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1材料與方法

1．1材料

微生物油脂（含43％ARA），嘉必優生物工程（武漢）有限公司贈送；固定化酶（LipozymeRMIM）購于北京諾維信公司；1，3－ARA－DAG、1，2－ARA－DAG購于瑞典Larodan公司；正己烷、乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇均為色譜純，購于德國CNW公司；氫氧化鈉、尿素、無水硫酸鎂、鹽酸、乙醇、石油醚、甘油、無水乙醚、4A型分子篩均為分析純，購于國藥化學試劑集團。

1．2試驗儀器

分析天平（AUY120，SHIMADZU，Japan）；旋轉蒸發儀（RE－52A，上海亞榮生化儀器）；集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋（DF－101S，鞏義市予華儀器有限責任公司）；氣相色譜儀（Agilent7890A，美國Agilent公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200，美國Agilent公司）；質譜儀（AB4000Q－Trap，美國AB公司）；微型旋渦混合儀（WH－3，上海滬西分析儀器有限公司）。

1．3試驗方法

1．3．1尿素包埋法純化微生物油脂于500mL三口瓶中加入40g微生物油脂、200mL無水乙醇、30％氫氧化鈉（以微生物油脂質量計），充氮氣保護下，在恒溫水浴加熱攪拌器上80℃水浴回流2h，加入100mL的蒸餾水，攪拌均勻并冷卻至室溫，加鹽酸酸化至pH＝1～2左右［18］。用無水乙醚∶石油醚＝1∶1（V／V）混合溶液萃取2～3次，將萃取液水洗至中性，并旋轉蒸發除去有機相，得到游離形態的脂肪酸混合物。將其加入到尿素／乙醇溶液中，氮氣保護下回流2h后，迅速轉移到250mL的錐形瓶中，密封后于－20℃冰箱中結晶過夜。所得到的尿素包合物經抽濾，旋轉蒸發和萃取后，經無水硫酸鎂脫水得到純化后的脂肪酸。稱重并計算回收率。并取少量原樣品和尿素包埋后的樣品進行甲酯化衍生化處理，經GC檢測尿素包埋前后ARA的含量變化。1．3．2酶法合成富含ARA的1，3－DAG按照一定的摩爾比準確稱取ARA和甘油于20mL兩口圓底燒瓶中，氮氣保護條件下，將其置于一定溫度的水浴鍋中，待攪拌均勻后，加入一定量的固定化酶LipozymeRMIM和20％（占底物總質量）已活化的4A型分子篩，在200r／min的轉速下攪拌反應，按一定的時間間隔取樣，采用HPLC－MS－MRM分析酯化后產物及各組分的相對百分含量。1．3．3脂肪酸的GC檢測脂肪酸的甲酯化衍生化處理采用本實驗室建立的方法［19］。GC檢測條件為色譜柱：HP－FFAP毛細管柱（Agilent，30m×0．25mm×0．5μm）；檢測器：氫離子火焰化檢測器（FlameIonizationDetector，FID）；以氮氣為載氣，進樣口壓力為25psi，進樣量為1μL，分流比為1∶30；升溫程序：初始溫度210℃保持7min，以20℃／min升溫至230℃并保持5min，總分析時間為12min；進樣口和檢測器溫度分別為260℃和280℃。采用面積歸一法計算脂肪酸的相對百分含量。1．3．4產物中1，3－DAG的HPLC－MS－MRM檢測產物中1，3－ARA－DAG的HPLC檢測條件為色譜柱：Agilent－SIL（5μm，2．0mm×250mm）；流動相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝80∶20∶1，（V／V／V）；流速：0．5mL／min；柱溫：40℃；進樣量：10μL；總時間：20min。檢測器MS的條件為APCI模式：正離子；CUR：137．9kPa；CAD：medium；NC：27．38kPa；溫度（TEM）：450℃；掃描模式：MRM－EPI；掃描速度：1000u／s；離子源氣體1（ionsourcegas1，GS1）∶344．75kPa；輔助加熱（interfaceheater，ihe）：開；DP：80V；CE：35V和55V；碰撞電壓擺幅（collisionenergyspread，CES）：5V；碰撞室輸出電壓（collisioncellexitprotential，CXP）17V；質量范圍：500～1000m／z。采用面積歸一法計算產物中1，3－DAG的相對百分含量。1．3．5數據分析本實驗采用SAS（statisticalanalysissystem）9．0統計軟件進行數據處理，實驗重復三次，取其平均值。用Origin作圖工具，對結果進行分析。

2結果與分析

2．1尿素包埋法純化微生物油脂中的ARA

尿素包埋法作為一種普遍的富集LC－PUFAs的方法，一直受到人們的青睞［21］。本實驗中，當尿素∶混合脂肪酸∶甲醇比為2g∶1g∶20mL，結晶溫度為－20℃時，經GC檢測分析后，ARA的相對百分含量由原來的43％（如圖1中A）提高到83％，且回收率為54．35％。力為25psi，進樣量為1μL，分流比為1∶30；升溫程序：初始溫度210℃保持7min，以20℃／min升溫至230℃并保持5min，總分析時間為12min；進樣口和檢測器溫度分別為260℃和280℃。采用面積歸一法計算脂肪酸的相對百分含量。1．3．4產物中1，3－DAG的HPLC－MS－MRM檢測產物中1，3－ARA－DAG的HPLC檢測條件為色譜柱：Agilent－SIL（5μm，2．0mm×250mm）；流動相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝80∶20∶1，（V／V／V）；流速：0．5mL／min；柱溫：40℃；進樣量：10μL；總時間：20min。檢測器MS的條件為APCI模式：正離子；CUR：137．9kPa；CAD：medium；NC：27．38kPa；溫度（TEM）：450℃；掃描模式：MRM－EPI；掃描速度：1000u／s；離子源氣體1（ionsourcegas1，GS1）∶344．75kPa；輔助加熱（interfaceheater，ihe）：開；DP：80V；CE：35V和55V；碰撞電壓擺幅（collisionenergyspread，CES）：5V；碰撞室輸出電壓（collisioncellexitprotential，CXP）17V；質量范圍：500～1000m／z。

2．2產物中1，3－DAG的HPLC－MS－MRM檢測

脂肪酸與甘油酯化反應的產物中有TAG、1，2－DAG、1，3－DAG、1（2）－MAG和未反應的脂肪酸及甘油。本實驗就產物中主要的產物TAG、1，2－DAG、1，3－DAG進行定量檢測，通過優化色譜條件，最終確定流動相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝80∶20∶1，（V／V／V）；流速：0．5mL／min；進樣量：10μL；總時間：20min時，分離效果較好。

2．3脂肪酶催化合成

1，3－DAG的單因素實驗2．3．1反應時間對酶促酯化合成1，3－DAG的影響本實驗在甘油與ARA摩爾比為1∶2，脂肪酶添加量為5％（以底物總質量計），反應溫度為50℃的條件下，定期取樣分析產物中1，3－DAG含量的變化。結果如圖3所示，隨著反應時間的延長，底物中1，3－DAG的相對百分含量呈現先增加后減小的趨勢，并在2h時，達到最大值68．9％；2h后，1，3－DAG的相對百分含量明顯下降，到10h時降為16．1％并趨于穩定。這可能是因為隨著反應時間的延長，1，3－DAG發生了酰基轉移，進而轉化為1，2－DAG或者TAG，從而使反應產物中1，3－DAG的含量降低。因此，2h為最佳的反應時間。2．3．2反應溫度對酶促酯化合成1，3－DAG的影響本實驗在反應時間（2h）、脂肪酶添加量（5％）和底物摩爾比（甘油／ARA＝1∶2）一定的條件下來優化溫度對酯化合成1，3－DAG的影響。由圖4可知，隨著反應溫度的升高，1，3－DAG的相對百分含量呈現先增加后減小的趨勢，并在50℃時達到最大，為68．3％。隨著溫度的繼續升高，其含量呈現遞減的趨勢。這可能是由于溫度的升高促使脂肪酶的活力逐漸提高，而且溫度升高有利于底物混合均勻，降低反應體系的黏度，從而更有利于酯化反應的進行。然而，隨著溫度進一步升高，?；D移率也相應的增加，從而使1，3－DAG的相對百分含量降低；此外，長時間的高溫反應環境條件會造成部分酶活力喪失，甚至會造成ARA發生氧化，均可能導致1，3－DAG相對百分含量的降低。因此，綜合考慮以上因素，50℃作為反應溫度較佳。2．3．3不同底物摩爾比對酶促酯化合成1，3－DAG的影響在反應溫度50℃、反應時間2h及脂肪酶添加量為5％的條件下，考察不同底物摩爾比對反應結果的影響。由圖5可知，在一定范圍內，隨著體系中ARA含量的增加，產物中1，3－DAG的相對百分含量逐漸增加，并在甘油／ARA為1∶2時，1，3－DAG的相對百分含量最高達72．1％。然而隨著ARA的繼續增加，產物中1，3－DAG的量開始降低，這可能是過量的ARA與產物中的1，3－DAG進一步發生反應生成了TAG。因此綜合考慮，反應體系中底物摩爾比甘油／ARA采用1∶2為宜。2．3．4脂肪酶添加量對酶促酯化合成1，3－DAG的影響在反應時間2h、反應溫度50℃和底物摩爾比（甘油／ARA）為1∶2的條件下，設計實驗考察脂肪酶添加量對產物中1，3－DAG的影響。如圖6所示，脂肪酶的添加量對反應有顯著影響。脂肪酶添加量在1％～5％的范圍內，1，3－DAG的相對百分含量隨著脂肪酶添加量的增加而增加，并在酶添加量為5％時，1，3－DAG相對百分含量達到最大值82．8％；當繼續增加酶量到10％時，1，3－DAG的含量有所降低，這可能是因為底物已經被脂肪酶分子所飽和，且隨著脂肪酶添加量的增加，一定程度上也增加了發生酰基轉移的幾率，將1，3－DAG轉化為1，2－DAG或者TAG。綜合考慮以上因素，最佳的脂肪酶添加量為5％。

2．4響應面試驗結果與分析

2．4．1回歸方程的建立與分析基于單因素試驗結果，選取溫度（X1）、時間（X2）、酶加量（X3）及底物摩爾比（X4）為自變量，以產物中1，3－DAG相對百分含量（以峰面積表示）Y為響應值，采用中心組合設計實驗，對所獲得的單因素條件進行響應面優化。以Box－Benheken實驗設計獲得數據為基礎，在此基礎上利用SAS9．0軟件對獲得的數據進行擬合分析，得到1，3－DAG含量的動態參數方程如下：Y＝152300＋20562．58X1＋36337．5X2＋47125X3＋1780．25X4－20213．37X1X1＋1502．25X1X2＋12545X1X3－12985X1X4－38758．75X2X2＋10302．5X2X3＋12946．75X2X4－30572．5X3X3＋15107．5X3X4－20180．37X4X4。從回歸方程模型系數的方差分析結果（表3）可以看出，模型P＝0．0063＜0．01，說明回歸模型方程極顯著。模型的R2值為0．8407，表明優化好的參數值有大約84．07％來源于回歸方程模型，同時模型的失擬項P＝0．544869＞0．05，符合失擬項不顯著的要求。這表明此模型可以很好的用來預測最優化條件。且根據方差分析可知，各因子對1，3－DAG的影響主次關系為X3＞X2＞X1＞X4，即酶添加量最大，其次為時間、溫度，底物摩爾比最小。2．4．2響應面優化及模型驗證為了更直觀地顯示各因素之間的關系，對經響應面法優化后的結果進行規范分析，考察SAS9．0所擬合的響應曲面形狀，獲得響應面立體圖及對應的等高線圖，如圖7所示，模型具有穩定點，各因素間的交互作用較明顯。經擬合分析后，得出酶促酯化合成1，3－DAG的穩定值及最優條件，最佳工藝參數為：X1（溫度）57℃，X2（時間）2．7h，X3（酶量）7．9％，X4（摩爾比）2．5∶1。在此最優條件下，進行三次重復驗證實驗，1，3－DAG的實際平均峰面積為9．8×104，與理論值（1．0×105）非常接近，說明該預測模型是可靠的；并且，此時1，3－DAG在整個DAG和TAG混合物中的相對百分含量為73．5％，且1，3－ARA－DAG含量為38．1％。

3結論

本文系統地研究了無溶劑體系中，以富含ARA的微生物油脂為原料，通過酶促酯化反應合成富含ARA的1，3－DAG的工藝。得出合成富含ARA的1，3－DAG的最佳工藝條件為：反應溫度57℃，反應時間2．7h，酶添加量7．9％，ARA與甘油的底物摩爾比為2．5∶1，在此最優條件下，1，3－DAG在反應產物中DAG和TAG混合物中的相對百分含量為73．5％，且1，3－ARA－DAG含量為38．1％，結果較為理想。本研究所建立的酶法合成富含ARA的1，3－DAG的工藝研究，對進一步開發利用微生物油脂資源，提高微生物油脂的附加值有著非常重要的實際意義。這方面研究將在今后生產有利于人體健康和食品加工的專用油脂、富含LC－PUFA的功能性油脂和結構脂質產品的研發等領域有著廣闊的應用前景。

作者：劉四磊劉偉董緒燕魏芳王湘呂昕鐘娟吳琳陳洪單位：中國農業科學院油料作物研究所湖北省脂質化學與營養重點開放實驗室華中科技大學生命科學學院