熱復方亦不能誘導內毒素模型組中HSP70表達的增多，提示內毒素導致的炎性發熱不能刺激組織細胞合成對細胞有保護作用的HSP70。

3 討論

一切生物在受到高溫、缺氧、感染、創傷及乙醇等因素的刺激時，會發生細胞應答反應，其共同特點是產生一組具有生物活性的蛋白――熱休克蛋白。HSPs是一組高度保守的伴隨細胞蛋白，可使細胞非特異性抗損傷能力增加，能對抗更為嚴重的應激損傷。HSPs與一些基本的細胞功能有關，如蛋白轉運、折疊和裝配，是存在于細胞內的一種主要“分子伴侶”，在維持組織細胞的自身穩定和環境適應性方面有重要作用，對細胞抗御外界損傷具有保護作用，在生理和應激條件下均能表達。據報道，熱休克時細胞中許多編碼正常功能蛋白質的基因關閉，使大部分蛋白質的合成受抑制，而熱休克基因被開啟，HSPs合成增加［3］。自20世紀70年代以來，按照分子量的大小HSPs有HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP等家族，其中HSP70是目前國內外研究較多的，也是最重要的一類熱休克蛋白。

目前認為HSP70有多種功能，是一種非特異性保護蛋白，人體在高溫及各種有害因素刺激下，HSP70合成明顯增加，以提高機體耐熱和抗病毒能力，其廣泛的生理和病理作用已成為當今生命科學研究的熱點［4］。王燕如等［5］采用Western印跡法發現熱休克預處理使肺泡巨噬細胞(PAMs)中HSP70 mRNA表達增多，且獲得抵抗H2O2損傷的能力；用放射菌酮和放射菌素D分別從蛋白合成及基因轉錄水平阻斷熱休克基因的表達，能取消熱休克對H2O2所致PAMs損傷的保護作用。李國成等［6］發現其自制健脾益氣方能誘導大鼠提高HSPs的表達，防止胃粘膜損傷，促進潰瘍的愈合，認為HSPs可能介導胃粘膜防御。

本研究結果表明，不同因素導致的熱證狀態下HSP70的基因表達是不一致的，熱休克反應更類似中醫所說的“陽明氣分熱盛證”，其表達的增強是細胞保護作用的體現，而白虎湯誘導其表達的進一步增強，一方面從HSP70的角度闡明了白虎湯對“實熱證”的治療效應；另一方面更證實了中醫辨證論治的正確性。

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［4］Linquise S，Craig E A.The heat shock proteins［J］．Annu Rev Genet，1998，22:631.

篇4

【關鍵詞】 α-突觸核蛋白;熱休克蛋白70;過表達

α-突觸核蛋白是一種在中樞神經系統突觸前表達的可溶性蛋白，具有調節膜穩定性和神經可塑性等生理功能。近年研究發現，α-突觸核蛋白基因過表達或突變可引起α-突觸核蛋白的錯誤折疊、有毒蛋白寡聚體和多聚體的形成，使其結構和功能障礙，從而啟動一系列級聯反應致多巴胺能系統損傷，最終導致帕金森病(PD)。研究認為神經保護劑可能是治療PD的一個新的有效途徑，而熱休克蛋白70(HSP70)就是其中之一。HSP70是分子伴侶家族中的一員，作為一種重要的應激蛋白，能與　錯誤折疊的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之外，HSP70還有助于錯誤折疊蛋白的降解〔1，2〕。在果蠅及酵母的PD模型中發現，HSP70能減輕α-突觸核蛋白的毒性及其引起的神經細胞凋亡〔3，4〕，而HSP70抑制α-突觸核蛋白毒性可能與其能夠與α-突觸核蛋白相互作用，阻止α-突觸核蛋白纖維樣聚集，降低α-突觸核蛋白表達量有關〔5，6〕。為進一步證實HSP70在α-突觸核蛋白所致PD的作用，本實驗首次在神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)PD模型中檢測了HSP70的作用及機制，發現HSP70可以通過降低α-突觸核蛋白水平發揮對PD細胞模型的保護作用。

1材料與方法

1.1實驗材料SH-SY5Y細胞購自ATCC公司;限制性內切酶購自Takara公司;QIAprep TIP100 Kit購自QIAGEN公司;人胎腦cDNA文庫、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000購自Invitrogen公司;蛋白酶抑制劑cocktail購自Sigma公司;anti-α-synuclein 204抗體、anti-beta-actin抗體購自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1質粒構建以人胎腦cDNA文庫為模板，PCR獲得α-突觸核蛋白可編碼序列(CDS序列)以NotⅠ和HindⅢ連接到pCDNA3.1真核表達載體中，通過overlap PCR方法，構建A53T突變體，同樣以NotⅠ和HindⅢ連接到pCDNA3.1真核表達載體中。按照QlAprep TIP100 Kit Protocol抽取并純化質粒，測序證實。pCDNA3.1-HSP70質粒由湘雅二醫院肝移植中心李杰群博士惠贈。

1.2.2細胞培養與轉染SH-SY5Y細胞采用含10%FBS的高糖DMEM培養液，置于37℃，5%CO2的培養箱培養。轉染嚴格按照Lipofectamine2000說明書進行。用不含FBS的DMEM培養基洗滌細胞2次，24孔細胞培養板每孔加入含2 μl Lipofectamine2000及0.8 μg質粒DNA、不含FBS的DMEM培養基500 μl，在37℃，5%CO2的培養箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM培養基繼續孵育48 h。

1.2.3免疫熒光將穩定表達蛋白的SH-SY5Y細胞接種到有蓋玻片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培養于37℃、5% CO2培養箱中36 h后，棄去培養基，3.7%的多聚甲醛/磷酸緩沖液(PBS)室溫下固定15 min。PBS洗2次，每次5 min。0.2%的TritonX-100/PBS透化10 min，PBS洗2次，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫封閉30 min。加入1∶400稀釋的anti-α-synuclein204一抗室溫孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。5%BSA封閉液，室溫封閉20 min。加入1∶200稀釋的anti-鼠IgG-Cy2二抗100 μl，避光室溫下孵育60 min。1×PBS洗3次，每次5 min。4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核，室溫，避光反應2 min。PBS洗2次，每次5 min。去離子水洗1次，封片，用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。

1.2.4免疫印跡取細胞，吸去培養基，加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCl，20% Glycerol，4% SDS，0.1% bromphenol blue，pH 6.8)加入蛋白酶抑制劑cocktail裂解細胞，超聲后，使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。均取20 μg總蛋白經18% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并電轉移至PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入相應一抗，4℃過夜，Tris緩沖生理鹽水溶液(TBST)洗膜后，加入對應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜后，電化學發光免疫分析法(ECL)發光，曝光。內參照為鼠抗-actin單克隆抗體。

1.2.5細胞活力測定調節SH-SY5Y細胞密度約5×104/ml，以100 μl/孔接種于96孔板，24 h后分別轉染pCDNA

3.1+HSP70;α-突觸核蛋白野生型+ pCDNA3.1;α-突觸核蛋白野生型+HSP70;α-突觸核蛋白A53T+pCDNA3.1;α-突觸核蛋白A53T+HSP70;每種處理設3個復孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)，繼續培養4 h。棄培養基，每孔加二甲基亞砜(DMSO)100μl振蕩混勻，待顆粒溶解后置于酶標儀上，空白孔調零，以570 nm波長檢測各孔吸光度值。

1.3統計學分析利用SPSS11.5軟件進行統計分析，用t檢驗進行兩組間差異比較。

2結果

2.1PD細胞模型的構建α-突觸核蛋白野生型和突變型A53T在轉染SH-SY5Y細胞后，胞漿和胞核都有分布，以胞漿分布為主，部分細胞α-突觸核蛋白呈點狀分布，可能為其聚集體。免疫印跡也顯示，SH-SY5Y細胞中α-突觸核蛋白野生型和突變型A53T都得到了過表達，說明PD細胞模型構建成功。見圖1A、B。

2.2HSP70對PD細胞模型中α-突觸核蛋白的影響了探討HSP70對PD細胞模型中過表達的α-突觸核蛋白的作用，將HSP70與α-突觸核蛋白進行了共轉染，通過免疫印跡檢測HSP70對α-突觸核蛋白表達的影響。結果顯示，無論是在α-突觸核蛋白野生型還是突變型PD細胞模型中，HSP70均能降低α-突觸核蛋白的表達。見圖2。A：免疫熒光檢測α-syunclein 野生型(左圖)與A53T突變體(右圖)在SH-SY5Y中的表達。一抗為anti α-syunclein 鼠單克隆抗體，二抗為cy2標記的anti mouse IgG抗體。藍色為DAPI染色的細胞核。B：western印跡檢測α-syunclein在SH-SY5Y中的表達。一抗為anti α-syunclein 鼠單克隆抗體，二抗為HRP標記的anti mouse IgG抗體。內參為細胞骨架蛋白beta actin。圖1α-syunclein過表達PD模型的建立Western印跡檢測α-syunclein與HSP70共轉染后，HSP70對α-syunclein 野生型和突變性表達量的影響。一抗為anti α-syunclein 鼠單克隆抗體，antiHSP70單克隆抗體，二抗為HRP標記的anti mouse IgG抗體。內參為細胞骨架蛋白β-actin。圖2HSP70降低α-synuclein的表達量

2.3HSP70對PD細胞模型活力的影響轉染野生型和突變體α-突觸核蛋白后，SH-SY5Y細胞活性明顯降低，說明α-突觸核蛋白對SH-SY5Y具有毒性作用，PD細胞模型建立成功。而增加HSP70的表達后，對比α-突觸核蛋白野生型(α-synuclein WT)+ pCDNA3.1組和α-突觸核蛋白突變型(α-synucleinA53T)+pCDNA3.1組，表達HSP70能分別提高α-synuclein WT和α-synuclein A53T引起的細胞活性降低(P

3討論

α-突觸核蛋白是一種分布于中樞神經系統突觸前末梢，約15~20 kD的可溶性蛋白質。自然狀態下呈一種非折疊構象，不形成明顯的三維結構，但其N末端2/3的序列可以形成一系列雙極性區域，可能介導其與膜結構的結合;當高濃度或異常修飾時，構象改變形成寡聚體甚至是聚集體，具有細胞毒性〔7，8〕。與單體不同，這類寡聚體富含8片層結構，在原子力顯微鏡及電鏡下，可以觀察到這類寡聚體形成過程中，一般先呈包含20～30個α-突觸核蛋白分子的圓狀結構;隨后因彼此聚合形成鏈狀結構，最終轉化為穩定的纖維狀結構。這種由單體向纖維狀結構的改變，可能是α-突觸核蛋白產生毒性作用的重要原因〔5，10〕。研究進一步發現，與家族性PD有關的α-突觸核蛋白 A53T及A30P突變蛋白在體外均可以促進寡聚體的形成，同時，野生型α-突觸核蛋白的過量表達也可以導致寡聚體的增加〔11，12〕。當機體無法處理有毒的α-突觸核蛋白中間體時，可能會導致α-突觸核蛋白形成聚集體，最終導致PD的發生〔11，13，14〕。

分子伴侶作為一類介導協助蛋白形成與維持天然構象的重要細胞因子，在α-突觸核蛋白蛋白結構狀態轉換過程中可能發揮著很重要的調控作用。實驗表明，路易小體中除α-突觸核蛋白外，還含有其他蛋白質，而HSP是其中重要的蛋白之一〔15〕。當α-突觸核蛋白本身結構的改變或分子伴侶、降解系統出現異常時，α-突觸核蛋白的毒性作用就體現出來了。在模型動物的研究中發現，分子伴侶(HSP70、HSP40)的表達可減輕α-突觸核蛋白的細胞毒性。譬如，在PD果蠅模型中，HSP70的表達可以減輕或阻止α-突觸核蛋白引起的神經元損傷;而在酵母中HSP70水平的增加也可以有效地減緩或抑制PD的發生〔3，4〕。因此，分子伴侶蛋白可能通過協助α-突觸核蛋白形成并維持正確構象而防止其聚集產生有毒害作用的聚集體。本研究中，利用α-突觸核蛋白過表達細胞模型發現，過表達HSP70后能使PD細胞活性增加，說明HSP70對PD細胞模型具有保護作用。過表達HSP70后，α-突觸核蛋白的表達量也降低，而目前已知α-突觸核蛋白是導致PD發生的重要因素〔11，13，14〕，因此認為HSP70對PD細胞模型的保護作用是通過減少α-突觸核蛋白的表達量的表達量而實現的。由于

α-突觸核蛋白的細胞毒性作用與其由單體向寡聚體轉化有關〔9，10〕，因此推測，HSP70可能通過參與維持α-突觸核蛋白的正確構象，減少其向有毒的寡聚體和聚集體狀態進行轉化，減少細胞的毒性作用。

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篇5

目的 構建人熱休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表達載體，為進一步研究HSP70對應激狀態下細胞的保護作用提供實驗基礎。方法 采用AdEasy系統構建攜帶外源性HSP70編碼基因的重組腺病毒載體pAdHSP70，脂質體法轉染人胚腎293細胞，包裝產生重組腺病毒vAdvHSP。收獲病毒進行滴度鑒定， RTPCR方法檢測目的基因在Hela細胞的轉錄表達。結果 PCR、序列測定以及限制性酶切證實HSP70基因正確插入腺病毒表達載體，并在HEK293細胞中包裝出重組腺病毒；熒光顯微鏡下可觀察到GFP的表達，收獲病毒的滴度為3.2×1012 U/L。結論 成功構建pAdHSP70重組腺病毒表達載體，且重組腺病毒在Hela細胞能有效轉錄。

【關鍵詞】 HSP70熱休克蛋白質類 腺病毒科 遺傳載體

［ABSTRACT］ Objective To construct recombinant adenovirus expression vector containning human HSP70 and provide a base for investigating the protection of HSP70 on the cellunder stringent state. Methods The recombinant adenovirus vector pAdHSP70 carrying HSP70 was constructed with AdEasy system and then transfected 293 cells to produce recombinant adenovirus vAdHSP70. The viral titer was tested. The expression of target gene in Hela was tested by RTPCR. Results It was confirmed by PCR， sequencing identification and restrictive analysis that the target gene was cloned correctly to the shuttle plasmid. The expression of GFP could be observed by fluorescence microscope. The viral titer was 3.2×1012 U/L， and RTPCR indicated that HSP70 could effectively express in Hela. Conclusion Recombinant adenovirus vector was constructed successfully and packed in 293 cells.

［KEY WORDS］ HSP70 heatshock proteins; Adenoviridae; Genetic vectors

熱休克蛋白70（HSP70）是一組高度保守的蛋白，作為一種重要的應激蛋白，HSP70可參與應激狀態下細胞內蛋白的正確折疊、移位以及降解等，從而維持細胞的正常形態及功能，保證細胞的穩定性。研究結果表明，HSP70在正常情況下表達水平很低或不表達，而在應激狀態下細胞內熱休克蛋白編碼基因被激活，表現為表達上調。本研究旨在將外源性HSP70編碼基因插入含GFP標記基因的腺病毒載體中構建重組腺病毒載體，經293細胞包裝獲得可高效轉錄表達HSP70的重組腺病毒，為探討外源性HSP70表達對應激狀態下靶細胞的保護作用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，限制性核酸內切酶PacⅠ和PmeⅠ為英國NEB公司產品；DNA Marker、限制性內切酶EcoRⅤ和KpnⅠ、T4 DNA連接酶、pMD18T載體為大連寶生物工程公司產品；TRIzol購自美國Invitrogen公司。攜帶GFP報告基因的腺病毒穿梭質粒pAdTrackCMV，E1區和E3區缺失的復制缺陷5型腺病毒骨架質粒pAdEasy1，大腸桿菌JM109、BJ5183和 DH10B以及人宮頸癌細胞系Hela和人胚腎293細胞均由青島大學醫學院微生物學教研室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA提取及逆轉錄合成cDNA Hela細胞用含體積分數0.10的胎牛血清、105 μg/L 鏈霉素、105 U/L青霉素的DMEM于37 ℃、體積分數0.05的CO2培養箱內培養。當細胞達80%匯合后，42 ℃水浴30 min，然后迅速放回培養箱中繼續培養8 h，胰蛋白酶消化離心收集細胞，采用TRIzol一步法提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒操作說明合成cDNA 。

1.2.2 目的基因的PCR擴增及TA克隆 根據GenBank中編碼HSP70的核苷酸序列及pAdTrack　CMV載體的多克隆位點，采用Primier 5.0軟件設計擴增HSP70基因的特異性引物。并分別在兩條引物中的5′端引入KpnⅠ和EcoRⅤ酶切位點以及保護性堿基。上游引物序列為：5′CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC3′，下游引物序列為：5′GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC3′，下劃線部分為引入的酶切位點。引物由上海生工生物技術服務有限公司合成，擴增片段長度為1 486 bp。反應體系為：10×buffer 2.5 μL， MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U， cDNA 2 μL，無菌去離子水補至25 μL。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環； 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴增產物于1 g/L的瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）中電泳，凝膠自動成像系統分析結果。

自瓊脂糖凝膠中回收純化目的基因，然后與PMD18T載體在連接酶的作用下進行連接，將連接產物以1×TSS 兩步法轉化E.coli JM109，涂布于氨卞抗性的LB平板，37 ℃過夜培養。次日挑取平板克隆振蕩培養后提取質粒，KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切鑒定篩選陽性克隆，產物送上海生工生物技術有限服務公司測序。

1.2.3 穿梭載體pAdTrackCMVHSP70的構建 測序確證序列正確無誤后，分別用限制性內切酶KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切目的基因片段和穿梭載體pAdTrackCMV，并在T4 DNA連接酶作用下以摩爾比1∶3進行連接。將連接產物全部轉化已準備好的感受態細菌JM109，取轉化菌涂布于含卡那抗性的LB瓊脂平板，37 ℃培養14～16 h。然后，從轉化菌平板上挑取若干個生長良好的單個菌落接種至5 mL含卡那霉素的LB 培養液中，37 ℃振蕩培養16～24 h，取1.5 mL培養液用堿裂解法小量提取質粒。將所提質粒使用限制性內切酶KpnⅠ和EcoRⅤ進行雙酶切電泳鑒定，陽性克隆命名為pAdTrackCMVHSP70。

1.2.4 重組腺病毒載體AdHSP70的構建 將pAdTrackCMVHSP70線性化和去磷酸化，隨后與腺病毒骨架質粒pAdEasy1在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組。自平板挑取較小克隆轉入卡那抗性LB培養液中振蕩培養16 h，采用堿裂解法小量提取質粒，進行PacⅠ酶切鑒定，鑒定為陽性者命名為pAdHSP70。

1.2.5 293細胞包裝腺病毒和重組腺病毒滴度測定 QIAGEN質粒純化試劑盒純化AdHSP70后，用PacⅠ酶切線性化，脂質體法轉染對數生長期的293細胞包裝重組腺病毒，同期制備載體對照。用本原正陽公司快速腺病毒感染滴度（TCID50）檢測試劑盒測定所獲腺病毒滴度，操作按說明書進行，并計算病毒滴度。計算公式：病毒滴度=101+d(s+0.5)×103U/L， d=log10稀釋度，s=陽性比率之和。

1.2.6 病毒感染靶細胞后RTPCR檢測目的基因 取100 μL重組腺病毒液感染Hela細胞，3 d后約90%的細胞觀察到綠色熒光時收集細胞， TRIzol一步法提取細胞總RNA，所獲RNA加DNaseⅠ消化處理可能污染的DNA，應用RTPCR檢測目的基因mRNA的表達。并取5 μL DNaseⅠ消化處理的RNA直接作為模板進行PCR作為對照，以確定是否有DNA污染。PCR產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果

2.1 HSP70編碼基因的PCR擴增及pAdTrackCMVHSP70的酶切鑒定

采用RTPCR自熱刺激Hela細胞擴增HSP70編碼序列cDNA，可在約1 486 bp處觀察到特異性擴增條帶，與理論預計值相符且測序后與GenBank報道的HSP70編碼序列完全一致。見圖1。內切酶KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切重組質粒pAdTrackCMVHSP70，電泳后可觀察到長約9.2 kb的載體片段和長1 486 bp的目的基因片段，表明目的基因片段成功插入表達載體。

2.2 重組腺病毒載體pAdHSP70的鑒定

重組腺病毒載體pAdHSP70經限制性內切酶PacⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳可觀察到長4.5 kb和30 kb左右的兩條帶，結果提示穿梭質粒pAdTrackCMVHSP70和骨架質粒pAdEasy1的重組發生在ori與右臂之間。見圖2。

2.3 重組腺病毒的包裝

質粒pAdHSP70經PacⅠ酶切線性化后，用脂質體法轉染293細胞，轉染48 h后在熒光顯微鏡下可觀察到細胞內的綠色熒光，表明質粒轉染成功，外源基因開始表達。之后表達綠色熒光蛋白的細胞數目逐漸增多，轉染后5 d達高峰，細胞開始變圓、脫落，第7～9天約90%的細胞表達熒光蛋白時收獲細胞，反復凍融3次后離心除去細胞碎片，取上清的1/3繼續感染293細胞以擴增病毒，24 h后細胞內開始出現熒光并逐漸增多，說明包裝出的重組腺病毒具有感染性且在細胞內不斷增殖。重復上述過程3～4次即可獲得大量具有穩定感染性的重組腺病毒，所獲病毒命名為vAdHSP70，經檢測病毒滴度為3.2×1012 U/L。

2.4 RTPCR檢測

提取經重組腺病毒感染的Hela細胞總RNA經RTPCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后可明顯觀察到特異性長為1 486 bp大小的片段，而未感染腺病毒和熱應激處理后的Hela細胞此條帶相對較弱。見圖3。

圖1 目的基因的RTPCR擴增及重組質粒pAdTrackCMVHSP70的雙酶切分析（略）

①Marker DL15000;②HSP70 mRNA RTPCR產物;③pAdTrackCMVHSP70 PCR 產物s;④pAdTrackCMVHSP70/KpnⅠ與EcoRⅤ酶切產物;⑤pAdTrackCMVHSP70

圖2 同源重組質粒的PacⅠ酶切鑒定（略）

①Marker DL2000;②AdHSP70 PCR產物；③pAdTrackCMVHSP70/PacⅠ酶切產物;④AdHSP70/PacⅠ酶切產物；⑤AdHSP70；⑥Marker DL15000

圖3 RTPCR檢測Hela細胞中HSP70的表達（略）

①Marker DL2000；②vAdHSP70感染Hela細胞；③未感染腺病毒和熱應激處理的Hela細胞；④Hela細胞對照

3 討論

生物體在受到周圍環境刺激或不良因素影響時，會產生一系列為適應環境變化而做出的快速細胞代謝調節。在這期間，細胞內某些正常基因的表達受到抑制，而另外一些特殊的基因則被激活，表現為表達上調，其中熱休克蛋白就是這類特殊的基因。迄今為止，已發現30余種熱休克蛋白，根據同源性和相對分子質量大小，可將其分為HSP70、HSP90、HSP60、小分子HSP以及泛素等[1]。其中HSP70是熱休克蛋白家族中含量最多也是最保守的一類。

研究發現，HSP70具有明顯增強應激狀態下細胞對損害的耐受程度、維持細胞正常功能代謝和提高細胞生存率等作用[2]。DONNELLY等[3]研究結果表明，HSP70在心肌細胞的過量表達是提高心肌對缺血再灌注耐受性的重要途徑之一。KINOUCHI等[4]用免疫組化法檢測大鼠大腦中動脈阻斷后HSP70蛋白的表達，研究結果顯示HSP70 蛋白在梗死灶周圍神經元，即缺血半影區大量表達。MATSUYAMA等[5]和SAKURAI等[6]將缺血預處理分別用于狗和兔的脊髓缺血性損傷保護作用的實驗研究，他們在脊髓缺血前48 h進行缺血預處理，發現脊髓缺血后HSP70的表達增強而且表達時間延長，因而減少隨后的脊髓缺血造成的損傷。在這諸多研究中，大多采用熱誘導、缺血預處理等方法來誘導內源性HSP70的表達，以證明其保護作用。這種方法簡單、直接，但是仍存在一些弊端。因為實驗過程中，在對機體給予熱刺激或者缺血預處理等的同時，除HSP70基因水平的升高以外，其他基因的表達也會不同程度地受到影響。相對而言，利用分子生物學技術將攜帶外源性HSP70基因的載體導入特定細胞，使其在細胞內穩定表達，能夠更加客觀地研究HSP70在應激狀態下對靶細胞的保護作用。因此，如何大量獲取外源性HSP70基因和選擇高效、安全的載體就顯得格外重要。

HSP70普遍存在于所有真核和原核生物體中，但表達量很低。而在機體處于應激狀態，包括熱應激，化學物質（氧自由基、乙醇等）刺激，缺血低氧，感染以及嚴重創傷等時表達量明顯增加[7～9]。而在這些應激中，熱應激是誘導HSP70大量表達的最重要因素。研究報道，雖然腫瘤細胞內HSP70的表達高于正常細胞，但含量仍然較低，將其在熱療等應激條件下處理后HSP70產生明顯增多[10]。而對于不同溫度誘導引起HSP70表達量的差異，VAN等[11]報道，較激烈的熱誘導（43 ℃）作用于腫瘤細胞僅有少量HSP70蛋白表達，而較緩和熱誘導（42 ℃），可于誘導后8 h出現且持續高水平表達的HSP70蛋白，激烈的熱休克刺激(45 ℃)可導致腫瘤細胞來不及合成HSP70，以致死亡。在本實驗中我們從溫熱休克處理后8 h人宮頸癌細胞系Hela中提取外源性HSP70 mRNA作為模板進行擴增，結果顯示擴增后目的基因與理論預計值相符，經測序與GenBank中的序列一致。同時，我們選擇了宿主范圍廣、包裝容量大，對人致病性低、滴度高，在增殖和非增殖細胞中均感染和表達基因且與人類基因同源的腺病毒作為載體[12]，并通過AdEasy系統與骨架質粒pAdEasy1在大腸桿菌內同源重組而獲得重組腺病毒載體[13]。

本實驗成功構建了攜帶外源性HSP70基因的重組腺病毒表達載體，并在293細胞中包裝獲得重組腺病毒vAdHSP70，應用RTPCR鑒定結果表明，vAdHSP70重組腺病毒可在靶細胞中高效轉錄。從而為進一步研究HSP70對應激狀態下的細胞保護作用及其在臨床治療和診斷中的應用奠定了實驗基礎。

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篇6

[關鍵詞]熱休克蛋白質 視網膜神經節細胞 高眼壓 熱耐受 免疫組化

熱休克蛋白(heal shock protein，HSP)是一組所有的細胞能在應激情況下由熱休克基因所編碼合成的序列高度保守的伴隨細胞蛋白，并能對抗更為嚴重的應激損傷，這種現象稱為熱休克反應(heat shock response，HSR)[1]。目前認為熱休克反應是細胞對各種不利因素刺激所表現的一種以基因表達和調控方面發生改變的反應。目前的研究發現高溫、缺氧、再灌注局部損傷或感染等多種有害因素刺激均可產生熱休克蛋白[2]。

HSP通常按分子量大小進行分類，主要有HSP70、HSP90、HSP60以及小分子HSP[3]。在HSP家族中，HSP70與神經保護有著最為密切的聯系。研究發現高熱誘導HSP合成后具有保護光感受器免受光損害的作用[4]。而熱耐受是否可以提高在體眼急性高眼壓視網膜HSP70的表達而減少組織細胞的損傷，目前尚未見報道。為此，本研究在眼急性高眼壓動物模型建立的基礎上，研究眼急性高眼壓后視網膜HSP70的動態表達情況以及熱耐受后對在體眼急性高眼壓視網膜HSP70表達的調節，為急性青光眼的藥物防治提供相關理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只清潔級Sprague―Dawley(SD)大鼠，鼠齡2～3周，雌雄不限，體重50～100g。實驗前散瞳并行裂隙燈顯微鏡檢查排除角膜病、葡萄膜疾病、晶狀體及玻璃體等疾病。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗鼠HSP70單克隆抗體(濃縮型)，S-P超敏免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新公司，其余試劑均為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物

(1)分組：56只SD大鼠隨機隨機分為2組，分別為高眼壓組、水浴+高眼壓組。每組28只，右眼為實驗眼。①高眼壓組組：28只，隨機分成7個亞組，每組4只。分別為：A：不予高眼壓立即取材組；B：高眼壓后立即取材組；C：高眼壓后2 h取材組；D：高眼壓后4 h取材組；E：高眼壓后12 h取材組；F：高眼壓后24 h取材組；G：高眼壓后36h取材組。②水浴+高眼壓組：28只，隨機分成7個亞組，每組4只。分別為：A：水浴后立即取材組；B：水浴+高眼壓后立即取材組；C：水浴+高眼壓后2 h取材組；D：水浴+高眼壓后4 h取材組；E：水浴+高眼壓后12 h取材組；F：水浴+高眼壓后24 h取材組；G：水浴+高眼壓后36 h取材組。 (2) 急性高眼壓模型制作方法及水浴方法：急性高眼壓模型按賈莉君等[5]介紹的方法，具體步驟如下：大鼠予10％水合氯醛3mg／kg體重腹腔內注射麻醉后固定在鼠用立體定位儀上，用4號半一次性輸液針頭作右眼前房穿刺，經一次性消毒輸液器連接乳酸鈉林格氏液輸液瓶，將液面高度調整至距實驗眼水平面1387mm，使之產牛102 mmHg靜水壓，在大鼠右眼前房內持續加壓灌注，2 h后撥出針頭，大鼠自行蘇醒。水浴時將SD大鼠麻醉后置于45℃ 恒溫水中，肛溫表測量其直腸溫度達40.5～41.5℃ ，維持10 min，常溫下置放3 h后制高眼壓模型。

1.3.2 取材和切片

戊巴比妥鈉按35mg/kg 行大鼠腹腔注射，待大鼠深度麻醉后，將大鼠固定于手術臺上。剪開大鼠胸部皮膚及胸廓組織后，暴露出心臟，剪開左心室尖，插入供灌注用的9號灌注針頭至升主動脈，止血鉗夾閉主動脈并固定灌注針頭，先用生理鹽水l00mL以40mL/min 速度推注，后快速推注40g/L的多聚甲醛200mL左右(防止視網膜神經節細胞變性)，直到大鼠全身僵硬。完整取出大鼠的左右眼球，分別放入40g/L 的多聚甲醛中，30min后用前房穿刺刀穿刺前房，2h后將角膜、晶狀體剔去(大鼠的玻璃體極少)制成眼杯，再將眼杯繼續固定4～6h，取出眼杯后依次梯度灑精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，同一標本連續切出3～4張厚度為5um的切片，免疫組化使用。

1.3.3 免疫組化染色

石蠟切片常規脫蠟、水化；加3％ H2O2室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性；加1：100稀釋的HSP70單克隆一抗，陰性對照用PBS代替一抗，37℃溫育30min；加聚合物增強劑室溫下孵育20 min；加酶標抗鼠／兔聚合物，室溫下孵育30min；加新鮮配制的DAB顯色液顯色3～10min，顯微鏡下控制顯色時間，自來水充分沖洗，蘇木素復染40s，lg/L 鹽酸酒精分化2s，自來水沖洗返藍l5min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.4 免疫組化結果判定

光鏡下觀察胞漿或胞核內呈現不同程度的棕黃色粗大顆粒反應者為抗HSP70抗體染色陽性細胞，反之染色陰性。每份標本取一張未復染切片，每張切片隨機取3個視野，應用LeicaQ5OOMC圖像分析儀對陽性反應部位進行平均灰度和面密度分析。灰度值采用Median(QR)表示，記錄相應數據，取平均值作為該標本的結果，結果進行統計分析。

1.4 統計學分析方法

實驗中HSP70表達強度的統計數據采用SPSS 13.0軟件進行分析 。對兩實驗組(高眼壓組和水浴＋高眼壓組)間、兩組的A-F亞組結果之間的比較采用兩因素析因方差分析(即組別、時段兩因素)，A組和其他各亞組間的比較采用Dunnett-f檢驗，兩實驗組同一亞組間的比較采用t 檢驗，以P

2 結果

免疫組化結果：圖1為正常視網膜組織切片光鏡下的神經節細胞，免疫組化顯示棕黃色顆粒位于視網膜神經節細胞(RGCs)胞漿內(圖2、圖3、圖4)，其余各層均未見明顯表達，各組及亞組圖像分析平均灰度值Median(QR)見圖5。

通過析因分析，顯示高眼壓組與水浴+高眼壓組兩組組間、不同亞組間HSP70表達強度比較，差異有統計學意義(組間及亞組間P值均小于0.01)。高眼壓組和水浴+高眼壓組HSP70 蛋白的表達強度均于高眼壓后4 h開始增強(與各自A組相比行Dunnett-t檢驗，P=0.00)， 24后h達到高峰， 36小時后回落，但仍高于正常組(與各自A組相比行Dunnett-t檢驗，P=0.00) 。

水浴后大鼠視網膜神經節細胞HSP70的表達基礎水平提高，水浴＋高眼壓組A～F各亞組的HSP70表達強度均較相應高眼壓組高，差異均有統計學意義(t值分別為-4.25，-5.78，-l1.05，-8.31，-7.29，-6.77，-4.31；其P值均小于0.05)。36 h后水浴＋高眼壓組的HSP70表達強度雖然回落，但與高眼壓組相比，差異仍然有統計學意義(t=-6.77，P

3 討論

近年來，抗青光眼手術設計日臻完善，加之各種高效降眼壓藥物的開發和應用，將青光眼患者的眼內壓控制在靶眼壓以內不再象以前那樣困難，但即使是最大限度地降低了眼內壓，仍不能阻止部分患者視功能惡化。另外，正常眼壓性青光眼患者的眼內壓正常，發病機制不清，降眼壓治療缺乏針對性，視神經保護的研究成為研究的熱點和難點。

熱休克蛋白與青光眼視神經保護的研究日益受到重視，而在HSP家族中，作為與神經保護聯系最密切的HSP70，其保護視神經的機制包括：（1）通過分子伴侶作用在蛋白質代謝過程中發揮著極其重要的作用。分子伴侶作用的主要功能包括：幫助新合成蛋白質的折疊，防止其互相聚集；幫助蛋白質的細胞內移位；幫助變性蛋白質復性以及清除嚴重受損的蛋白質[6]。（2）幫助細胞對抗凋亡刺激因素侵襲，這些因素有熱休克、腫瘤壞死因子、生長因子、氧化應激、化療藥物、宇宙輻射等。所有HSP中，HSP70是凋亡的主要抑制者[7,8]。（3）保護線粒體使之免受活性氧族的毒害作用的作用[9]。

本實驗模擬青光眼高眼壓環境，探討急性高眼壓條件下RGCs與HSP70表達的關系。結果表明在前房內加壓灌注時，眼內壓急劇升高；當眼內壓超過大鼠尾動脈壓的75％(102 mmHg)時，視網膜動靜脈血流由于機械受壓停止，RGCs處于缺血和機械受壓應激狀態下，在缺血再灌注4小時后細胞內HSP70的表達增加,并逐漸加強 ,到24小時達到高峰，36小時后開始減少。HSP70的表達呈峰時出現亦說明HSP70作為一種應激蛋白，其蛋白保護作用具有時間依賴性。

本實驗還探討了熱耐受對RGCs的HSP70表達的調節作用。 熱耐受(thermotolerance)作為HSP的一個重要生物學功能，是指細胞經過預先的熱休克處理后誘導HSP的合成，使細胞能夠耐受一個更為強烈的熱處理。Caprioli[10]等研究提示通過熱耐受可以提高視網膜細胞的耐熱能力，從而減少組織細胞的損傷。本實驗采用45℃ 溫水浴的方法，通過溫水浴加熱大鼠，使熱量均勻傳導至全身。由于熱耐受與HSP表達有關，因此若要產生熱耐受，則第2次的應激一般要在第1次熱休克恢復期，有研究顯示[11]大鼠熱休克后恢復37℃ 2―3 h再給予第2次的應激是必要的。因此本實驗在給予第二次應激時，予常溫恢復是必須的。本實驗結果顯示HSP70表達的峰值時間高眼壓組與水浴組一致，但水浴組的轉錄強度均高于高眼壓組，差異有統計學意義。

本研究結果證實，熱應激能誘導RGCs內源性HSP70的表達，從而提高RGCs對急性高眼壓的耐受性，起到保護視神經的作用。

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篇7

[關鍵詞] 消化性潰瘍；中醫證型；中藥方劑；熱休克蛋白70；瘦素

[中圖分類號] R259 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）02（a）-0084-03

The influence comparison on expression of heat shock protein 70 and Leptin by two types Chinese herbal medicine prescription in the treatment of peptic ulcer

LI Changjun ZHANG Ping

Department of Gastroenterology， Hubei Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces， Hubei Province， Wuhan 430061， China

[Abstract] Objective To observe the expression influence of heat shock protein 70 （HSP70） and Leptin on patients with peptic ulcer （PU） treated by traditional spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi prescription. Methods 41 patients with Helicobacter pylori （HP） positive in active stage in Hubei Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces from October 2011 to April 2013， were divided into two groups， of which there were 19 cases with deficiency cold of spleen and stomach （control group）， 22 cases with qi-stagnation of liver and stomach （treatment group）. The two groups were treated respectively by spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi decoction while using western medicine， reexamination of gastroscope and HP were taken after 6 weeks. The HSP70 and Leptin content in serum were tested by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The HP eradication rat and gastroscopic curative effect were not significantly different between control group and treatment group （P > 0.05）. The HSP70 and Leptin content were no significant differences between control group and treatment group before treatment （P > 0.05） after treatment， the content of HSP70 in control group was significantly higher than that in the treatment group （t=3.531， P < 0.01）， the content of Leptin improved was much higher in treatment group than that in control group （t=2.487， P < 0.05）. Conclusion There are intensive difference on expression of HSP70 and Leptin in serum of patients with peptic ulcer treated by traditional spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi prescription， the medicine physicians should attach much weight to the consistence of TCM syndrome type and Chinese herbal medicine prescription.

[Key words] Ulcer peptic； TCM syndrome type； Chinese herbal medicine prescription； Heat shock protein 70； Leptin

由于獨特的預防和治療作用，尤其在某些疾病上發揮著化學藥品不可替代的重要作用，各大醫院采購品種繁多的中成藥[1]，我國約70%的中成藥由綜合醫院西醫醫師開出，但不合理使用率高達四成。許多中成藥也被聯合運用于消化性潰瘍（peptic ulcer，PU）治療，PU病理過程中相關因子的變化及中藥或中成藥對相關因子的影響及該影響對優勢療效的作用有許多與單用西藥的對照性報道[2]。由于不少中成藥已從傳統的以主治證命名方式改變為有的以功效和作用命名，有的以治療某病命名，甚至冠以通俗效能名，雖然方便了臨床醫師運用，但也易產生對病不對證等問題。中藥治病，處方基于中醫辨證，鑒于以辯證分型為基礎的分類中藥方劑機制對照研究不多，以及西醫醫師缺乏中醫辨證的相關知識與經驗，本文對中西醫結合治療PU過程中不同類別中藥對患者熱休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）及瘦素（Leptin）表達的影響進行比較分析，望提高西醫醫師對中成藥對證作用的重視，并對西醫醫師盡量準確對證使用中成藥提出建議。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年10月～2013年4月武裝警察部隊湖北省總隊醫院門診患者41例，均經胃鏡檢查證實為活動期潰瘍，并經活檢排除胃癌；幽門螺桿菌（helicobacter pylori，HP）快速尿素酶檢測及14C尿素呼氣試驗均為陽性；男32例，女9例，年齡22～52歲；胃潰瘍9例，十二指腸潰瘍32例。患者4周內未服用抗生素、鉍劑、抑酸劑及對HP有抑制作用的藥物，有嚴重心、肺、肝、腎及內分泌疾病；多發性及復合性或有嚴重并發癥；疑有惡變或有外科手術指征；特殊類型胃潰瘍或十二指腸潰瘍（如胃泌素瘤患者）；不愿、不便參與及有心理精神疾患者，均不列入觀察。脾胃虛寒型（對照組）19例，男15例，女4例，年齡23～50歲，胃潰瘍4例，十二指腸潰瘍15例；肝胃氣滯型（治療組）22例，男17例，女5例，年齡22～52歲，胃潰瘍5例，十二指腸潰瘍17例。各組年齡、性別、職業、飲酒、吸煙、飲食習慣等差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器

人熱休克蛋白70 ELISA試劑盒（美國RD公司）；人瘦素ELISA試劑盒（安徽安科生物工程股份有限公司）；Elx800自動酶標儀（美國Bio.TekInstruments公司）。

1.3 方法

1.3.1 中醫分型及療效判定標準 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》（試行）[3]，中醫辨證分型標準：必備胃痛隱隱，喜暖喜按主癥，兼具其余主癥中1項加次癥2項為脾胃虛寒型；必備胃脘脹痛，兩脅脹悶，兼具其余主癥中1項加次癥2項為肝胃氣滯型。胃鏡療效判定標準：臨床痊愈為潰瘍及周圍炎癥全部消失；顯效為潰瘍消失，仍有炎癥；有效為潰瘍縮小50%及以上；無效為潰瘍縮小不及50%。

1.3.2 治療方法 兩組患者均給予泮托拉唑（海南海力制藥有限公司，批號：11120290）40 mg/d，餐前0.5 h服用，2次/d；阿莫西林膠囊（珠海聯幫制藥股份有限公司中山分公司，批號；18578）1000 mg/d、克拉霉素分散片（黑龍江肇東華富藥業有限責任公司，批號：100901）500 mg/d，2次/d，餐后即服；10 d后，泮托拉唑20 mg，1次/d；1個月后，雷尼替丁（杭州民生藥業有限公司，批號：4110101）300 mg/d，2次/d。對照組加服自擬健脾溫中湯（由黨參20 g，炒白術15 g，炙甘草10 g，干姜6 g，肉桂3 g等組成，由本院制劑室制作成煎劑，每袋100 mL，下同），200 mL/d，2次/d，飯前1 h服用；治療組加服自擬自疏肝理氣湯（由柴胡15 g，陳皮15 g，香附10 g，枳殼12 g，炙甘草6 g等組成），飯后1 h服用，均每7天為停服1 d。6周后進行胃鏡等復查。

1.3.3 標本采集和處理 治療前后，每例患者取胃竇及胃體黏膜組織各2塊做尿素酶試驗；清晨空腹，用帶分離膠的血清采集管采前臂靜脈血6 mL，室溫靜置1 h，離心取上清2 mL分裝2個EP管，分置-27℃、-85℃冰箱保存。

1.3.4 血清標本檢測方法 按ELISA試劑使用說明進行操作，在酶標儀450 nm波長下測定光密度值（OD值），以曲線回歸方程計算樣品濃度，再乘以稀釋倍數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HP根除率

對照組17/19（89.47%），治療組20/22（90.91%），兩組比較，差異無統計學意義（χ2=0.024，P=0.877 > 0.05）。

2.2 胃鏡療效

對照組19例，痊愈15例（78.95%），顯效2例（10.53%），有效1例（5.26%），無效1例（5.26%），總有效率94.73%。治療組22例，痊愈18例（81.82% ），顯效2例（9.09% ），有效1例（4.55% ），無效1例（4.55%），總有效率95.45%。兩組臨床痊愈率比較，差異無統計學意義（χ2=0.054，P=0.817 > 0.05）。

2.3 血清HSP70及Leptin含量

治療前兩組血清HSP70及Leptin含量比較，差異無統計學意義（t=0.052，t=0.197，P > 0.05）。治療后，對照組HSP70含量顯著增加（t=25.241，P < 0.01），治療組亦明顯增加（t=2.136，P =0.045 < 0.05），對照組增加顯著高于治療組（t=3.531，P =0.001 < 0.01）；治療組Leptin含量顯著提高（t=97.018，P < 0.01），對照組明顯提高（t=0.264，P =0.472 < 0.05），治療組提高明顯高于對照組（t=2.487，P =0.017 < 0.05）。表明健脾溫中與疏肝理氣類中藥對PU患者HSP70及Leptin的表達促進作用存在強度區別。見表1。

表1 兩組患者治療前后血清HSP70及Leptin含量比較（ng/mL，x±s）

注：與對照組治療后比較，*P < 0.05，**P < 0.01；HSP70：熱休克蛋白70；Leptin：瘦素

3 討論

中醫中藥在治療消化性潰瘍方面積累了豐富經驗，有許多臨床觀察和研究[4]，中西醫結合治療PU能提高療效，能更快地改善臨床癥狀[5]，但對按中醫辯證分型確定的不同類中藥配方進行較為深入機制對照研究不多。基于任何有效的中藥方劑都可能被制作為中成藥的考慮，筆者根據辨證分型以對證的自擬方劑合用西藥進行PU治療對照觀察，結果胃鏡下臨床痊愈率，對照組78.95%，治療組81.82%，與相關中藥方劑合用西藥療效接近[6]，再次說明中西醫結合治療能提高PU的療效。

各種生物受到外界不利或有害因素刺激時都會發生熱休克反應并產生熱休克蛋白（HSPs），它們具有參與蛋白折疊、轉運、機體免疫和細胞凋亡等多種生理功能[7]。HSP70是熱休克蛋白家族主要成員之一，其通過提高細胞對應激的耐受性、抑制炎性反應、抗氧化、抗凋亡等多種途徑發揮細胞保護作用。Leptin在機體內作用廣泛，在免疫功能，細胞增殖、分化、轉移和調亡等方面具有重要的調節作用，其對免疫功能和炎性反應的調節作用是目前的研究熱點[8]。有研究顯示，黃芪建中湯合失笑散能顯著增加消化性潰瘍患者血清HSP70及瘦素的表達水平，并通過它們各自的保護機制促進潰瘍愈合[9]，筆者觀察PU患者治療后HSP70及Leptin含量兩組有顯著和明顯增加，推測較好的中西醫結合療效可能與上述兩種因子通過相關環節與因素的保護作用有關。PU患者HSP70表達較正常人增強[10]，消化性潰瘍的發生可使黏膜組織中Leptin的表達增加[11]，PU病理過程中的相關因子因素對HSP70及Leptin的表達應該有激發作用。但也有研究表明，PU患者治療前Leptin水平與正常人接近，治療后水平輕度下降[12]，與相關研究結果不一致的原因有待進一步研究，與本研究結果不一致的原因，筆者推測可能與病例選擇標準及檢驗時間不同有關，更有可能是中藥的促進表達影響作用。HSP70及Leptin調控機制十分復雜，潰瘍病理過程中的組織壞死性毒素、缺氧、胃酸和疼痛等諸多刺激因素可激活HSP70表達，而Leptin的表達促進則受體脂含量、某些激素、炎癥等多因素影響。他們的調控與作用涉及相關基因水平的激活與抑制，包含激素、酶類、神經機制等諸多因子因素間環節相互作用與反饋作用。筆者觀察發現健脾益氣類中藥提升HSP70作用強勢于疏肝理氣類中藥，而疏肝理氣類中藥提升Leptin作用強勢于健脾益氣類中藥，提示兩類中藥對PU患者HSP70及Leptin的表達的促進強度存在區別。該結果雖不能代表兩類中藥作用的全面機制，也可能對證使用的表達促進強度差異對機體發揮保護作用是適宜的，但從HSP70及Leptin調控機制及環節作用分析，兩種因子的表達差異應該對機體整體病理生理產生不同影響。盡管HSP70及Leptin對機體不良影響研究不多，但上述差異對療效和機體在不對證使用中藥時可能產生的不利影響應引起重視，也提示西醫醫師使用中成藥時要認真考慮對證作用。至于差異的原因仍有待進一步研究，也應加強治療前與正常人和組內與單用西藥治療的對照觀察。

中醫的證，是對致病因素與機體反應性兩方面情況的綜合，辨證是根據患者的臨床表現，辨別出病變當前的位置和性質，既含病因又含機制。客觀而言，高年資中醫醫師能做到辯證精準也屬不易，加之中醫癥狀體征、病因病機描述術語及身體部位的概念與西醫又存在很大區別，要求西醫醫師正確辯證極不現實。有學者發現PU患者中醫各證型與感染HP關系比較有顯著差異性[13]，更有學者對慢性腎功能衰竭不同中醫證型與HSP70、尿水通道蛋白2含量等指標的關系作了研究[14]，即便如此，也很難做到西醫檢查的客觀依據與中醫辨證所需要素的有機對應。目前，除傳統的膏、丹、丸、散外，針劑、口服液等穩定安全的新劑型逐漸進入市場。但許多中成藥說明書，功能與主治說明既含中醫的證，也含西醫的病，或說明治療西醫某病中的某證，或按西醫藥理直接寫明某作用，如此勢必導致不熟悉中醫辯證的西醫醫師按病開藥，或按藥理和效能處方，不考慮對證或對證不準的問題在所難免。中醫界應加快與證相關檢查、檢驗客觀依據的定性、量化系統研究；中西醫結合工作者在中醫癥狀體征、部位術語等方面描述與西醫的差異要多作對照融通探索和宣教工作；單方復方機制研究，應將對證藥物可能引起對應癥狀體征改變的原因在機制上以現代醫學已有的病理生理及藥理認識和發展趨勢進行預測，開展如西醫的激動與阻滯、抑制與興奮似的中藥宏觀歸類與微觀作用的系列研究。要盡力減少只作與西醫相關因子符合性、驗證性的研究，避免支離性和分散性，中醫辨證分型結果關聯中藥性味，要把性味概念提升為西醫醫師易于理解的中藥藥理依據，中成藥說明書也應根據上述工作的開展作必要的內容調整。如此，也許能為西醫醫師盡量對證準確運用中成藥提供便利。

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篇8

“腫瘤”是非常令人恐懼的疾病，很多人都認為，“患了腫瘤，就判了死刑”，這種想法不完全正確，事實上有一部分腫瘤可以治愈，還有一部分患者可以帶瘤長期生存。

腫瘤治療理念的變化

隨著科學技術的不斷發展，對腫瘤研究的深入，治療方法也在不斷完善。如上個世紀腫瘤外科醫生側重于腫瘤的手術切除，因此，很多外科醫生認為，“我的手術做得好，手術以后就不用化療了”。實際上，經過多年的臨床實踐，大家逐漸將腫瘤的治療從單純手術或化療過渡到了外科手術后接受化療和放射治療，在此基礎上，又認識到手術前化療和放療的重要性（和腫瘤的性質、分期有關）。

隨著生物治療基礎研究的深入，特別是免疫治療在腫瘤治療研究的開展，使醫學工作者建立起新的腫瘤治療理念：腫瘤的治療是外科手術、藥物化療、放射治療和生物治療聯合的綜合治療，當前的生物治療主要是指免疫治療。

如何認識腫瘤的免疫治療

對于腫瘤的認識，大家早期覺得是一種“要命”的病，所以無論是醫生還是患者都認為必須想盡辦法先把腫瘤清除干凈，也就是常說的“為了保命，再難受也得用（化療）”。

通過多年的經驗發現，腫瘤化療過程中對患者的打擊很大，如化療出現的副作用（包括惡心、嘔吐、精神不佳、白細胞減少、免疫力下降等）導致患者的生活質量下降，身心健康受到嚴重影響，甚至部分患者的死亡與化療導致機體極度衰弱有直接關系。因此，現在的化療過程中，醫生對上述副作用予以了高度重視，認識到在治療腫瘤的同時，應該兼顧患者的生活質量。開發沒有或較小副作用的腫瘤治療方法一直是醫學工作者研究的重點之一。

二十世紀五十年代起，人們對腫瘤免疫學進行了大量研究，證明機體對腫瘤存在特異性免疫反應，為腫瘤治療打開一條新的思路，免疫療法成為腫瘤治療重要手段之一。

有觀點認為：手術、放療、化療能治愈部分腫瘤患者，不是由于上述療法殺死了全部腫瘤細胞，而是由于當腫瘤細胞負荷明顯降低時，機體的免疫功能恢復，清除了微小殘留病灶或明顯抑制了殘留腫瘤細胞的增殖。這說明機體免疫對腫瘤生長、轉化有重要意義。腫瘤的免疫治療和化療、放療相比，是一種副作用很小的“綠色治療”，是一種專門攻擊腫瘤細胞，而對正常細胞無損害的療法。

腫瘤的免疫治療主要包括：（1）腫瘤疫苗或主動免疫治療；（2）單克隆抗體以及過繼性細胞免疫治療；（3）細胞因子治療等。以下重點介紹一種腫瘤疫苗――混合熱休克蛋白/肽免疫治療。

混合熱休克蛋白/肽免疫治療機制

傳染病疫苗以預防疾病為主（如乙肝疫苗預防乙肝的發生），但是，我們研發的腫瘤疫苗大部分是治療性疫苗，這些疫苗通過特異性激活機體的體液和細胞免疫殺傷腫瘤細胞。腫瘤疫苗的優勢在于一旦應用成功，可產生長期的免疫記憶細胞，消除腫瘤微小殘留病灶并減少腫瘤復發，其缺點是干擾因素多，起效時間長。混合熱休克蛋白就是一種腫瘤疫苗。

混合熱休克蛋白（heart shock protein，簡稱HSP）是一種分子伴侶，其亞型HSP―70、Gp―96、HSP110具有結合腫瘤抗原和遞呈抗原的作用，因此從腫瘤細胞中分離提取的HSP―70、Gp―96、HSP110、攜帶了廣譜腫瘤抗原，類似DNA指紋庫，稱為熱休克蛋白/肽復合物。這三者都可遞呈抗原給T細胞，誘發CD4+、CD8+細胞反應，促進樹突狀細胞成熟，即促進了針對腫瘤的特異性細胞免疫，是誘發機體的抗腫瘤免疫作用的重要手段。它們具有多價性、特異性，只對自身的腫瘤有殺傷作用。

熱休克蛋白的另一種亞型HSP―60，具有活化機體非特異免疫作用，可活化吞噬細胞、樹突狀細胞、γδT細胞，以及自然殺傷細胞（NK），從而釋放多種細胞因子，并殺傷腫瘤細胞。

混合熱休克蛋白/肽的“綠色治療”

腫瘤患者，經過多次入院治療，通過對周圍患者的觀察，一定注意到：和自己年齡相近的患者，患相同部位、相同大小的腫瘤，全程接受同一醫生的治療方案，最后出現不同的結果，是什么原因呢？

我們知道同一個環境成長的兩個孩子，雖然他們的語言相似（當地的方言），飲食習慣相同，但是兩者之間仍然有很多性格方面的區別，成年后兩者的能力相差很大，此個體化性格造就了他們不同的發展前途。同樣的道理，同樣性質的腫瘤發生在不同患者的機體，一樣存在不同的腫瘤生物學特性（只是現在的科學技術還不能發現他們之間的所有差別），因此，采用同一治療方案對待不同的患者，自然會出現不同的治療結果，其實這也就是醫生常說的“患者的個體差異”。

那么，腫瘤患者在接受常規治療的同時，如何再增加一種針對他本人的個體化治療方案呢？解決這個問題就必須從每位患者人手。就像我們經常說的乙肝疫苗，它是通過對乙肝病毒信息深入研究的基礎上研制出來的，能夠把乙肝的信息作用于機體使機體產生預防乙肝病毒感染的能力，同時又不引起乙肝疾病。同樣的道理，我們通過對每位患者腫瘤組織的微觀信息進行深入研究，能否也從患者的腫瘤組織中獲取能夠代表他自己的“個體化腫瘤信息物質”，提取這種物質成分，注射到患者機體，使患者產生專門針對自己腫瘤的免疫反應，殺死腫瘤細胞，而對其他細胞不構成傷害呢？

混合熱休克蛋白/肽就是從腫瘤患者的腫瘤組織提取的、能夠特異性代表患者腫瘤的信息物質，其臨床應用實現了個體化腫瘤治療的理念。通過我們臨床應用的病例，證實它確實是只針對腫瘤細胞起作用，而對正常細胞不傷害的“綠色治療”，全部病例未發現明顯的副作用或不適表現。

混合熱休克蛋白/肽提取和臨床應用流程

接受本治療方法的前提是必須在患者接受腫瘤切除手術前和主管醫生聯系，因為手術后獲得新鮮的腫瘤組織是此治療的關鍵。具體包括以下流程。

1 收集患者的新鮮腫瘤組織（病理科固定后的標本不能提取混合熱休克蛋白/肽）。

2 通過免疫組化檢查腫瘤組織，確定患者腫瘤組織的微觀信息情況，包括有無表達上述文中提及的4種（即HSP―70、Gp―96、HSP110、HSP―60）熱休克蛋白，以及其量的多少。

篇9

摘要：目的：研究右美沙芬（DM）對激活的小膠質細胞的作用及熱休克蛋白60（HSP60）在DM神經保護中的作用機制。方法：培養BV2小膠質細胞株，分為對照組，細菌脂多糖組，（LPS），實驗組（DM）。Western-blot檢測DM對LPS激活的BV2細胞HSP60和Caspase 3的影響，ELISA檢測DM對HSP60釋放的作用。結果：LPS組中HSP60和Caspase 3的表達及釋放都比對照組顯著增加，加入DM后，這些因子的水平都明顯降低。結論：DM可能通過HSP60信號通路途徑阻止小膠質細胞的凋亡而發揮神經保護作用。

關鍵詞：熱休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小膠質細胞

中圖分類號：G642.423 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）18-0277-02

熱休克蛋白是機體的一類應激蛋白，在生理狀態下對機體起著保護功能。但是有研究發現，在病理情況下，很多細胞會大量表達熱休克蛋白60（HSP60），并將其釋放到胞外，引起細胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一種右旋嗎啡喃化合物[2]，對動物因低血糖或腦缺血引起的神經損傷具有保護作用，DM被證明能有效抑制小膠質細胞活化，并且可抑制細胞炎癥因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用機制目前尚不清楚。

一、材料與方法

（一）材料

右美沙芬和LPS購自Sigma公司；HSP60抗體購自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗體購自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA試劑盒購自Thermo公司；ELISA試劑盒購自欣博盛公司。

（二）方法

1.小膠質細胞BV2的培B。BV2細胞培養在DEME培養基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS處理30min后，在細胞培養液中加入DM溶液（10μM），作用24小時后收集細胞及上清。

2.Western blot檢測蛋白含量。藥物處理完畢，提取各實驗組的蛋白并收集上清液，10% SDS-PAGE分離后轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉膜2小時。然后加入一抗，置于4℃過夜。利用TBST洗滌膜三次，洗去未結合的一抗。最后用二抗室溫孵育1 h，利用ECL試劑顯色成像。

3.ELISA試劑盒檢測HSP60的釋放。按照HSP60 ELISA試劑盒操作說明進行實驗，最后酶標板置于酶標儀上，450nm處測定各孔光密度值（OD）。

4.統計學分析。采用SPSS11.11進行統計學分析。實驗數據用x±s表示，組間比較用方差分析，進一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

二、結果

（一）DM顯著抑制LPS激活的小膠質細胞HSP60的表達及釋放

LPS激活后的小膠質細胞中HSP60的表達明顯高于對照組，差異具有顯著性。加入DM可顯著抑制LPS引起的HSP60的升高，差異具有統計學意義（P

（二）DM抑制Caspase 3的表達

Western blot結果表明，LPS激活的小膠質細胞中Caspase 3的表達明顯高于對照組，在DM處理的實驗組中，Caspase 3的表達顯著下降，差別有統計學意義（P

三、討論

熱休克蛋白是一類應激蛋白，對機體主要起著保護作用。但是HSP60對細胞凋亡具有雙重作用。我們先前的研究發現心肌細胞中HSP60的表達和定位都發生了改變，導致心肌細胞的損傷或凋亡[4]。但是關于HSP60在神經系統中的作用的報道還很少見。

小膠質細胞的激活參與了多種神經系統退行性病變如老年癡呆癥、帕金森癥等的發生發展[5]。本研究假設HSP60在激活的小膠質細胞中高度表達，并被釋放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，導致周圍其他神經細胞的損傷或凋亡。本實驗證實了在LPS激活的小膠質細胞內HSP60的表達顯著增高，胞外也檢測到HSP60，并增強了Caspase 3的表達。這些結果與心肌細胞中關于HSP60的研究結果的報道一致，說明小膠質細胞活化后釋放至胞外的HSP60可進一步激活自身導致自身的凋亡。

右美沙芬可能是一種潛在的治療神經系統炎性疾病的藥物[6]。本實驗中，我們證實了DM能有效抑制小膠質細胞的激活，為一些神經退行性疾病的防治提供了潛在的藥物治療靶點。

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收稿日期：2016-11-30

基金項目：2016年國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201610752010）

作者簡介：王俊燕（1992-），女（漢族），寧夏銀川人，寧夏醫科大學生物技術專業本科生；李玲（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，專科，主治醫師，銀川市第一人民醫院高壓氧科，主要從事高壓氧神經科學研究；張燕（1992-），女，寧夏銀川人，寧夏醫科大學生物技術專業本科生；

篇10

【關鍵詞】 甲醛；適應性反應；蛋白質組

摘要： 目的 研究甲醛誘導真核細胞適應性反應及其可能的機制。方法 建立甲醛刺激人胚肺成纖維細胞(MRC-5)適應性反應模型；采用AlamarBlue還原率檢測細胞增殖。雙向凝膠電泳分離細胞總蛋白，圖像分析后選取差異蛋白點進行質譜鑒定。結果 AlamarBlue檢測結果表明，低劑量甲醛預刺激可誘導細胞適應性反應。雙向凝膠電泳結果顯示，甲醛刺激后19個蛋白斑點發生變化，肽指紋圖譜及肽序列標簽鑒定了其中13個蛋白斑點，已鑒定的蛋白包括二磷酸核苷酸激酶、延長因子1-γ，磷酸丙糖異構酶、60S酸性核糖體蛋白P0、75kDa熱休克蛋白、70kD熱休克蛋白樣結合蛋白、鈣依賴磷脂結合蛋白I、假想蛋白FLJ34423、微管-肌動蛋白交叉連接因子1、核纖層蛋白B2、ATP合成酶α鏈、蛋白酶體α亞基6，這些蛋白功能涉及轉錄調節、蛋白折疊、信號傳導、能量代謝、細胞骨架等各個方面。結論 低劑量甲醛可誘導MRC-5細胞適應性反應，多種蛋白參與細胞的適應性反應調控。

關鍵詞： 甲醛；適應性反應；蛋白質組

Proteomie analysis of adaptive response induced by low concentration of formaldehyde in human embryonic fibroblasts cells

Abstract： Objective To study the adaptive response induced by formaldehyde(FA) on eukaryocyte and its possible mechanism.Methods After FA treatment，AlamarBlue reducing rate was observed to determine the cell proliferation.The total cellular proteins were separated using two-dimensional gel electrophoresis and visualized by sliver staining.Gels from different batches of control and FA-treated MRC-5 cells were analyzed for quantitative spot comparisons with the ImageMaster 2D platinum 5.0 software.The differentially expressed prorein spots were picked and digested in gel then identified by tandem mass spectrum.Results The results of AlamarBlue reducing rate showed that low concentration of FA induced adaptive response on MRC-5 cells.Nineteen spots were changed significantly after FA treatment.Thirteen proteins were identified by peptide mass fingerprinting or peptide sequence analysis，including putative nucleoside diphosphate kinase，elongation factor 1-gamma，triosephosphate isomerase，60S acidic ribosomal protein P0，heat shock protein 75 kDa，similar to heat shock 70kD protein binding protein，annexin I，hypothetical protein FLJ34423，microtubule-actin crosslinking factor 1，lamin B2，ATP synthase alpha chain，mitochondrial precursor，proteasome subunit alpha type 6.These identified proteins involved in energy metabolism，translation and RNA processing，protein folding，redox regulation，cell structure and cell signaling.Conclusion Adaptive response can be induced by low concentration of FA on MRC-5 cells and cellular adaptation is a complex process involving in a modulation of perse cellular functions.

Key words： formaldehyde；adaptive response；proteomics

適應性反應（adaptive response）是機體受到低劑量環境因子預刺激后對后續高劑量的刺激產生耐受的現象。研究表明〔1〕，許多環境刺激因子低劑量接觸可誘導適應性反應。但適應性反應是否為自然界普遍存在的現象，適應性反應的機制還未闡明。甲醛(FA)是常見的環境化學污染物，早期研究發現，機體接觸低劑量甲醛可能誘導產生某種耐受與適應現象，但尚未對其機制進行探討〔2，3〕。本實驗利用建立的甲醛適應性反應細胞模型，采用蛋白質組學技術研究了甲醛刺激后人胚肺成纖維細胞蛋白質表達差異，并用串聯質譜鑒定差異蛋白，為了解甲醛誘導細胞適應性反應的分子機制提供依據。

1 材料與方法

11 材料 甲醛(上海標準試劑）、硫脲(美國Sigma公司)；等電聚焦膠條(13cm pH4～7)、尿素、二巰基蘇糖醇(瑞典Amersham公司)；丙基磺酸鹽、碘乙酰氨(美國USP公司)；胰蛋白酶(測序級)、丙烯酰胺(美國Promega公司)；AlamarBlue染料(美國Biosource公司)；其余試劑采用國產分析純。

12 方法

121 細胞培養 MRC-5細胞來源于成都腫瘤研究所，培養于改良的伊格培養基(DMEM)，含10％胎牛血清，100kU/L青霉素，100mg/L鏈霉素。FA臨用前用無血清DMEM配制。

122 AlamarBlue檢測細胞增殖 將細胞接種于96孔板，至對數生長期，按實驗方案分別加入適應性反應劑量(10μmol/L)及攻擊劑量(500μmol/L)的甲醛，對照組分別加入相同體積的無血清DMEM培養基，培養結束前4h每孔加入10μl染料，繼續培養4h用酶標儀測吸光度值計算AlamarBlue還原率。

123 雙向凝膠電泳 參照Amersham公司技術手冊及本實驗室改進的技術方法〔4〕，上樣量90μg，上樣體積250μl，等電聚焦42000～48000vhs，聚焦時間19～21h。樣品收集方案：FA染毒低劑量組為10μmol/L刺激12h，高劑量組為500μmol/L FA刺激5h，適應組為10μmol/L FA預刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，空白對照組加入相應體積無血清DMEM，收集不同批次的細胞重復至少3次。

124 圖像采集和分析 染色后的雙向電泳凝膠用的圖像掃描儀掃描(瑞典Amersham公司)后采用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件進行圖像分析。分析過程包括蛋白質斑點檢測及編輯、背景扣除、以全體點之和作歸一化處理后進行斑點匹配。分析3次獨立實驗所得二維電泳膠，結果以占總蛋白點灰度值的百分比表示。最大比值(Max ratio)為各組數值間最大值與最小值的比，如各組間有為0的數據，Max ratio計為100000。

125 質譜檢測及數據庫搜索 切取在不同批次膠上重復性較好的差異表達的蛋白點，膠內酶解后用質譜分析(ABI4700，美國ABI公司)檢測，激光強度355nm， 200Hz，選定5個最強峰做串聯質譜，所得肽譜用搜索引擎(MASCOT)對人類蛋白組數據庫(IPI HUMAN)搜索。

13 統計分析 采用SPSS110軟件進行單因素方差分析；二維電泳圖像分析采用ImageMaster 2D Platinum5.0軟件分析。

2 結果

21 低劑量FA預刺激對MRC-5細胞增殖的影響 MRC-5細胞分別給予500μmol/L FA刺激5h，及10μmol/L FA預刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，檢測AlamarBlue還原率。結果顯示，空白對照組AlamarBlue還原率為(0.5771±0.0238)，高劑量組下降至(0.4922±0.019)，適應組細胞為(0.56911±0.03383)，差異有統計學意義。

22 低劑量FA預刺激后MRC-5細胞雙向電泳圖譜差異 經圖像分析發現，對照組MRC-5細胞檢測到(834±74)個蛋白點，低劑量組為(917±118)個，高劑量組為(820±116)個，適應組為(874±107)個，凝膠匹配后發現，19個蛋白點表達發生改變，變化量達2倍以上，見表1。表1 FA刺激后二維電泳差異表達的蛋白點（略）

23 低劑量FA預刺激后MRC-5細胞差異蛋白質譜分析及數據庫搜索 選擇19個差異表達 的蛋白點進行鑒定，經肽指紋圖譜(PMF)及肽序列標簽(MS／MS)鑒定了其中13個蛋白點，其余因無法得到好的肽指紋圖譜或搜索數據庫時無法得到可信度較高的結果而未能鑒定。已鑒定的蛋白結果見表2。

3 討論

本研究結果顯示，低劑量FA預刺激后細胞可耐受更大劑量FA的攻擊，提示FA可誘導細胞產生適應性反應。磷酸丙糖異構酶參與多種能量代謝途徑；二磷酸核苷酸激酶與三磷酸核苷合成有關，是癌基因c-Mye的激活因子；蛋白酶體參與泛素依賴的蛋白降解；60S酸性核糖體蛋白PO與E.Coli蛋白L10功能相似；75kDa熱休克蛋白及70kDa熱休克蛋白樣結合蛋白作為分子伴侶或分子伴侶結合蛋白發揮其生物學效應；微管-肌動蛋白交叉連接因子1、核纖層蛋白B2與細胞骨架相關；鈣依賴磷脂結合蛋白I(ANX I)為鈣依賴的磷脂結合家族成員，具有多種生物學功能；延長因子1在蛋白翻譯過程中起重要作用：ATP合成酶α鏈與ATP合成有關，提示甲醛誘導的細胞適應性反應是一個復雜的過程，需要多種蛋白共同參與。本研究所鑒定的甲醛適應性反應相關蛋白中，熱休克蛋白和ANX I的誘導表達與氫醌誘導的適應性反應蛋白質組學研究結果有共同之處〔4〕。提示這2種蛋白可能在化學物誘導的適應性反應的共同機制中具有重要作用。已有研究表明，在應激條件下熱休克蛋白的表達對細胞具有保護作用〔5〕。ANX I也可被熱應激、過氧化氫、亞砷酸鹽等多種因素誘導，提示ANX I也可能是一種熱休克蛋白(HSPs)〔6〕。HSPs在化學物誘導的適應性反應中所起的作用是特異性的抑制或非特異性，其表達是適應性反應產生的因或果，以及HSPs與其他適應性反應相關蛋白之間的關系都有待進一步研究。

表2 FA調節蛋白Mascot數據庫搜索結果（略）

注：a PMF鑒定結果；b MS/MS鑒定結果

參考文獻

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