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【關鍵詞】缺血預處理EffectsofrenalischemicpreconditioningontheexpressionsofBcl2,Bax,Fasproteinsinimmaturemyocardialcellsinrabbits【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofrenalischemicpreconditioning(RIP)onapoptosisandexpressionsofBcl2,BaxandFasproteinsinimmaturemyocardialcellsinrabbits.METHODS:Isolatedworkingrabbitheartmodelwasusedinthisstudyand24immaturerabbitswererandomlydividedintocontrolgroup,ischemia/reperfusion(I/R)groupandRIPgroup.TheTUNEL,nucleosomalladderofDNAfragmentsandtheexpressionofBcl2,BaxandFasproteinsweredetected.RESULTS:ComparedwiththatinI/Rgroup,TUNELcellapoptosiswaslower［(4.19±1.13)%vs(12.30±2.10)%,P<0.01］,ladderofDNAfragmentswaslower(57350±1765vs135200±3370,P<0.01),Bcl2expressionwashigher(33525±1026vs12385±860,P<0.01),Baxexpressionwaslower(8640±768vs32472±1128,P<0.01)andFasexpressionwaslower(8936±912vs32100±1260,P<0.01)inRIPgroup.CONCLUSION:RIPdecreasesimmaturemyocardialcellapoptosisandaffectstheexpressionsofBcl2,BaxandFasproteins.【Keywords】kidney;ischemicpreconditioning;apoptosis;Bcl2;Bax;Fas【摘要】目的：探討腎缺血預處理(RIP)對兔未成熟心肌細胞凋亡和Bcl2,Bax,Fas蛋白表達的影響.方法：24只幼兔采用Langendorff離體心臟灌注模型，隨機分為正常對照組（C）、心臟缺血/再灌注組(I/R)和腎缺血預處理組(RIP)，每組8只，測定各組未成熟心肌細胞凋亡和Bcl2,Bax,Fas蛋白表達.結果：RIP組與I/R組比較，心肌細胞凋亡率明顯減少［(4.19±1.13)%vs（12.30±2.10）%,P<0.01］，DN段梯光密度明顯減少(57350±1765vs135200±3370,P<0.01),Bcl2表達增多(33525±1026vs12385±860,P<0.01),Bax(8640±768vs32472±1128,P<0.01)和Fas(8936±912vs32100±1260,P<0.01)表達明顯減少.結論：RIP可減少缺血再灌注后兔未成熟心肌細胞凋亡和影響Bcl2,Bax,Fas蛋白的表達.【關鍵詞】腎；缺血預處理；細胞凋亡；Bcl2；Bax；Fas0引言實驗表明，成熟心肌和心肌外的組織器官缺血預處理可減少心肌細胞凋亡的發生，其中Bcl2,Bax,Fas等基因蛋白的表達在細胞凋亡中起重要作用.腎缺血預處理(renalischemicpreconditioning,RIP)對未成熟心肌細胞凋亡是否有影響的報道甚少.本實驗目的是觀察RIP對兔未成熟心肌細胞凋亡和Bcl2,Bax,Fas等基因蛋白表達的影響.1材料和方法1.1材料出生14～21d的健康長耳大白兔24只(華中科技大學同濟醫學院動物室提供)，雌雄不拘.MPIAS1000型多媒體病理圖像分析系統（華中科技大學同濟醫學院清平影像工程公司生產）進行光密度測定.細胞凋亡試劑盒購自南京建成生物技術有限公司.1.2方法1.2.1模型建立及分組按處理方式不同將動物隨機分為3組,每組8只.開胸，右心耳注入肝素(300U/kg)，切開主動脈插入灌注管，即行KH液Langendorff灌流，灌注壓為6kPa(45.0mmHg).切取心臟，結扎肺靜脈，剪開左心耳將內徑3mm左房灌注管插入左房，內徑1mm測壓管插入左心室.左房灌注壓為1kPa(7.5mmHg)，左心后負荷為3.0kPa(22.5mmHg).KH緩沖液成分(mmol/L):NaCl118.50,KCl4.70,CaCl22.50,MgSO41.20,NaHCO325.00,KH2PO41.20,Glucose11.10,Na2EDTA0.50.使用時新鮮配制，經0.45μm濾器過濾，灌流前給予體積分數為950mL/LO2和50mL/LCO2混合氣體按1.5L/min向儲液瓶內的灌流液中通氣30min，灌流液維持在37℃，pH為7.4，滲透壓為824~850kPa/L［320~330mosm/L,1mosm=2.5787kPa(37℃)］.①正常對照組（C）:僅灌注KH液180min，然后取心肌標本.②缺血/再灌注組(I/R)：灌注20min后，停灌45min，復灌120min.③腎缺血預處理組(RIP)：反復2次阻斷腎血流5min/放開5min，建立Langendorff模型，然后重復I/R組缺血/再灌注方法.1.2.2觀察指標①凋亡細胞原位標記與半定量分析：左心室心肌組織常規石蠟包埋，采用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT酶)介導帶熒光的deuridinetriphosphate(dUTP)缺口末端標記法(terminaltransferaseUTPnickendlabeling,TUNEL)［1］，標記凋亡細胞核中DNA3′OH末端，經脫蠟，洗脫，消化，孵育，洗脫，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察.根據凋亡陽性細胞分布情況，每張切片拍攝5個陽性視野，每視野計數300個心肌細胞中陽性細胞數，以平均計算陽性細胞所占的百分比作為凋亡細胞陽性指數(AI).②瓊脂糖凝膠電泳檢測DN段梯：采用快速法檢測DN段梯［2］.③Bcl2,Bax,Fas基因蛋白的表達：采用WesternBlot法.用2×SDS樣品緩沖液裂解細胞，收集細胞蛋白質，經SDSPAGE分離后迅速轉移至尼龍膜，按文獻［3］法加入單抗(1∶1000)及堿性磷酸酶偶聯的抗小鼠IgG(1∶1000)用BCIP/NBT顯色.應用MPIAS1000型多媒體彩色病理圖像分析系統進行定量測定A值.統計學處理：數據以x±s表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義.2結果2.1凋亡細胞原位標記與半定量分析RIP組的細胞凋亡率為(4.19±1.13)%，與I/R組的(12.30±2.10)%比較P<0.01(Fig1).2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測DN段梯DN段梯光密度測定RIP組(57350±1765)與I/R組(135200±3370)比較差異有統計學意義(P<0.01).2.3Bcl2,Bax,Fas蛋白的表達密度測定Bcl2蛋白RIP組(33525±1026)與I/R組(12385±860)比較差異有統計學意義(P<0.01)；Bax蛋白RIP組(8640±768)與I/R組(32472±1128)比較差異有統計學意義(P<0.01)；Fas蛋白RIP組(8936±912)與I/R組(32100±1260)比較差異有統計學意義(P<0.01).3討論缺血再灌注損傷可誘發細胞凋亡的發生［4］，細胞凋亡已成為再灌注損傷發病機制中一個重要環節.通過干預凋亡基因的表達阻斷細胞凋亡以減輕再灌注損傷的研究是近年來細胞分子生物學研究的重點之一.近年來研究認為心肌缺血預處理可減少細胞凋亡的發生［5］.心肌缺血預處理是通過PKC的信號傳遞來保護心肌的，PKC和mitoKATP與凋亡信號轉導途徑相關連，從而影響心肌的細胞凋亡［6］，而RIP的心肌保護作用亦與PKC和mitoKATP相關.Bcl2主要表達于線粒體外膜、核膜和內質網膜上，其表達可抑制細胞凋亡，Bax表達則促進細胞凋亡.細胞凋亡是一種受促凋亡基因如fas和抗凋亡基因如bcl2調控的主動性細胞死亡過程.Fas屬于TNF受體家族.由Fas介導的細胞凋亡存在于多種細胞系中.心肌細胞膜表達功能性的Fas和FasL，但是在正常情況下Fas和FasL并不介導心肌細胞發生凋亡.我們通過建立Langendorff灌注模型檢驗了RIP對兔未成熟心肌細胞凋亡及Bcl2,Bax,Fas基因蛋白表達的影響,發現RIP使缺血再灌注后兔未成熟心肌細胞凋亡明顯減少，Bcl2基因蛋白的表達明顯增多，而Bax,Fas基因蛋白的表達明顯減少，說明在兔未成熟心肌，RIP可通過影響Bcl2,Bax,Fas基因蛋白的表達而減少心肌細胞凋亡.【參考文獻】［1］GavrieliY,ShermanY,BenSassonSA.IndentificationofprogrammedcelldeathinsituviaspecificlabelingofnuclearDNAfragmentation［J］.JCellBiol,1992;1[1][2]19:493-501.［2］姜泊.分子生物學常用實驗方法［M］.北京：人民軍醫出版社，1996：177.［3］SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:Alaboratorymanual［M］.2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory.1989:1860-1874.［4］GottliebRA,BurlesonKO,KlonerRA,etal.Reperfusioninjuryinducesapoptosisinrabbitcardiomyocytes［J］.JClinInvest,1994;94:1621-1628.［5］WangNP,BufkinBL,NakamuraM,etal.Ischemicpreconditioningreducesneutrophilaccumulationandmyocardialapoptosis［J］.AnnThoracSurg,1999;67:1689-1695.［6］AkaoM,OhlerA,ORourkeB,etal.MitochondrialATPsensitivepotassiumchannelsinhibitapoptosisinducedbyoxidativestressincardiaccells［J］.CircRes,2001;88:1267-1275