nk細胞范文
時間：2023-04-04 06:45:57
導語：如何才能寫好一篇nk細胞，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。
篇1
1.概述：nk細胞是一種非T細胞性、非B細胞性、非吞噬細胞性的具有細胞毒性效應的淋巴細胞。NK細胞是機體免疫系統的重要組成部分，在抗病毒感染免疫、腫瘤免疫、移植排斥反應以及免疫調節中起著十分重要的作用。
2001年WHO淋巴組織腫瘤分類將NK細胞腫瘤分為：（1）前體NK細胞腫瘤，即原始NK細胞淋巴瘤；（2）成熟NK細胞腫瘤，包括T-LGLL、ANKL、結外NK/T細胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）。
侵襲性NK細胞白血?。ˋNKL）是起源于成熟NK細胞的惡性腫瘤，突出特點是NK大顆粒淋巴細胞（LGL，large granular lymphocyte）系統性增生（1），腫瘤細胞表達CD56，而表面CD3陰性。ANKL為高度侵襲性疾病，病程進展迅速，常伴有肝、腎、心等多器官功能衰竭，大部分患者診斷后數日或數周后死亡（2，3，4） 。ANKL最早由Imamura等于1990年發現，多見于亞洲和歐洲高加索地區，多在中青年發病，中位發病年齡30歲，男女發病率無差異，同時發現CD56作為NK細胞的標志。該病發病率低，但惡性程度高，侵襲性強，早期癥狀不典型，易誤診（5），治療效果及預后極差。
2.病因及發病機制：本病的病因及發病機制尚未明確（6）。但多數病例報道（7，8，9）中發現，EB病毒感染的檢測多數陽性，提示EB病毒感染與本病存在相關性（10），但目前EBV如何引起NK細胞克隆性生長知之不多。有部分研究表明ANKL的發生可能與癌基因的激活與抑癌基因的失活有關（11）。ANKL引起MOF（多器官功能衰竭）的機制除了白血病細胞浸潤直接破壞器官功能外，是否與腫瘤細胞大量釋放炎癥因子、細胞因子、凋亡蛋白有關尚待進一步研究（12），Makishima等（13）研究發現，ANKL細胞中趨化因子CXCRI、CCR5和細胞因子IL一8、MIP一12、MIP―lB及 FasL呈陽性表達，血清可溶性FasL水平顯著升高，提示細胞因子系統在ANKL細胞的遷移、侵襲中起到了重要作用，Fas和FasL的相互作用被認為是肝功能衰竭的機制之一。
3.臨床表現及實驗室檢查：
3.1 臨床癥狀：70%的ANKL患者起病時即可表現B癥狀：發熱，體溫>38.5℃，盜汗，體重下降。最常見的累及部位是骨髓、外周血、肝和脾，其次為淋巴結（約37%）。但任何器官均可累及，如皮膚、腎臟、肺、漿膜腔、中樞神經系統、扁桃體、縱隔及等。大多數患者呈侵襲性、爆發性的臨床過程，短期內可出現多臟器功能衰竭。以肝功能衰竭為主，逐漸累及到其他臟器。病程中常出現彌散性血管內凝血和噬血細胞綜合征，尤其是在終末期。噬血細胞綜合征主要表現為：①發熱>7 d，體溫>38.5cC；②肝脾腫大；③外周血兩系或三系減少，且非骨髓造血功能減低所致；④高甘油三脂血癥和或低纖維蛋白原血癥；⑤骨髓、淋巴結、脾臟內組織細胞增生并伴噬血細胞現象，無惡性腫瘤證據。
3.2 實驗室檢查：ANKL患者白細胞可表現為異常增高，以淋巴細胞為主，也有表現為白細胞減少。部分患者可出現血紅蛋白及血小板減少。常出現凝血功能異常。疾病后期，幾乎所有患者都會有肝功能異常和全血細胞減少。乳酸脫氫酶通常升高。
3.3 骨髓象：該病與一般白血病是有區別的，其在外周血和骨髓中的腫瘤細胞數量可能是有限的，所以在過去亦稱為“侵襲性NK細胞自血病，淋巴瘤”。骨髓涂片中可見白血病細胞廣泛或局灶性浸潤，表現為LGL（NK大顆粒淋巴細胞），形態不規則，胞核也不規則，大多數胞質內可見粗大的嗜天青顆粒，伴有反應性噬血細胞增多，伴有髓系成熟障礙。同時可見大片壞死，中間混有正常骨髓組織，以及不典型的單個核細胞。骨髓活檢可見異常細胞常呈簇狀或片狀分布，核圓形或不規則，染色質致密，有小核仁，常見凋亡小體和壞死。
3.4 免疫分型：ANKL典型的免疫分型（14，15，16，17）為CD2+，sCD3-，CD7+，CD16+，CD19-，CD20-，CD33-，CD34-，CD38+，CD56+，
HLA-DR+，TCR-，CD10-，CD4-。
3.5 EB病毒抗體陽性。
4.診斷：要求滿足下列條件：①常有發熱、黃疸及肝、脾腫大，部分患者可有淋巴結腫大、胸腔積液、腹腔積液等。②發病急，進展快，臨床呈侵襲性及爆發性的過程，預后差。③外周血或骨髓中出現輕度不成熟的大淋巴細胞，胞質淡染、可見嗜苯胺藍顆粒，核染色質較細，偶見核仁，免疫表型提示為成熟NK 細胞。④免疫表型：sCD3（-）、cCD3（-/+）及CD16（+/-）、CD56（+）、CD57（-）；TCRβ和IgH基因為胚系構型。⑤有EB 病毒感染的證據支持該診斷，但不能作為診斷的必要條件。⑥沒有特異性染色體異常（18）。⑦排除其他大顆粒性淋巴細胞增殖性疾病。
5.鑒別診斷：
需與下列疾病鑒別：
（1）慢性NK淋巴細胞增多癥：以外周血中成熟NK細胞的慢性擴增為特點。當外周血中sCD3（-），CD56（+/-），CD16（+）NK細胞數>0.6×109/L，并持續至少6個月時可作出診斷。該病多見于成人，不具有侵襲性臨床病程，大多數患者無癥狀。
篇2
關鍵詞：侵襲性NK細胞白血??；診斷；免疫分型
ANKL是一種預后很差的血液系統惡性腫瘤，臨床發病率低，病情進展迅速，中位生存時間短，目前國內外文獻有散發報道。現將我院近期收治的2例患者報道如下，并對相關文獻進行復習，探討該病的臨床特點及有效的治療方案。
1臨床資料
病例1，患者，男，39歲。因"發熱10d，咳嗽6d，下肢浮腫2d"入院，血常規：WBC 4.5×109/L，NC2.3×10^9/L,HB 87g/L，PLT 41×109/L；骨髓細胞學檢查：骨髓增生活躍，G=32.5%，E=10%，G/E=5.55；可見23％分類不明細胞，該類細胞大小不等，胞漿深藍，核染色質偏粗，可見清晰巨大核仁，從形態上看與組織細胞及淋巴瘤細胞均有相似之處。涂片偶見噬血細胞。該類細胞組化染色：NAE和NBE染色：部分細胞弱陽性； POX、AS-DCE染色和PAS染色：陰性。粒系增生尚活躍，以成熟粒細胞為主。紅系增生減低。成熟紅細胞中央淡染區擴大。全片未見巨核細胞。血小板散在分布。流式細胞術分析：骨髓有核細胞中淋巴細胞約占61％，其中NK細胞約占73.1％，淋巴細胞表達CD2+ CD7-為83.2％，CD3-CD16+CD56+為73.1％，HLA-DR+為54.2％。T細胞亞群在正常范圍。染色體分析：正常核型（46，XY）。診斷：ANKL。予長春新堿2mg d1，8，15；地塞米松9 mg d1-15；吡柔比星30 mg d1-3聯合化療。化療效果不佳，第20d加用環磷酰胺1g，出現高熱而無明確感染征象，消瘦，全血減少，肝功能損害，因經濟原因第28d出院回家，后死亡。
病例2，患者，女，41歲，因"反復發熱1月，頭暈、雙下肢乏力1w"入院，血常規：WBC5.12×109/L，NC3.2×109/L，HB98g/L，PLT73×109/L；骨髓細胞學檢查：有核細胞增生減低，G=45%，E=10%，G/E=4.5；可見16%原始細胞，此類細胞大小似淋巴系細胞，核染色質粗，核仁1-2個，形態上有些似原、幼淋巴細胞，易見涂抹細胞。POX染色陰性，粒系增生受抑，紅系增生受抑，單核細胞無特殊。CD56(+)/CD2(+)/TIA1(+)/穿孔素（+）/GrB(+)/CD99(+)/CD34部分（+）；EBER(+)，結合免疫組化結果，組織改變符合ANKL。流式細胞術分析：骨髓有一群細胞占有核細胞24.3%，其表達CD2+為82.5%，CD38+為95%，CD56+為85.5%。染色體分析：43（X,-X）-3，-15，4q-，inv(12)。診斷：ANKL。予VTLP方案化療"THP 30mg d1-3 +VCR 2mg d1，8，15,22 +DXM 10mg d1-28逐漸減量+L-ASP1萬U d19-28"。門冬酰胺酶使用第4d因感染家屬拒絕進一步使用，化療第26d摔倒后出現幕上腦積水，加強脫水治療仍有高熱伴神志不清。于化療第28d死亡。
2討論
ANKL又稱NK細胞大顆粒淋巴細胞白血病，1990年Immamura等首次提出ANKL[1]。一般發病年齡小于40歲，以發熱、肝脾腫大和淋巴結腫大常見。病程進展迅速，預后差，總生存期2個月。目前國內外對ANKL尚無統一的診斷標準，較公認的診斷標準為[2]：①常有發熱及肝、脾、淋巴結腫大；②中性粒細胞減低、貧血和血小板減少，外周血淋巴細胞增多，多為大顆粒淋巴細胞，但大顆粒淋巴細胞不是診斷的必要條件；③骨髓穿刺和病理活檢可見大顆粒淋巴細胞浸潤；④免疫表型為CD2+、表面CD3-、胞質CD3+、CD16+、CD56+和CD57-，無TCR重排；⑤EB病毒抗體陽性，或原位雜交顯示大顆粒淋巴細胞中可見EB病毒mRNA；⑥沒有特異染色體異常，del(6)(q21q25)是較多見的核型異常。⑦排除其他反應性大顆粒淋巴細胞增多癥。
目前ANKL以化療為主，尚無標準治療方案，多數采用以蒽環類、烷化劑、長春堿類和糖皮質激素為基礎的聯合化療，包括CHOP和DVLP等方案。但療效很不理想，許多患者在化療后數天至數月內死亡。本文病例2加用左旋門冬酰胺酶似乎有一定效果。國外文獻報道中位生存期為58d，本文2例患者均在1個月內死亡。
總之，ANKL是一種罕見的致命性惡性腫瘤，目前對其病因、發病機制及細胞遺傳學特點及理想治療方案尚待進一步研究。
參考文獻：
篇3
中圖分類號：R733.4 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.029
NK/T細胞淋巴瘤是一組發生于淋巴結外，伴以壞死為主的血管損傷和破壞，細胞毒表型，和EB病毒（EBV）相關為特征的淋巴瘤。因為多數病例為NK細胞腫瘤，少數為T細胞毒表型而命名為NK/T細胞淋巴瘤[1]。NK/T細胞淋巴瘤分布有明顯的區域性，在亞洲地區占到T細胞淋巴瘤的22.4%，遠遠高于歐美地區[2]。NK/T細胞淋巴瘤與EB病毒感染關系密切，尤其是鼻腔病例，80%～100%都存在EB病毒感染，而鼻外部位NK/T細胞淋巴瘤EB病毒的檢出率則相對較低（15%～50%）[3]。既往采用傳統的CHOP（環磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松）類化療方案，NK/T細胞淋巴瘤的預后很差。對于Ⅰ/Ⅱ期的早期患者，其完全緩解（complete response，CR）率多數低于40%，長期生存率僅13%～29%；對于Ⅲ/Ⅳ期的晚期患者，預后更差，長期生存率僅為10%左右[4]。研究表明，NK/T細胞淋巴瘤細胞高表達P糖蛋白，導致進入細胞的化療藥被泵出，是傳統化療方案療效不佳的主要原因[5]。因此探索新的化療方案治療NK/T細胞淋巴瘤成為一個熱點。我國勇威本等[6]最早提出采用門冬酰胺酶治療，明顯改善了難治復發患者的預后，使得NK/T細胞淋巴瘤的治療進入一個新時代。筆者現將門冬酰胺酶治療NK/T細胞淋巴瘤的進展作一綜述。
1 T冬酰胺酶對早期患者治療的影響
通常將Ⅰ/Ⅱ期的NK/T細胞淋巴瘤定義為早期患者。含門冬酰胺酶的方案顯著改善了早期患者的預后。Wang L等[7]回顧性分析321例NK/T細胞淋巴瘤早期患者，其中85例采用含門冬酰胺酶的方案治療，其余236例采用傳統方案，其5年無進展生存（progress free survival，PFS）分別為69.2%和44.1%，總體生存率（overall survival，OS）分別為81%和58%。另一項大規模的多中心研究則觀察了1273例早期患者，其中單純化療170例，單純放療253例，放化療結合850例。觀察表明，采用門冬酰胺酶為主的化療方案較傳統化療方案有明顯的優勢，5年生存率分別為69.6%和33.9%，進一步證實了門冬酰胺酶在早期患者治療中的意義[8]。
為進一步提高療效，降低不良反應，有學者以門冬酰胺酶聯合吉西他濱、奧沙利鉑和地塞米松的GELOX方案治療早期患者，結果表明，27例患者中總體反應率（overall response rate，ORR）高達96.3%，其中20例患者達CR，取得滿意的療效[9]。雖然含門冬酰胺酶方案極大地改善了早期NK/T細胞淋巴瘤患者的預后，但放療在早期患者中仍然十分重要。Zang等[10]觀察了早期放療對NK/T細胞淋巴瘤治療的影響，64例局限期鼻型NK/T均接受以門冬酰胺酶為基礎的化療聯合放療，其中34例采用晚期放療（定義為6周期化療后），30例患者接受早期放療（定義為不晚于3周期化療后接受放療），兩組平均開始放療的時間均為26周，平均隨訪35個月。結果顯示3年OS和PFS早期放療組分別為84.2%、74.3%，晚期放療組分別為57.6%、55.9%；早期放療組CR和ORR分別為80%和93.3%，而晚期放療組分別為50%和67.6%。58例患者在治療2周期時有反應，對這58例患者，早期和晚期放療3年OS（94.4%和58%）和PFS（82.9%和56.3%）仍有區別。22例進展者，4例局部復發，18例遠處復發。因此，即使使用含LASP方案的Ⅰ/Ⅱ期NK/T細胞淋巴瘤，仍有必要早期放療；即使是初始治療有效，仍有必要早期放療。同步放化療對早期患者也是可行的選擇，30例患者中有26例通過同步放化療達CR[11]。Jing等[12]則在門冬酰胺酶為基礎的化療方案（培門冬酶、吉西他濱、奧沙利鉑，P-GeMox）上，采用放療-化療-放療的三明治法治療，共觀察38例患者，其中34例為早期患者，其1年OS和PFS分別達到86.7%和86.6%。
總之，由于以門冬酰胺酶為主的新藥引入，早期NK/T細胞淋巴瘤的預后有了明顯改善，多數患者可以治愈。但是放療的地位仍然十分重要，除少數患者外，并不推薦單純的化療。
2 門冬酰胺酶對晚期患者治療的影響
對晚期患者，門冬酰胺酶同樣可以改善患者的治療反應。Bi等[13]回顧性分析73例Ⅲ/Ⅳ期NK/T淋巴瘤患者，其中11例為Ⅲ期，62例為Ⅳ期；4例接受支持治療，其余69例進入分析。46例患者主要接受以CHOP方案為主的化療，23例在此基礎上聯合門冬酰胺酶治療，增加門冬酰胺酶使得總體反應率由32.6%上升至56%，遺憾的是，這一改善并未轉化成生存優勢，兩組患者的2年OS分別為25.4%和14.9%。提示在CHOP方案為基礎的化療方案上單純地增加門冬酰胺酶可能并不足以改善晚期患者的長期生存。
由于在傳統的蒽環類化療方案基礎上聯合應用門冬酰胺酶，晚期患者的獲益并不明顯，因此需要探索更多的新藥組合。Wang等[14]觀察了以吉西他濱聯合門冬酰胺酶、異環磷酰胺和足葉乙甙（GLIDE）的化療方案治療Ⅳ期或者難治復發NK/T淋巴瘤，21例患者中17例完成預定化療，分別有12例和5例達CR和PR，ORR為80.9%，平均隨訪24個月，估計3年OS和PFS分別為56%和35.8%。Kim等[15]在異環磷酰胺、甲胺蝶呤、足葉乙甙（IMEP）的基礎上聯合門冬酰胺酶，使得總體治療反應率從34.8%提升到90.0%，CR率從21.7%提升到65%，并帶來OS和PFS的收益。表明在強烈化療方案的基礎上，門冬酰胺酶能夠改善患者長期生存。更為強烈的化療方案如SMILE方案（地塞米松、異環磷酰胺、足乙葉甙、門冬酰胺酶）也能夠使晚期患者獲得較好的長期生存，但治療過程中幾乎所有的患者都會出現粒細胞缺乏，約三分之二的患者會合并感染[16]。小樣本的觀察表明，SMILE方案治療中感染是僅次于復發的死亡原因[17]。因此對晚期患者如何在保證療效的同時，減輕化療的不良反應，值得進一步探索。
Lei等[18]根據體外實驗NK/T細胞的藥敏結果，選擇藥敏試驗中最敏感的幾個藥物，包括吉西他濱、順鉑、地塞米松和培門冬酶組成DDPG方案治療進展期NK/T細胞淋巴瘤。結果表明，25例患者中21例（84%）獲得反應，其中CR 17例（70.8%），2年的OS和PFS分別達到68.50% 和 61.8%。值得注意的是，該方案的毒副作用較SMILE方案有明顯的改善，粒細胞缺乏的患者只有58.3%，耐受性要明顯優于SMILE方案。對于難治復發的患者，該方案也能達到87.5%的總體有效率，2年PFS可達81.4%[18]。Wang等[19]則觀察了P-gemox（培門冬酶、吉西他濱、澳沙利鉑）的療效和不良反應，表明該方案Ⅲ到Ⅳ期粒細胞減少僅為30%，遠遠低于SMILE方案。
如前所述，EB病毒在NK/T細胞淋巴瘤的發病中有重要的作用。因此有學者觀察了采用含門冬酰胺酶方案（SMILE）治療時患者EB病毒含量對療效的影響，表明第一療程結束時EBV含量與預后相關，化療前EB病毒拷貝數高、化療后拷貝數不能下降者，預后最差[20]。
3 含門冬酰胺酶方案序貫移植治療NK/T細胞淋巴瘤
由于傳統化療方案并不理想，在引入門冬酰胺酶前，即使是早期NK/T細胞淋巴瘤，也有進行自體造血干細胞移植的探索。小樣本的研究表明，在以CHOP方案為主的化療基礎上，增加自體造血干細胞移植可以改善早期患者的預后，5年的OS和PFS可達100%和88.9%[21]。在化療方案中引入門冬酰胺酶后，早期患者的長期生存已經達到80%以上，低?；颊邉t接近100%[7]。因此自體移植在早期患者中的應用不再那么重要，可能需根據患者的危險分度、治療反應去選擇。
對于晚期患者，采用傳統方案化療時，增加自體移植可使患者獲益，2年OS可達71%[22]。引入了以門冬酰胺酶為主的新的化療方案改善了患者的預后，仍有相當部分患者療效不滿意，自體移植的地位仍然頗為重要。Kim等[17]對27例Ⅳ期NK/T淋巴瘤患者采用SMILE序貫自體移植治療，16例患者達到CR或PR，其中11例按計劃完成了自體移植，7例存活；5例未接受自體移植者，僅2例存活。分析表明，治療前EBV是唯一的預后相關因素，治療前EBV在60拷貝/μL以上者預后差。因此對初治患者若EBV拷貝數高，需首先考慮異基因移植。BM受累者預后差于BM未受累者，長期生存分別為10%和30%。另一項研究則表明，對于進展期患者，自體移植前是否達CR，是影響移植預后的獨立危險因素，接受SMILE類方案者，更易獲得CR，從而獲得較好的生存[23]。
自體造血干細胞移植中仍有部分患者不能獲益，對于部分高?；颊咝杼剿鳟惢蛟煅杉毎浦惨痪€治療。Wen等[24]對18例晚期患者進行了異基因移植，移植m應證包括：60歲以下、Ⅳ期且在CR1時有BM侵犯、或化療敏感的復發或難治患者。移植后5年OS為57%，EFS為51%，多因素相關分析表明，誘導方案與移植預后相關，以SMILE方案誘導能夠獲得更好的療效。筆者同時觀察到CR1與CR2時移植其預后無明顯區別，提示CR1患者不一定需要一線進行異基因移植。
4 結語
以門冬酰胺酶為主的新藥對NK/T細胞淋巴瘤的治療是劃時代的改變。對于早期患者，多數可以通過以門冬酰胺酶為基礎的化療聯合放療達到長期生存，自體移植可能只適合于高危和難治的患者。對于晚期患者，以門冬酰胺酶為基礎的強烈化療方案可使患者獲益，基于體外藥敏實驗的新藥組合在提高療效的同時，減輕了化療相關的不良反應，值得進一步去探索。自體移植可使晚期患者進一步獲益，但是對化療未達CR者，化療前EB病毒負荷高者，以及骨髓受侵犯者，異基因移植可能是更好的選擇。
參 考 文 獻
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篇4
[關鍵詞]基底細胞癌；T淋巴細胞亞群；NK細胞；流式細胞儀；微波治療
[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0075-02
Detection of the influence of T-cell subpopulation and Natural killer cells activity of microwave treatment for patients with basal cell carcinoma by flow cytometry
ZHANG Yuan，ZHONG Yi-ping，SUN Le-dong
（Department of Dermatology，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）
Abstract： Objective To study the influence of the cellular immune function on The microwave therapy for patients with basal cell carcinoma（BCC）. Methods T-cell subpopulation and percentage of NK cells in peripheral blood of 32 cases with BCC were tested by flow cytometry before and after microwave therapy. Results The percentage of CD3 cells，CD4 cells and NK cells decreased and that of CD8 cells increased in BCC patients，with significant difference from those of controls. After microwave therapy，the percentage of CD4 cells and NK cells in patients with BCC were higher than that of before treatment，the percentage of CD8 cells were lower than that of before treatment. Conclusion BCC patients exist cellular immune function defect，Microwave therapy can enhance the immune function of the BCCpatients.
Key words：basal cell carcinoma；T-cell subpopulation；natural killer cells；flow cytometry；microwave therapy
基底細胞癌（basal cell carcinoma， BCC）是最常見的皮膚癌之一，以往多采用手術、放療、化療及免疫治療等傳統治療方法，雖然這些方法效果尚可，但在美容和副作用方面存在一定的局限性。微波治療BCC效果滿意，復發率低，副作用少[1]，但其治療機制尚未完全明了。惡性腫瘤的發生、發展和轉歸與機體的免疫功能密切相關，我們以前的研究證實BCC患者存在細胞免疫功能受損，并與BCC的發生、發展和轉歸有關，提示可從提高機體的免疫功能來尋找有效的治療方法[2]。為了進一步了解微波治療BCC癌的機制，我們應用流式細胞儀技術檢測了32例BCC患者微波治療前后的T細胞亞群及NK細胞，現報道如下。
1 資料和方法
1.1 一般資料：32例患者均經組織病理學檢查證實為基底細胞癌并接受微波治療，其中男20例，女12例，平均年齡56.8歲（15～68歲），平均病程3.7年（2個月～18年），但具有下列情況之一者不列入研究范圍：①伴有自身免疫性疾病、過敏性疾病、嚴重的系統性疾病、病毒感染性疾病者；②1年內用過免疫增強劑或免疫抑制劑者。微波的具體治療方法為先將局部清潔、消毒，予2%利多卡因局部麻醉后，選用雙極觸頭對準癌組織進行多點熱化凝固，然后清除已凝固的壞死組織，反復多次對癌組織進行熱化凝固，直到暴露出基底正常組織。治療范圍超出癌灶邊緣5 mm。對范圍特別大的基底細胞癌，可分次治療。經過上述方法治療后，接著按下微波機的熱療檔，選用直徑為7 cm的圓形發熱器對準創面進行照射，輸出功率為40～50W，發熱器距創面10～15 cm，以患者有溫熱感為度。照射時注意充分暴露創面，照射完畢局部外涂復方紅汞溶液。每日1次，每次20min，1個療程為7～10天[1]。對照組32例，均為我院健康體檢者，其中男19例，女13例，平均年齡57.3歲（16～69歲）。兩組年齡和性別方面無統計學差異。
1.2 方法：用流式細胞儀技術檢測32例BCC患者微波治療前、療程結束后及32例健康對照組外周血T細胞亞群及NK細胞百分率。具體方法為：2只試管中各加入100μl EDTA抗凝靜脈血，再分別加入20μl的雙標單克隆抗體CD3/CD16+56和CD4/CD8，室溫避光副孵育20min后，加500μl紅細胞溶解液溶解紅細胞15min，1 000r/min 離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液沖洗2次，再以0.5ml PBS緩沖液懸浮細胞，流式細胞儀分析5 000個細胞（雙標記單克隆抗體CD3/CD16+56，CD4/CD8及紅細胞溶解均購自法國國際免疫公司）。
1.3 統計學方法：使用SPSS10.0統計軟件包進行統計學處理，采用配對t檢驗，以P
2 結果
32例BCC患者與對照組比較，CD3、CD4細胞百分率、CD4/CD8的比值和NK細胞的百分率均明顯降低，CD8細胞百分率明顯增高，差異均有顯著性（P
3 討論
檢測外周血T淋巴細胞亞群及其比值是反映機體細胞免疫狀態的重要參數之一[3]。我們應用流式細胞儀檢測了BCC患者的外周血T淋巴細胞亞群，并與健康正常對照組比較，發現BCC患者CD3、CD4、CD4/CD8值及NK細胞百分率明顯低于對照組，而CD8卻明顯高于對照組，差異均有顯著性。BCC患者CD3、CD4細胞降低和CD8細胞的增高，再次證實BCC患者細胞免疫功能有明顯下降，且以免疫抑制現象和自身免疫監視能力下降為突出，與我們以前的研究結果相符[2]，其與BCC的發生、發展和轉歸有關。
微波治療BCC時，在微波能量較高時，可使蛋白質變性、凝固、壞死，從而達到去除病灶的目的，且其能有效地解決創面出血的問題，便于在治療過程中觀察病變組織是否清除“干凈”[3]。此外，熱療能加快局部血液循環及代謝，提高局部免疫力，有利于傷口愈合。值得我們關注的是微波治療后BCC患者的CD4細胞百分率、CD4/CD8的比值和NK細胞的百分率均明顯上升，CD8細胞百分率明顯下降。提示微波治療BCC除了物理治療作用外，還有可能是通過提高機體的免疫功能途徑來實現治療效果。與以往采取的手術、放療、化療及免疫治療等傳統治療方法相比，微波療法具有經濟、方便、安全、可靠、美觀及促進創面恢復和增強患者細胞免疫功能等優點，值得臨床推廣應用[1，3]。
[參考文獻]
[1]孫樂棟，江麗芬，刁友濤，等.微波治療基底細胞癌療效觀察[J].臨床皮膚科雜志，2004，33（7）：446.
篇5
【關鍵詞】鼻腔NK/T細胞淋巴瘤；放化療；護理
【中圖分類號】R47 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）13-0293-02
鼻腔NK/T細胞淋巴瘤是除韋氏環外[1]中國最常見的結外非霍奇金淋巴瘤之一，占全部惡性淋巴瘤的2%--10%[2]。鼻腔NK/T細胞淋巴瘤有超出鼻腔侵犯鄰近組織和器官的傾向，病情進展快，治療上多根據不同的分期合理選用放化療為主的綜合治療方案。我院自2000年1月至2010年12月共有60例確診鼻腔NK/T細胞淋巴瘤患者在放療科行放化療綜合治療，現就臨床中的護理干預措施報告如下：
1 資料和方法
1.1 一般資料 60例鼻腔NK/T細胞淋巴瘤患者，其中男性39例、女性21例，男性多于女性，男女比例為2∶1，年齡15～75歲，平均45歲， 病程3～20個月，平均病程4個月。病變局限于鼻腔者41例，超出鼻腔累及鄰近結構者19例。
1.2臨床表現 首發癥狀常為鼻塞、流稀黃水樣涕，病人誤以為“感冒”、“鼻炎”而未引起注意。后期出現持續鼻塞、血涕、鼻臭、頭痛等，很多病人至此就診。病情進一步發展，常有一個以上病變部位受累，可因累及鼻旁各部位而出現咽痛、面部腫脹、鼻咽部腫塊等。全身癥狀常有發熱，一般在38℃以上，伴體重下降、疲倦等，部分病人可出現噬血細胞綜合癥，以發熱、全血細胞減少、骨髓中出現吞噬血細胞的組織細胞及肝功能迅速衰竭為特點，是病人死亡的一個重要原因。本組患者主要臨床表現為進行性鼻塞45例，涕血30例，鼻及鼻竇部隆起25例，惡臭15例，頸部淋巴瘤腫大12例，硬腭潰爛穿孔8例，鼻黏膜糜爛壞死20例。
1.3治療方法：全組60例中，4例Ⅰ期患者行手術切除后行放化綜合治療，51例確診后行放化綜合治療，5例單純放療。放射治療方法：醫生根據患者的腫瘤情況，在模擬機定位下確定照射野，原發灶采用高能χ線或電子線照射，以鼻前“凸”字野或“L”型野為主，輔以單或雙側耳前野，腫瘤累及后鼻孔和/或鼻咽、頸部淋巴結者用面頸聯合野放療，照射30～36Gy后改野保護脊髓加量放療，頸部淋巴結受侵時采取頸部切線野照射。靶區總劑量50Gy，單次劑量為180～200CGY，5次/周?；煼椒ǎ阂痪€化療方案多采用CHOP（環磷酰胺、吡柔比星、長春新堿、潑尼松）為基礎的聯合化療，55例行CHOP方案，CHOPE或MAcop-B等方案化療2-6周期，其中30例放化療同時進行，20例先放療后化療，10例先化療后放療。
2 護理
2.1心理評估與護理
護士為患者進行心理護理是非常重要的，因為有了戰勝病魔的信心，才可能有奇跡出現?；颊呷朐汉笠皶r進行心理評估并給予相應的護理措施。
2.1.1 懷疑心理：患者一旦得知自己患了癌癥，立即坐立不安，多方求證，心情緊張，猜疑不定。因此，醫務人員應言行謹慎，要探明患者詢問的目的，科學而委婉地回答患者所提的問題，不可直言，減輕患者的受打擊程度，以免對治療失去信心。
2.1.2恐懼心理：患者確切知道自己患有癌癥，常表現為害怕、絕望，失去生的希望，牽掛親人。護士應同情患者，給予安慰，鼓勵患者積極接受治療，以免貽誤病情，并強調心理對病情的作用，鼓勵患者以積極的心態接受治療。
2.1.3悲觀心理：證實自己患癌癥時，會產生悲觀、失望情緒，表現為失望多于期待，抑郁不樂，落落寡歡。此時護士應給予關懷，說明疾病正在得到治療，同時強調心情舒暢有利于疾病預后。
2.1.4認可心理：患者經過一段時間后，開始接受自己患有此病的事實，心情漸平穩，愿意接受治療，并寄希望于治療。護士應及時應用“暗示”療法，宣傳治療的意義，排除對治療的不利因素，如社會因素、家庭因素等。
2.1.5失望或樂觀心理：因為個人的體質和適應程度不一樣，治療效果也不盡相同，有的患者病情得到控制，善于調適自己的心情，同時生活在和諧感情的環境中，患者長期處于一種樂觀狀態。有的逐漸惡化，治療反應大，經濟負擔重，體力難支，精神委靡，消極地等待死亡。護士對消極的患者要分析原因，做好心理安慰，及時調整患者的心態，做好生活指導；對樂觀的患者，要做好康復指導。留心觀察心理變化，以便發現問題及時解決。另外，護士也要有嫻熟的護理技術和良好的心理品質，使患者感到心理滿足，情緒愉快。護士要富有同情心，冷靜熱情，耐心和果斷，有敏銳的觀察力，對不同年齡、性格和地位的患者應一律平等，公平公正，取得患者的信賴建立良好的護患關系，善于諒解患者的過失，不與患者頂撞，寬宏大量。在語言上，應親切耐心，關懷和體諒，語氣溫和，交談時要認真傾聽，不隨意打斷，并注意觀察病情，了解思想，接受合理建議。在交談過程中，要注意保護性語言，對患者的診斷、治療和預后，要嚴謹，要有科學依據，切不可主觀武斷，胡亂猜想。
2.2 放化療前的護理干預措施
篇6
【關鍵詞】
宮頸癌；外周血T淋巴細胞；NK細胞檢測；臨床意義
The Clinical significane of peripheral blood T lymphocytes and NK cells in cervical cancer patients
WANG Hongning.
Zongnan Womens Hospital, Chengdu 610041, China
【Abstract】 Objective To investigate peripheral blood T lymphocytes in patients with cervical cancer and NK cells and its clinical significance Methods From Jan.2009 to Jan.2011,214 cases of cervical cancer patients were admitted, selected over the same period 200 cases of physical examination (medical group), peripheral blood T lymphocytes and NK cells were detected and compared Results The cervical cancer group and medical group significant difference(P
【Key words】
Cervical cancer；Peripheral blood T lymphocytes；NK cell detection；Clinical significance
T細胞亞群是反映細胞免疫功能的重要指標之一，腫瘤的發生、發展及預后與機體的免疫功能，特別是與T淋巴細胞功能有密切的關系，在腫瘤免疫監測中起著重要的作用［1］。而腫瘤患者以T細胞介導的細胞免疫存在不同程度的紊亂與缺陷。宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的健康，近年來其發病率有明顯上升趨勢，我們對宮頸癌患者外周血T淋巴細胞及NK細胞進行檢測，了解其臨床意義，具體匯報如下。
1 資料與方法
11 一般資料 選取2009年1月至2011年1月收治的宮頸癌患者214例，年齡38~71歲，平均658歲。所有病例檢測前均未經放療或化療。依據《新編常見惡性腫瘤診治規范》
對214例宮頸癌患者(宮頸癌組)進行腫瘤分期，Ⅰ期102例，Ⅲ期68例，Ⅲ期30例，IV期14例。選取同期進行健康體檢200例(體檢組)，進行外周血T淋巴細胞及NK細胞檢測兩組在年齡上比較，差異無統計學意義，具有可比性。
12 檢測方法 儀器和試劑熒光標記單克隆抗體：鼠抗人CD3PC5/CD4FITC/CD8PE三色標記和同型對照鼠抗人IgG1PC5/IgGlFITC/IgGPE均購自法國Immunotech公司。BeckmanCouIter EPICS XL型流式細胞儀購自美國BeckmCruIter公司。采集晨起空腹新鮮抗凝靜脈血2 ml，肝素抗凝；取外周血100 μl，加入上述單抗20 μl，混勻，室溫避光20 rain染色；加入15 ml紅細胞裂解液，混勻后室溫避光放置10 min，破壞紅細胞；1 500 r/min離心5 min，棄上清；每管加入2 ml 01％疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液混勻，1 000 r/rain離心5 min，棄上清；加PBS 1 ml，混勻，2 h內上機檢測。FCM激光為冷亞激光，波長488 nm，采用flowcheck調整光路，用同型對照
調電壓，以SSC為橫座標，FSC為縱座標，構建散點圖，在散點圖上采用設門技術分析淋巴細胞群中CD+3，CD+3CD+4和CD+3CD+8抗原表達情況，每份標本計數1×105細胞。
13 統計學方法 使用SPSS 130統計學軟件進行統計學分
析，因數據不符合正態分布，故采用秩和檢驗，P
2 結果
對兩組病例進行外周血T淋巴細胞及NK細胞的檢測，觀察體檢組、宮頸癌組(Ⅰ期 、Ⅲ期、 Ⅲ期、IV期)變化并比較，具體見表1.
表1
3 討論
機體的免疫系統是在生物進化中逐步建立起來的，其存在與功能的正常建立在機體穩定性的基礎上。在正常情況下，機體的自身免疫功能可以防御病原微生物的侵襲，消除體內損傷或變老的自身細胞，處理體內出現的少量異常細胞。在抗腫瘤免疫中，細胞免疫占據著重要的地位。細胞免疫應答主要是T細胞介導的特異性細胞免疫，已證明T細胞具有有效的抗腫瘤作用［2］。對于T淋巴細胞和NK細胞等細胞免疫的主要效應細胞的研究已經成為現代腫瘤免疫學研究的重點。
胸腺依賴性淋巴細胞即T淋巴細胞又是細胞免疫系統的關鍵組成部分。機體內的T淋巴細胞能識別腫瘤細胞，在接受腫瘤細胞刺激后，轉化為能攻擊和殺傷腫瘤細胞的致敏淋巴細胞，有著免疫監視機能。一旦這種監視機能遭到破壞，患腫瘤的危險就將增加。
CD+3抗原分子通常分布在成熟T細胞表面，故CD+3T細胞數量可代表機體總T細胞數量，而CD+4T細胞通常代表T輔助細胞，CD+8T細胞通常代表T抑制細胞，CD+4/CD+8比值反映了機體細胞免疫功能狀態是否穩定，比值降低代表細胞免疫功能降低。NK細胞是在腫瘤早期發揮作用的效應細胞，不需要預先接觸抗原，無組織相容性復合體(MHC)限制性，不依賴抗體或補體即可直接殺傷MHCl類基因表達低下或缺如的腫瘤細胞，被稱為抵抗腫瘤生長的第一道防線，其表面標志是CD+16CD+56［3］。
宮頸癌患者的T細胞亞群與正常人相比，當具有免疫反應活性的CD+4細胞減少，而具有免疫抑制功能的CD+8細胞升高時，可能引起機體的免疫平衡失調，造成惡性腫瘤患者的免疫功能減退或受到腫瘤細胞產生大量的免疫抑制因子(TDSF)，可廣泛抑制殺傷細胞的活性，同時在腫瘤抗原的刺激下，脾細胞免疫抑制細胞前體被激活，分泌免疫抑制因子，造成宮頸癌患者免疫功能低下［4］。NK細胞在殺傷腫瘤細胞的過程中消耗了大量的NK細胞，以及TDSF使NK活性降低，NK細胞在血液循環中再分布等原因導致宮頸癌患者NK細胞降低［5］。
通過對兩組進行觀察宮頸癌患者的T細胞亞群與正常人相比差異有統計學意義，CD+4細胞減少、CD+8細胞升高。并且隨著宮頸癌患者病情的發展，Ⅰ期 、Ⅲ期與Ⅲ期、IV期外周血T淋巴細胞及NK細胞的檢測比較差異有統計學意義（P
參考文獻
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篇7
【關鍵詞】鼻腔NK/T細胞淋巴瘤；放射治療；皮膚過敏
放射治療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，約70%的腫瘤患者需要進行放療[1]。但放射治療是一把雙刃劍，在治療腫瘤的同時也會對周圍正常組織造成損傷。在放療過程中，隨著放射劑量的增加，患者照射野皮膚因放射線的影響會出現一定的放射性反應。急性放射性皮炎是放射治療中常見的并發癥，約占頭頸部惡性腫瘤放療患者中的90%以上[2]。但非照射野部位出現皮膚過敏的報道較少。
我科于2012年6月收治了一例鼻腔NK/T細胞淋巴瘤患者，在放射治療過程中，2次出現照射野皮膚（顏面部、鼻翼）及非照射野皮膚（頸部、胸部、右上肢）皮膚過敏（皮疹、滲液、破潰、結痂），通過治療與護理，患者住院70天，好轉出院?，F將護理體會報告如下。
1病例介紹
患者女性，36歲，鼻腔NK/T細胞淋巴瘤，于2012年3月至5月在外院行4周期“健擇+培門冬酶”方案化療，具體“健擇1.2g，第1、8天靜滴”過程順利，出現Ⅲ°骨髓抑制，經對癥治療恢復正常，化療完畢復查鼻咽MRI：鼻腔病變較前明顯縮小，雙側咽喉淋巴結較前稍縮小，鼻咽、顱底未見明顯異常。建議行局部補量放療DT56Gy，于2012年6月11日為行放射治療而來我院就診。實驗室檢查：白細胞2.5×10^9/L：中性粒細胞0.9×10^9/L：紅細胞3.27×10^12/L：血紅蛋白99g/L：血小板136×10^9/L：肝功能示：谷丙轉氨酶41U/L：谷草轉氨酶55U/L：腎功能，電解質，心肌酶，免疫球蛋白基本正常范圍，EB病毒陰性，大小便常規正常。無放療禁忌癥，予設野放療，因患者鼻腔及咽后淋巴結均有病灶，采用三維適形調強放療，靶區為鼻腔、篩竇、患側上頜竇、鼻咽、上腭、咽后淋巴結等部位，因放療范圍較大，皮膚、口咽反應會較重，放療期間加強健康教育囑患者做好皮膚、口腔、飲食護理。保持放射野皮膚清潔干燥，避免刺激，充分暴露頸部皮膚，不要穿質硬的高領衣服，勿用肥皂、刺激性藥物等，給予皮膚防護劑外涂。囑患者保持口腔清潔，勤漱口，予維生素B12注射液20mg+0.9%NS250ml注射液含漱。放療至10次，劑量為PTV18Gy，PGTV20Gy時，患者訴稍口干，鼻腔干燥，放療野皮膚色素輕度沉著；放療至18次，劑量為PTV32.4Gy，PGTV36Gy時，患者訴咽喉及鼻腔干燥，疼痛不適，口腔黏膜反應Ⅱ級，皮膚色素沉著；放療至22次，劑量為PTV39.4Gy，PGTV44Gy，放療野范圍鼻翼及兩側皮膚出現皮疹，呈片狀，瘙癢，予抗過敏藥物治療。次日，癥狀未緩解，患者顏面部、頸部、胸部及右上肢均出現片狀皮疹，其中顏面部、鼻翼皮疹反應較大，皮膚紅腫，眼瞼水腫，皮溫升高，出現滲液、破潰。予抗過敏、保肝藥物治療及皮疹清洗、換藥護理，暫停放療。10天后患者皮疹消退，局部結痂已脫落，恢復放療。放療次日，頸部皮膚再次出現紅疹，給予抗過敏治療后能順利完成治療?；颊卟∏楹棉D，于2012年8月20日出院。
2護理
2.1病情觀察29/7患者放療至22次，劑量為PTV39.4Gy，PGTV44Gy，照射部位急性放射損傷表現為放射性皮炎2級：為色素沉著，皮膚稍有色素沉著，微黑，有時瘙癢[3]。咽喉及鼻腔干燥，疼痛不適，口腔黏膜反應Ⅱ級。鼻腔咽喉干燥疼痛主要為放療皮膚黏膜反應，遵醫囑予地塞米松及核黃素減輕反應治療，同時使用核糖核酸提高免疫治療，配合放療順利進行。30/7護士晨間交接班時，患者訴放療野范圍出現皮疹，瘙癢較明顯，查體：生命征平穩，鼻翼及兩側皮膚可見片狀皮疹，略高出皮膚表面，皮疹無化膿點，局部皮膚無紅腫，皮溫不高。醫師查房后指出：患者放療中，抵抗力較差，容易發生過敏等癥狀，遵醫囑給予鹽酸西替利嗪片5mg，氯雷他定分散片10mg，康復新液10ml含服，復方地塞米松乳膏涂擦皮疹部位，抗過敏藥物治療。效果無明顯好轉，31/7患者顏面部、頸部、胸部及右上肢出現片狀皮疹，顏面部及鼻翼兩側皮膚紅腫，眼瞼水腫，皮溫升高，有灼熱感，出現滲液、破潰，有少許黃色分泌物流出，伴輕度瘙癢。查白細胞3×10^9/L，中性粒細胞比率65.9%：淋巴細胞比率16.9%，紅細胞3.55×10^12/L，血小板180×10^9/L，患者白細胞稍低，因患者目前皮炎較重，故暫時不予升白治療，定期復查血常規。肝功能：谷丙轉氨酶10U/L：谷草轉氨酶17U/L：堿性磷酸酶48U/L：亮氨酰轉肽酶11U/L：谷氨酰轉肽酶11U/L：膽堿脂酶8150IU/L：提示肝功能正常。遵醫囑給予維生素C注射液3g、維生素B6注射液100mg+0.9%NS100ml注射液；復方甘草酸苷注射液60mg+0.9%NS250ml注射液；地塞米松磷酸鈉注射液5mg+0.9%NS100ml注射液；西咪替丁注射液0.6g+0.9%NS100ml注射液，50滴/min靜脈滴入1次/d，螺內酯0.4g，3次/d口服等保肝治療。治療過程中嚴密監測患者病情變化，3d后患者顏面部、頸部、胸部及右上肢的片狀皮疹明顯消退，顏面部皮膚見散在分布皮疹，無滲出液，結痂基本脫落，顏面部腫脹明顯好轉，無瘙癢。7d后患者顏面部皮疹基本消退，無滲出，局部結痂已脫落，右上肢皮疹減少，無瘙癢，無發熱。第10d遵醫囑給予再次放射治療，劑量為，次日查房，患者主訴今日頸部皮膚再次出現紅疹，較昨日增多，不排除患者對放射線過敏，繼續給予抗過敏治療后能順利完成治療。病情好轉，于8月20號出院。
2.2皮疹護理患者放療期間顏面部、頸部、胸部及右上肢出現片狀、大小、形態不一的淡紅色皮疹，顏面部及鼻翼兩側皮膚紅腫，有少許黃色分泌物流出，眼瞼水腫，皮溫升高，有灼熱感，伴輕度瘙癢，無發熱。嚴密觀察病情變化，特別是觀察：是否有新發生的皮疹，部位、范圍、程度、時間、數量，速度、瘙癢、疼痛程度及其他過敏癥狀。①遵醫囑給予鹽酸西替利嗪片5mg，氯雷他定分散片10mg，康復新液10ml含服。②護士用無菌醫用棉簽取復方地塞米松乳膏涂擦皮疹部位，2-3次/d。③加強健康教育，指導患者選擇棉質、柔軟的衣服及毛巾，可用32-34°C溫水進行皮膚擦?。伱娌考氨且韮蓚绕つw有分泌物處禁止擦洗），動作輕柔，忌用堿性肥皂等洗劑。④顏面部及鼻翼兩側皮膚給予0.9%NS清洗分泌物3次/d。⑤給予修剪指甲，并告知患者不要抓撓皮疹，防止皮疹感染，同時觀察患者皮疹消退情況，10d后患者皮疹消失未留下瘢痕。
2.3心理護理患者從發病到確診及化學、放射治療階段輾轉了全國4所醫院，其經歷了復雜的心理變化。焦慮、抑郁等消極情緒反應，加之放射治療導致的患者皮膚過敏損傷，當出現皮膚破潰后，患者表現為更加焦慮、恐懼、悲觀，對放射治療產生了強烈的焦慮、恐懼心理，懷疑疾病治療和護理的有效性，進而自信心下降，自我認同出現障礙。因此，我們與患者及家屬及時溝通，對其皮膚反應請皮膚科專家給予會診，并讓患者及家屬參與到治療中來，有助于消除患者緊張、恐懼感，使患者得到家庭溫暖和情感上的支持，增加安全感。給予優質護理，與患者建立良好的護患關系，增強患者的信任感。加強巡視，嚴密觀察病情變化，做好各項護理記錄，及時告知治療護理過程中好轉的信息，讓患者振作起來以樂觀積極心態配合治療。
2.4出院時健康指導患者出院前心理既覺得治療終于結束，熬出頭了，但又擔心治療的效果及預后，開心同時又焦慮。我們給患者和家屬進行健康宣教。①預防感染患者放療后會出現骨髓抑制，機體抵抗力下降，很容易感染，囑患者必須注意保暖，預防感冒。進食高蛋白、高維生素、高熱量的食物。②皮膚護理囑患者需保護好照射野皮膚，避免冷熱刺激，如熱敷冰袋等，外出防止日光直接照射，局部皮膚不要用手搔抓，皮膚脫屑切忌用手撕剝，平時不能用手摳鼻及用力擠鼻。③口腔護理頭頸部病人放療后唾液腺分泌少、質變粘稠、口腔酸度增加，口腔自潔能力下降利于細菌繁殖，多存在口腔黏膜充血、口臭、咽痛、聲嘶。護理措施是保持口腔清潔，可用淡鹽水（500ml溫開水加熟鹽3-4g）或堿性漱口液飯前、飯后漱口，稀釋口腔內有害菌群濃度。用軟毛牙刷及含氟牙膏刷牙。若口干，可常使用滋陰生津藥物，如使用金銀花、、麥冬等泡茶飲用。④告知患者一個月后按時復查，患者來院復查時，照射野皮膚恢復正常，無紅腫、瘙癢。
3討論
鼻腔NK/T細胞淋巴瘤是一種特殊類型的惡性淋巴瘤，其瘤組織常侵犯鼻腔、上呼吸道和消化道，進展較快，預后差，5年生存率小于50%。放射治療仍然是治療鼻型NK/T細胞淋巴瘤的主要手段，但放射治療會使患者發生不同程度的放射性皮炎，發病機理為受照射部位皮膚發生毛細血管反應性擴張，局部充血，出現紅斑、色素沉著及干性脫屑[4]。發生放射性皮炎的部位為照射野及對穿射線輻射到范圍，而全身皮膚出現對射線反應導致皮膚過敏的反應較少，考慮外因由放射治療致皮膚受損引起，內因為過敏體質，個體差異，免疫系統不平衡，與患鼻腔NK/T細胞淋巴瘤導致免疫力下降有關。當人體免疫功能和皮膚新陳代謝紊亂時，外界刺激會對皮膚造成嚴重的傷害，這時皮膚就會變薄，而且釋放大量的組織胺，導致皮膚泛紅、紅腫、瘙癢、脫皮等。由于放射性皮炎復雜的發病機制，做好患者放射野皮膚的護理，是減輕放射性皮炎的最關鍵環節[5]。在患者放療期間給予優質、精心護理，能降低并發癥的發生率，使病人順利完成全程放療。
參考文獻
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篇8
【摘要】
本研究探討從人外周血中分選及擴增高純度NK細胞的優化技術。先用miniMACS及陰性免疫磁珠分選方法，從外周血單個核細胞（PBMNC）得到純化的NK細胞，隨后在干細胞培液基條件下，通過IL2、IL12和IL15等細胞因子的不同組合將培養體系分為IL2組、IL2+IL12組、IL2+IL15組、IL2+IL15+IL12組和對照組（不加任何細胞因子），分別培養15天，每3天半量換液并補充細胞因子；檢測分選及擴增前后（CD3-CD56+）NK細胞含量、擴增倍數及擴增前后各組在不同效靶比下的殺傷率。結果顯示經：miniMACS陰性免疫磁珠分選后（CD3-CD56+）NK細胞含量由分選前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培養15天后除對照組（CD3-CD56+）NK細胞純度略下降外，其余4組與擴增前無顯著性差異（P＞0.05）。在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培養體系中， NK細胞擴增倍數分別為15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均顯著高于對照組6.14±1.0（P＜0.01），但IL2+IL15與IL2+IL15+IL12組間未見顯著差異（P＞0.05）。各組擴增的NK細胞對K562細胞的殺傷率均較擴增前增強，在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+ IL12組對K562細胞的殺傷率顯著高于其他組，但兩組間無顯著性差異（P＞0.05）。結論：經miniMACS免疫磁珠陰性分選得少量NK細胞后，應用IL2+IL15培養條件是獲得高純度NK細胞的簡單有效方法。
【關鍵詞】 NK細胞； miniMACS； 白介素2； 白介素12； 白介素15
Ex Vivo Expansion of Highly Purified NK Cells from Human Peripheral Blood
Abstract
Adoptive immunotherapy using allogeneic natural killer (NK) cells provides to be useful in recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AlloHSCT)， but its application has been limited by the inability to obtain sufficient numbers of pure NK cells. This study was aimed to optimize the expansion of high purity NK cells from human peripheral blood. First， the NK cells were isolated from PBMNC by using miniMACS (magnetic cellselection) and NK Cell Isolation Kit Ⅱ. Then the isolated cells were cultured in SCEM (Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium， Sigma) supplemented with 10% human AB serum and different combinations of IL2 and/or IL12， IL15 for 15 days. Cultures were fed with fresh media and cytokines every 3 days， and were evaluated for cell expansion， phenotype， and cytotoxicity at the end of the culture period. The results showed that in group IL2+IL15 and IL2+IL15+IL12， cells were expanded 50.46±4.31 and 52.35±6.72fold respectively， much higher than others（P＜0.01)， but no significant difference between themselves (P＞0.05). And the purity of CD3-CD56+ NK cells was over 94% in all groups except the control. The cytotoxicity of expanded NK cells cultured with cytokines was significantly higher than the starting population at different E:T ratio（P＜0.01)， although the cytotoxicity of IL2+IL15+IL12 group was slightly higher than that of IL2+IL15 group， but no significant difference between themselves (P＞0.05). It is concluded that high purity of NK cells can be efficiently expanded in culture with IL2+IL15.
Key words
natural killer cell; miniMACS ; IL2， IL12， IL1
NK細胞作為機體固有免疫的重要組成部分是機體抗腫瘤、抗感染的第一道天然防線。隨著對NK細胞生物功能及活化機制的了解，NK細胞在造血干細胞/骨髓移植的輔助治療及腫瘤過繼免疫治療方面的作用倍受關注。最近在異基因造血干細胞移植中發現供者異源反應性NK細胞可以發揮移植物抗白血病(graftversusleukemia，GVL)效應，并減少移植物抗宿主病(graftversushost disease，GVHD)的發生［1-3］，故輸注供者異源反應性NK細胞已經成為臨床移植輔助治療的新策略［4，5］。然而，外周血中NK細胞含量少（約占淋巴細胞的5%-7%），且目前尚缺乏有效的體外擴增體系，所以NK細胞的廣泛臨床應用受到了限制。目前的許多體外研究均顯示IL2、IL12、IL15對促進NK細胞的分化成熟、活化、增殖及細胞毒活性有重要作用。本研究從方法學角度探索提高NK細胞純度并采用IL2、IL12、IL15等細胞因子的不同組合，以期優化NK細胞體外擴增的效率及純度，為NK細胞的進一步臨床應用奠定基礎。
材料
NK細胞分選試劑盒（NK Cell Isolation Kit Ⅱ，包括熒光標記抗體、磁珠）及miniMACS磁珠分選系統、分離柱（MS Column）均購自德國美天意公司（Miltenyi Biotec，Germany）。造血干細胞擴增培養基(Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium，SCEM)為Sigma公司產品，RPMI 1640培養液為Gibco公司產品。人AB血清購自杭州四季青生物制品公司。IL2、IL12、IL15為Cytolab公司產品。左旋谷氨酰胺（Lglutamine）為 Sigma公司產品。流式細胞儀及熒光抗體FITCCD3、PECD56、FITCIgG1、PEIgG1均為Becton Dickinson公司產品。CCK8 試劑盒（Cell Counting Kit8，新型細胞檢測MTT法改良試劑）購自日本同仁化工。K562細胞為我科實驗室長期保存。外周血來源于我院健康獻血者。
外周血采集與單個核細胞分離
健康獻血者10名，采集肘靜脈外周血20 ml，肝素抗凝，用PBS等體積稀釋后，用淋巴細胞分離液以密度梯度離心法分離得到單個核細胞（PBMNC），PBS洗滌1次。
NK細胞分離純化
將上述PBMNC用溶紅素處理，然后用MACS buffer洗滌1次，血細胞計數板計數。每107個細胞重懸于40 μl MACS buffer，加入10 μl NK cell biotinantibody cocktail，4-8℃孵育10分鐘，然后依次加入30 μl MACS buffer、20 μl antibiotin micro beads，4-8℃孵育15分鐘，再次用MACS buffer洗滌標記好的細胞，重懸于500 μl MACS buffer中。選用MS分離柱，安放于miniMACS分離器磁場中，使用前潤濕分離柱，將分離柱放置于合適的細胞收集管上。將細胞懸液上柱，用3×500 μl MACS buffer洗柱，收集細胞。純化前后計數單個核細胞，并以CD3、CD56熒光標記抗體分析NK細胞數，計算細胞回收效率和純化效率。
細胞培養
將分離純化的NK細胞加入含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、青、鏈霉素（各100 U/ml）及細胞因子的SCEM培養體系內，調至細胞終濃度2×105/ml，然后接種于24孔板，每孔終體積為1 ml；培養體系按細胞因子的不同組合分為4組： A組：IL2（200 U/ml），B組： IL2(200 U/ml)+IL12(10 ng/ml)，C組：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)，D組：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)+IL12(10 ng/ml)，E組：不加任何細胞因子為對照組。每組復種3孔，置37℃、5% CO2、飽和溫度培養箱中培養，每3天半量換液并全量補充上述細胞因子。于培養第0、5、10、15天通過臺盼藍染色法計數并檢測細胞活性。
免疫表型分析
將取自不同來源的細胞用熒光抗體CD3FITC、CD56PE標記，流式細胞儀檢測及分析，了解NK細胞純度。
白血病細胞系的培養
K562細胞種于含有10%FCS的 RPMI 1640培養體系中，置37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。
NK細胞殺傷活性檢測
收集對數生長期K562細胞及培養第0、15天NK細胞。以K562細胞為靶細胞，調整細胞密度為1×105 /ml；NK細胞為效應細胞，根據不同效靶比分別調整細胞密度為1×105 /ml、5×105 /ml、1×106 /ml。按不同效/靶比（1∶1、5∶1、10∶1 ）將效應細胞與靶細胞混合，同時設相應的靶細胞孔，效應細胞孔和培養基空白對照孔。每組均設3個平行孔。置37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養12小時后每孔加入10 μl CCK8（ Cell Counting Kit8：新型細胞檢測MTT法改良試劑），混勻，于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養4小時后用酶標儀測定每孔450 nm波長處的OD值。細胞毒活性的計算方法：求出3個平行孔的平均值，按以下方法計算NK細胞毒活性，以殺傷率%表示。
細胞毒活性=［1-（效靶細胞作用孔OD值-效應
細胞孔OD值）/靶細胞孔OD值］×100%
統計學處理
所有數據均以（±SD）表示，組間比較采用方差分析，所有統計學分析均采用CHISS 2004統計軟件進行。
結
果
NK細胞純化效率
10名獻血者標本顯示，2×107個外周血單個核細胞經分選后可獲得（2.56±1.23）×106個CD3-CD56+細胞，流式細胞儀檢測NK細胞（CD3-CD56+）含量由分選前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%（圖1）。
NK細胞增殖情況
各組實驗條件下NK細胞計數情況見圖2。培養期內臺盼藍染色示細胞存活率均為95%以上。培養前5天，各組細胞增殖均較緩慢；最快增殖時間出現于培養第2周，即第7-15天，此階段各組培養條件下NK細胞均較培養初期顯著擴增。培養至第15天IL2組、IL2+ IL12組、IL2+IL15組及IL2+IL15+IL12組NK細胞的擴增倍數分別為15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均顯著高于對照組6.14±1.0（P＜0.01）。IL2+IL15組及IL2+IL15+IL12組細胞的擴增倍數顯著高于IL2組、IL2+ IL12組（P＜0.01）。在這10例標本中，IL2+IL15+IL12組雖然曾獲得一次最大擴增倍數60.8倍，同時平均擴增倍數也略高于IL2+IL15組，但統計學分析顯示它們的擴增效率無顯著差異（P＞0.05）。
NK細胞擴增前后免疫表型分析
取自于培養第15天的細胞分別標記CD3、CD56抗體，結果顯示在含有細胞因子的4組培養體系中，CD3-CD56+NK細胞純度均大于94%，與開始培養時（0天）NK細胞純度無顯著差異（P＞0.05）。對照組CD3-CD56+NK細胞純度為83.26±6.39%，較其余各組及培養初始時略有下降（P＜0.05）（圖2）。
NK細胞對K562細胞的殺傷作用
分別比較培養15天后各細胞因子組不同擴增體系的NK細胞及其與擴增前的NK細胞（E0組）對K562細胞的殺傷率的變化。如圖3所示：各細胞因子組NK細胞殺傷活性均較擴增前明顯增強（P＜0.01），且NK細胞對K562 細胞的殺傷活性呈C組≈D組（P＞0.05）＞B組＞A組＞E組（P＜0.01）。隨著效靶比從1∶1、5∶1到10∶1，各組NK細胞對K562細胞的殺傷率均逐步提高（P＜0.01）（圖3）。
討
論
目前的研究證實，NK細胞是造血干細胞/骨髓移植的輔助治療及抗腫瘤免疫中非常有應用價值的效應細胞之一。尤其在造血干細胞/骨髓移植方面，許多的動物實驗和臨床觀察均提示異基因造血干細胞移植后，供者的異源反應性NK細胞可促進植入，阻止T細胞介導的GVHD，攻擊宿主白血病細胞發揮GVL效應。故輸注供者異源反應性NK細胞已成為臨床移植輔助治療的新策略。如何獲得高純度、足夠數量的NK細胞是臨床應用的前提條件。雖然國內外有應用ClinMACS直接從供者外周血中分選NK細胞，但用血量大，分選費用昂貴，獲得的NK細胞量仍不能滿足臨床需要，往往需要體外進一步擴增［6］，這些問題均大大限制其臨床應用。近年來Carlens［7］、Klingemann［8］、黎陽等［9］國內外學者都曾嘗試建立人NK細胞體外擴增體系，但仍存在細胞純度低、擴增效率不高，應用飼養細胞等問題，這些研究雖然部分的滿足了科研的需要，但臨床應用問題尚未解決。尤其對于移植免疫中對NK細胞的需要，由于移植前后受者處于特殊的免疫狀態中，不同免疫細胞對患者影響不同，故輸注時NK細胞的純度直接關系到輸注后的療效。本研究在前人研究的基礎上，先采用miniMACS免疫磁珠分選方法，從正常人外周血中得到高純度的NK細胞，隨后優化NK細胞培養體系進行體外擴增，以降低大量分選NK細胞的昂貴費用。從我們NK細胞分選的實驗結果看，流式細胞儀檢測NK細胞（CD3-CD56+）含量由分選前的（11.19±5.25）%提高到（94.23±3.50）%，肯定了經miniMACS高梯度磁場的NK細胞陰性免疫磁珠分選方法的分選效果。
進一步優化NK細胞體外擴增體系時，在選用，含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺的SCEM培養體系基礎上，我們又選擇細胞因子IL2、IL12、IL15組成不同的組合。文獻報道IL2，IL12，IL15均對于促進NK細胞的分化成熟、活化、增殖及細胞毒活性有重要作用。IL2是一種多功能的炎性細胞因子，能夠激活NK細胞，誘導NK細胞增殖及細胞因子的產生［10］。IL12最先從人B淋巴母細胞系的培養上清液中發現，它不僅可促進NK細胞的殺傷活性和分泌功能，而且可在體外促進NK細胞的增殖，同時可協同IL2誘導健康成人NK的細胞因子激活的細胞毒作用［11］。IL15在刺激NK細胞增殖及活化等方面與IL2有許多相似性。當然，這與二者都可與IL2受體復合體的β、γ鏈結合有關。然而，IL15還可結合于1個新的α鏈，即IL15受體［12，13］，故IL15還在促進造血干細胞定向分化為NK細胞，并對NK細胞的發育分化及維持長期體外存活等方面有顯著作用。另外IL2與IL15也具有協同作用。所以，我們根據不同細胞因子組合將培養體系分為4組：IL2組、IL2+IL12組、IL2+IL15組、IL2+IL15+IL12組，以期篩選出最佳組合。實驗結果顯示：經過15天的培養，與對照組相比，上述細胞因子均能促進NK細胞的體外擴增，并能保持擴增體系中NK細胞的高純度；其中IL2+ IL12組雖較IL2組添加了IL12，但增殖效果的提高并不明顯，同樣情況也可在上述分組的后2組中看到，這說明IL12在體外對NK細胞增殖的促進作用遠不及IL2，兩者結合并不比單獨使用IL2更有效，這與前人的一些實驗結果吻合；同時在IL2組與IL2+IL15組的比較中我們看到，IL15與IL2的組合大大提高了擴增倍數，由單獨使用IL2 時的15.43±1.08倍增至50.46±4.31倍，說明IL15能顯著促進NK細胞的體外擴增，并可協同IL2大大提高擴增效率；而IL2+IL15+IL12組在實驗中雖然有1例標本獲得了最大增值倍數60.8倍，但統計學結果顯示其并不比IL2+IL15組有更好的擴增效率。
為了檢測所得NK細胞的活性，我們在進一步的實驗中分別比較了培養15天后實驗組不同擴增體系的NK細胞及其與擴增前的NK細胞對K562細胞的殺傷率的變化。結果各組效靶比與殺傷率呈正比，從1∶1、5∶1到10∶1對K562細胞的殺傷率逐步提高（P＜0.01），這說明在一定條件下，NK細胞殺傷活性存在量效關系。其次，各細胞因子組NK細胞殺傷活性均較擴增前明顯增強（P＜0.01），且殺傷活性呈IL2+IL15組≈IL2+IL15+IL12組（P＞0.05）＞IL2+ IL12組＞IL2組＞對照組（P＜0.01）；體外擴增后當效靶比為10∶1時，各組對K562 細胞的殺傷率均在60% 以上，其中IL2+IL15組、IL2+IL15+IL12組接近100%。即使當效靶比1∶1時，這兩組NK細胞對K562細胞的殺傷率也從擴增前的17%提高到45%，NK細胞活性顯著增強（P＜0.01）。另外結果還顯示，雖然IL12可增強NK細胞的細胞毒活性，但其效果略遜于IL2及IL15，尤其后二者的組合可在效靶比為10∶1時達到近乎100%的殺傷率。
總之，經miniMACS免疫磁珠陰性分選得少量高純度NK細胞后，在含IL2(200 U/ml)+ IL15(20 ng/ml)的SCEM（含10%人AB血清的）培養條件下，我們可以獲得純度高、細胞毒活性強、增殖倍數較高的NK細胞，同時培養擴增條件簡單，成本較低，為NK細胞用于造血干細胞/骨髓移植的輔助治療及腫瘤過繼免疫生物治療奠定了良好基礎。
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篇9
【摘要】 目的： 研究急性白血病患者外周血T淋巴細胞亞群、NK細胞水平變化及臨床意義。方法： 采用流式細胞儀對32例急性白血病患者 (急性髓細胞性白血病23例、急性淋巴細胞性白血病9例)及18例正常人外周血T淋巴細胞亞群及NK細胞水平進行檢測。結果： 初治急性白血病組與正常對照組比較，CD3+細胞、CD4+細胞、CD4+/CD8+比值及NK細胞下降（P0.05）。化療后12例取得完全緩解，再次檢測上述指標接近正常對照組（P>0.05）。初診急性淋巴細胞性白血病組CD4+細胞及CD4+/CD8+比值低于初診急性髓細胞性白血病組（P
【關鍵詞】 急性白血?。?T細胞亞群； NK細胞
［Abstract］ Objective: To study the changes of T lymphocyte subsets，NK cells in peripheral blood of patients with acute leukemia and its clinical significance.Methods： The different level of peripheral blood T lymphocyte subsets， NK cells of 32 acute leukemia patients and 18 normal controls were detected with flow cytometry. Results： Compared with the normal controls， the number of CD3+ T cell， CD4+T cell， NK cell and CD4+/CD8+ ratio reduced in newly diagnosed acute leukemia group(P0.05).Twelve of 32 patients achieved complete remission after chemotherapy.Their level of T lymphocyte subsets，NK cells near those of normal controls（P>0.05）.The number of CD3+ T cell and CD4+/CD8+ ratio in newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia group were lower than those in newly diagnosed acute myelogenous leukemia group(P
［Key words］ acute leukemia; T lymphocyte subsets; NK cell
急性白血?。╝cute leukemia，AL）是造血干細胞的惡性克隆性疾病，其發生及發展與機體免疫紊亂有著密切的關系。在抗腫瘤免疫效應中，細胞免疫比體液免疫起著更為重要的作用。T淋巴細胞和NK細胞執行細胞免疫功能，是機體抗腫瘤免疫的重要活性細胞。本文采用流式細胞術（flowcytometry，FCM）檢測急性白血病患者及健康人群外周血T淋巴細胞亞群和NK細胞的水平，并探討其臨床意義。
1 材料和方法
1.1 材 料
32例急性白血?。ˋL）外周血標本均來自我院住院患者。其中男14例，女18例，年齡15～72歲，中位年齡41歲；急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)23例，急性淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)9例。初診患者分別于化療前、完全緩解后采集外周靜脈血2 ml，枸櫞酸鈉抗凝。18例正常對照外周血標本采自健康體檢者。
1.2 方 法
取100 μl上述抗凝血分別加入4個試管中，每管加入抗CD45PerCP 10 μl。各管再依次加入抗CD3-FITC+CD19-PE、抗CD3-FITC+CD4-PE、抗CD3-FITC+CD8-PE、抗CD3-FITC+CD16CD56-PE各10 μl，避光室溫充分結合20 min后，每管加入溶血素2 m1，避光放置至透明后1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液體，加入2 m1 PBS在混合器上使試管底部的細胞與PBS溶液混勻，1 000 r/min離心5 min，最后加入0.4 ml PBS溶液混勻直接上流式細胞儀（美國BD公司）檢測。
1.3 統計學處理
應用SPSS12.0處理數據，結果以±s表示，用t檢驗方法比較各組間差異。
2 結 果
32例急性白血病患者T淋巴細胞亞群及NK細胞的水平變化見表1。由表1可見: 與緩解AL組相比較，初診AL組外周血CD3+細胞、CD4+細胞、CD16+CD56+細胞及CD4+/CD8+比值降低，差異有統計學意義(P0.05)。初診AL組與對照組相比較有類似的結果。而緩解AL組外周血CD3+細胞，CD4+細胞，CD8+細胞、CD4+/CD8+比值及CD16+CD56+細胞與對照組相比較差異無統計學意義(P>0.05)。初治ALL組與AML組相比較，ALL組CD4+細胞及CD4+/CD8+比值低于AML組，兩者間差異有統計學意義(P0.05)。表1 急性白血病患者及正常對照組外周血T細胞亞群及NK細胞水平
3 討 論
機體的細胞免疫異常可使腫瘤細胞逃避宿主的免疫監視，最終發生腫瘤。CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞在體內抗腫瘤免疫中具有重要的作用。
CD4+細胞能輔助T細胞、B細胞活化，后兩者活化釋放的大量細胞因子能促進CD8+T細胞及吞噬細胞的活性，并影響B細胞抗體的產生，從多方面調節和增強抗腫瘤效應。CD8+細胞常在免疫應答后期增多，除可對靶細胞產生細胞介導的細胞毒作用（ADCC）外，還能識別可溶性抗原，分泌抑制因子，減弱或抑制免疫應答，對CD4+細胞有調節性抑制作用。CD4+/CD8+比例平衡是維持免疫內環境穩定的一個中心環節，是機體免疫網絡調控的重要樞紐，反映了機體免疫反應的調節能力［1］。這種免疫平衡紊亂時，可引起繼發性免疫缺陷。本組資料分析了32例不同類型急性白血病患者的T淋巴細胞亞群，發現初治AL患者CD3+、CD4+細胞以及CD4+ /CD8+比值明顯降低。其他惡性血液病如非霍奇金氏淋巴瘤中有類似的變化［2，3］，在兒童急性白血病中也有類似報道［4，5］。這些提示白血病患者輔T細胞數量或功能低下，機體識別和殺傷白血病細胞的能力下降，與白血病的發生發展有一定的關系。本組資料還提示，化療后緩解的患者，T淋巴細胞各亞群抗原表達接近正常，細胞免疫功能得到一定程度恢復。通過分析我們還發現，與AML比較，ALL患者CD4+細胞、CD4+/CD8+比值降低程度更顯著，提示原發于淋巴系統腫瘤的細胞免疫功能更低下。
CD16+CD56+是自然殺傷細胞（NK細胞）的標志物，表達的量可能與NK細胞的數量或功能有關。NK是重要的天然免疫細胞， 起源于CD34+造血細胞，在骨髓微環境內發育，形成具有免疫活性的成熟型細胞。它不需預先致敏，無MHC限制性，即可自發地殺傷MHC1類分子缺陷或低表達的腫瘤細胞， 具有廣譜的抗腫瘤、抗感染、免疫調節等作用，在機體免疫監視過程中發揮重要功能。分析本組資料發現AL患者化療前CD16+CD56+細胞明顯降低，與樓瑾［6］等的研究結果相似，而化療后完全緩解者CD16+CD56+細胞又恢復到正常水平，進一步說明初發急性白血病NK細胞免疫功能明顯受損。
由于初治AL與緩解AL的T淋巴細胞亞群及NK細胞的水平有明顯差異，檢測T淋巴細胞亞群和NK細胞水平在評價AL療效及判斷預后方面具有一定的臨床價值。其臨床意義還有待積累更多病例進行深入研究。
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篇10
【關鍵詞】 雙歧桿菌DNA;，巨噬細胞;，蛋白激酶C;，核因子
Influence of bifidobacterium DNA on PKC and NFκB in murine macrophages
[Abstract] AIM: To explore the influence of DNA of bifidobacteriua adolescence on PKC and NKκB of murine macrophages. METHODS: The fluorescent intensity of PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε and PKCζ in murine peritoneal macrophages was detected by using laser confocal microscope. The density of NKκB+ macrophages was detected by immunocytochemical staining. RESULTS: The average fluorescent intensity of PKCα and PKCβII produced by mouse peritoneal macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P0.05）. The density of NKκB+ macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P
[Keywords]bifidobacterium DNA; macrophage; protein kinase C; nuclear factorκB
[摘 要] 目的: 探討青春型雙歧桿菌的DNA對巨噬細胞中6種PKC和NFκB的影響。方法: 通過激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠腹腔巨噬細胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的熒光強度， 以免疫細胞化學染色法檢測巨噬細胞中NFκB+細胞的密度。結果: 雙歧桿菌DNA注射組小鼠腹腔巨噬細胞中， PKCα和PKCβII的平均熒光強度明顯高于對照組（P0.05）。雙歧桿菌DNA注射組巨噬細胞中， NFκB+細胞的密度顯著高于對照組（P
[關鍵詞]雙歧桿菌DNA; 巨噬細胞; 蛋白激酶C; 核因子κB
雙歧桿菌是人體和動物腸道內數量最多的生理性厭氧菌， 能調節腸道的微生態平衡， 也有抗腫瘤、 抗感染和免疫激活等多種重要的功能[1]。目前研究發現， 雙歧桿菌的DNA中含有非甲基化的胞嘧啶磷酸鳥嘌呤基序(cytidinephosphateguanosine， CpG DNA)， 可作為免疫刺激序列(immunostimulatory sequence)激活樹突狀細胞(DC)， 上調其表面分子和共刺激分子(如CD69、 MHCI、 MHCII類分子、 CD80以及CD86等)的表達。同時， 其還能激活NK細胞和B細胞， 使之產生較多量的IFNγ和抗體[2]。此外，其亦可激活巨噬細胞， 增強其吞噬和細胞毒作用， 并分泌較多量的IL1及IL6， 但其具體的作用機制目前仍不清楚[3]。本研究中應用激光共聚焦顯微鏡和免疫細胞化學染色法， 檢測了青春型雙歧桿菌的DNA對小鼠腹腔巨噬細胞中PKC和NFκB的影響， 旨在探討其激活巨噬細胞的信號途徑。
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c小鼠， 6~8周齡， 雌雄各半， 體質量為18~23 g， 購于南方醫科大學實驗動物中心。兔抗鼠PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ， 購自New England Biolab公司。FITC標記的羊抗兔IgG、 兔抗p65抗體和生物素化的羊抗兔IgG， 均購自北京中山生物技術有限公司。溶菌酶和LPS為Sigma公司產品。其他生化試劑均為進口或國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 菌種來源及其培養 雙歧桿菌由本室從健康嬰兒糞便中分離培養獲得， 經API20A及TAB系統和多次生化反應鑒定為青春型。實驗時， 將雙歧桿菌接種至硫乙醇酸鹽肉湯中， 置厭氧培養箱， 于37℃培養72 h。將含菌培養液以3000 r/min離心10 min， 去上清， 沉渣以PBS液洗3次， 并調整細菌數為1×1013/L。
1.2.2 雙歧桿菌DNA的制備和鑒定 將雙歧桿菌接種于硫乙醇酸鹽肉湯中， 置厭氧培養箱中于37℃培養72 h。收集細菌， 加入溶菌酶（1 g/L）與SDS（終濃度為10 g/L）裂解菌體后， 用飽和酚抽提去除菌體蛋白并透析。用紫外分光光度計測定所提取的雙歧桿菌基因組DNA的A260/A280為1.976。測定DNA的濃度后， 經薄板層析證實，所制備的雙歧桿菌DNA中無脂多糖存在， 冷凍干燥后備用[4]。
1.2.3 實驗分組及雙歧桿菌DNA的處理 實驗動物分為兩組， 即(1)雙歧桿菌DNA注射組: 20只小鼠， 于實驗的第1天向小鼠腹腔注射100 g/L硫乙醇酸鹽肉湯2 mL， 第2天起腹腔注射雙歧桿菌DNA 0.2 μg， 每天1次， 連續5 d。 (2)對照組: 動物的數量及第1天的處理措施均同雙歧桿菌DNA注射組， 不同之處為第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 mL， 每天1次， 連續5 d。
1.2.4 巨噬細胞的收集及培養 于實驗的第7天， 常規消毒小鼠腹部的皮膚， 以冷的Hank’s液灌洗腹腔。洗出液以1000 r/min離心10 min， 去上清， 沉渣以無血清的RPMI1640培養液重懸2次， 并調整細胞數為1×109/L。吸取100 μL細胞懸液加至孔底鋪有蓋玻片的24孔細胞培養板中， 置37℃、 50 mL/L CO2 孵箱中培養2 h。棄去未貼壁的細胞， 即得巨噬細胞。再加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養液及LPS(終濃度為10 μg/L)， 500 μL/孔， 繼續誘導培養24 h。
1.2.5 巨噬細胞PKC含量的檢測 通過激光共聚焦顯微鏡觀察PKC的熒光強度反映PKC的含量。具體操作步驟為: ①傾去培養孔內的培養液， 取出爬有巨噬細胞的蓋玻片， 滴加3 mL/L H2O2甲醇封閉內源性過氧化物酶活性; ②以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次×5 min; ③滴加100 g/L非特異性牛血清白蛋白， 室溫孵育10 min; ④以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次×5 min; ⑤分別滴加兔抗鼠PKCα、 抗PKCβI、 抗PKCβII、 抗PKCγ、 抗PKCε和抗PKCζ抗體各100 μL， 工作濃度均為1∶200， 于37℃溫育60 min; ⑥以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次×5 min; ⑦滴加1∶100 FITC標記的羊抗兔IgG100 μL， 于37℃溫育30 min; ⑧以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗滌5次×5 min; ⑨用激光共聚焦顯微鏡逐個觀察巨噬細胞中的熒光強度。所用激發波長為488 nm， 發射波長為475 nm， 每孔于不同視野計數100個細胞以上， 取其平均熒光值作為定量參數。
1.2.6 NFκB的免疫細胞化學染色 取出細胞培養板孔內爬有巨噬細胞的蓋玻片， 以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次， 干燥。染色程序按免疫細胞化學SP法常規進行。一抗為兔抗p65抗體， 二抗為生物素化的羊抗兔IgG。以PBS代替一抗作為陰性對照。
1.2.7 觀察指標及統計學處理 對每張蓋玻片以16D目鏡測微網在400倍放大下計數網格中細胞核著色的陽性細胞數， 每例計數10個網格， 取其均值作為該樣本中NFκB+細胞的密度， 以t檢驗行統計學處理。其余各組間的比較也采用t檢驗。
2 結果
2.1 巨噬細胞中6種PKC含量的檢測 以激光共聚焦顯微鏡觀測巨噬細胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的熒光強度。結果顯示， 小鼠腹腔巨噬細胞被青春型雙歧桿菌的DNA刺激后， 其PKCα和PKCβII的熒光強度明顯高于對照組（P0.05， 表1、 圖1）。
表1 巨噬細胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε及PKCζ含量的檢測 略
圖1 小鼠腹腔巨噬細胞中PKCα表達的激光掃描共聚焦顯微鏡觀測 略
2.2 雙歧桿菌DNA對巨噬細胞中NFκB表達的影響 NFκB主要是由p50和p65組成的異源二聚體。實驗用兔抗p65抗體作為免疫細胞化學染色中的一抗， 其結果即可反映NFκB的存在。實驗結果中， NFκB陽性產物表現為黃褐色顆粒狀物。雙歧桿菌的DNA注射組巨噬細胞中， NFκB陽性產物存在于胞漿和胞核， 但以胞核為主， 其胞核上NFκB陽性產物的密度為（17563±1020）個; 對照組巨噬細胞中NFκB的陽性產物主要位于胞漿， 其胞核上NFκB陽性產物的密度為（8398±764）個， 兩組比較差異具有統計學意義(P
3 討論
PKC是結構相近、 依賴鈣、 磷脂和二?；视图せ畹慕z氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的多基因超家族，對細胞生長和轉化的調節起重要作用。目前已闡明， 很多巨噬細胞的激活劑均能使其胞內PKC的濃度上升。Lin等[5]證實， UTP可激活小鼠RAW264.7巨噬細胞， 提高磷脂酶A2及花生四烯酸的水平依賴的磷酯酰膽堿磷脂酶 C（PIPLC）的活化以及胞內[Ca2+]i濃度的升高， 并證實 PKC的激活亦參與了這一過程。Kumar等[6]報道， 催乳素能激活小鼠腹腔巨噬細胞，使之分泌大量的IL1和NO， 其機制主要是激活PKC。Shishodia和Um等[7， 8]則分別報道， 順鉑和II 型肺炎鏈球菌細胞壁多糖能激活巨噬細胞， 產生多量的TNFα， 這一過程需要PKC的活化。本研究表明， 雙歧桿菌DNA注射組巨噬細胞中PKCα和PKCβII的熒光強度明顯高于對照組; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε及PKCζ的熒光強度在兩組間無統計學意義， 提示青春型雙歧桿菌的DNA能活化巨噬細胞中的PKCα和PKCβII; 而對PKCβI、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的活性無明顯影響。靜息狀態下， NFκB的同源或異源二聚體與抑制性蛋白IκB結合而存在于胞質中。當細胞受到外界刺激時， 可通過信號轉導激活IκB激酶（IKK）， 導致IκB發生磷酸并被降解， 于是NFκB釋放出來并被激活， 接著發生核易位， 和靶基因的特定位點相結合， 從而調控靶基因的轉錄。已知NFκB的活化是巨噬細胞的激活機制之一。von Knethen等[9]發現， 亞致死量的H2O2 能活化小鼠 RAW264.7巨噬細胞中的NFκB， 進而增強環氧合酶 2 的表達。Darieva等[10]證實， BCG能激活小鼠J774巨噬細胞， 使之分泌多量的IL6、 NO 和TNFα等具有殺瘤活性的效應分子， 其機制主要是增強NFκB DNA的結合。Liu等[11]報道， 乳酸桿菌細胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan， PG）可作用于小鼠RAW264.7巨噬細胞的Tolllike 受體2(Tolllike receptor 2， TLR 2)， 進而激活NFκB， 最終增強其細胞毒活性。Mandrika等[12]也發現， 具有抗炎和免疫調節作用的黑色素細胞刺激激素α(alphamelanocytestimulating hormone， αMSH)能促使巨噬細胞中的NFκB核轉位， 進而上調誘導型一氧化氮合酶mRNA的表達， 最終催化底物精氨酸產生多量的NO。李義軍等[13]則證實， 細菌內毒素能明顯提高小鼠腹腔巨噬細胞NFκB的活性。本研究表明， 雙歧桿菌DNA注射組巨噬細胞細胞核表達NFκB+細胞的密度顯著高于對照組， 提示青春型雙歧桿菌的DNA能有效地促進巨噬細胞中NFκB的轉位和活化。已知雙歧桿菌的DNA能激活機體免疫系統中的巨噬細胞。宋文剛等[14]報道， 嬰兒型雙歧桿菌的DNA能活化巨噬細胞， 增強其吞噬功能， 并使之分泌多量的IL1和TNFα。Stacey等[15]證實， 分叉雙歧桿菌的DNA能刺激巨噬細胞釋放多量的IL6和 IL12。目前認為， 細菌DNA激活巨噬細胞的途徑主要為刺激性CpG DNA與巨噬細胞Toll 樣受體9(Toll like receptor 9， TLR 9)的結合， 接著誘導細胞內產生多量的活性氧(ROS)。ROS作為第二信使， 進一步可活化MAPK和AP1等信號分子， 最終調節相關基因的表達[16]。結合本研究的結果， 我們認為， 活化PKCα、 PKCβII及 NFκB是青春型雙歧桿菌DNA激活巨噬細胞的另一途徑。
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