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【關鍵詞】地塞米松；星型膠質細胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2

摘要：目的：探討地塞米松引起體外純化培養的大鼠大腦皮質星型膠質細胞凋亡的機制。方法：不同濃度的地塞米松（濃度為10-5、10-4、10-3mol/L）與純化培養的大鼠大腦皮質星形膠質細胞共同孵育24小時后，用免疫細胞化學方法檢測P53、Bax及Bcl2在星型膠質細胞內的表達情況，表達的強弱用平均光密度表示。結果：P53和Bax的表達隨著地塞米松濃度的升高而增強，與對照組比較，各組均有極顯著性差異（P<0.01）,Bcl2的表達隨著地塞米松濃度的升高先是增強而后減弱，與其他組比較10-3組有顯著性差異（P<0.05）。結論：P53和Bax的表達增強可能是大劑量地塞米松引起星型膠質細胞凋亡的主要因素。

關鍵詞：地塞米松；星型膠質細胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2

在哺乳動物的中樞神經系統內約有一千億個神經元，而在這些神經元的周圍又約有十倍以上的膠質細胞存在，其中以星型膠質細胞數量最多。傳統觀點認為，星型膠質細胞只對神經元起結構和功能上的支持作用，但近年來越來越多的證據表明，星型膠質細胞在中樞神經系統內扮演著更為積極和更為重要的角色，這也是膠質細胞成為神經領域研究熱點的一個直接原因。糖皮質激素(glucocorticoid,GC)是一類具有神經活性的甾體激素，已有許多實驗證實GC對神經元的生長、分化和凋亡都起重要的調節作用，但對膠質細胞的影響報道不多。已有報道證實大劑量的地塞米松可誘導體外培養的星型膠質細胞凋亡［1］，為進一步探討其機制，我們做了如下研究。

1材料和方法

11材料

新生Wistar大鼠6只（由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供）；DMEM/F12培養基（GIBCO公司）；胎牛血清和小牛血清（GIBCO公司）；L谷氨酰胺（上海伯奧生物科技有限公司）；地塞米松（湖北恒生制藥有限公司）；兔抗p53、Bax、Bcl2抗體（santacruz公司）；SABC免疫組化試劑盒及DAB試劑盒（北京中山公司）；24孔培養板（Corning公司）；HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統（同濟千屏影像公司）；SL2300二氧化碳培養箱（美國Sheldon公司）；UFXII光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

12方法

121星形膠質細胞的純化培養將出生1~2天的新生Wistar大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，采用無菌方法迅速取出大腦，用DHanks液清洗并剔除腦膜和血管，取大腦皮質，將組織剪碎為1mm3大小，用0.125%胰蛋白酶37℃消化數分鐘，過濾（200目），離心（1000rpm5min），去上清，加入DMEM/F12完全培養基（其中含5%胎牛血清，10%小牛血清，L谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100u/ml,鏈霉素0.1mg/ml）制成細胞懸液。計數后按5×104/cm2接種于培養瓶，加入DMEM/F12完全培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養9天（每3天更換培養液一次），第9天將培養瓶置于恒溫旋轉搖床上(240rpm)，搖18小時，去掉含有懸浮細胞的培養液，用DHanks液清洗3次，進行傳代培養即得純化的星形膠質細胞［2］。經免疫細胞化學方法檢測，95%以上的細胞GFAP免疫反應為陽性。

122實驗分組在24孔培養板的每一孔內放入一張1cm2消毒過的玻片，涂上多聚賴氨酸，然后將星型膠質細胞分組種在玻片上（細胞爬片）。純化的星形膠質細胞被分成1個對照組和3個實驗組，每組3個樣本。對照組不加地塞米松，其它3組分別加入終濃度為10-5、10-4、10-3mol/L的地塞米松。在37℃、5%CO2條件下，繼續培養24小時,然后作免疫細胞化學分析。

123免疫細胞化學染色將各組細胞爬片進行SABC法免疫細胞化學染色。每一培養孔中的細胞爬片經固定、封閉非特異性抗原和消除內源性過氧化物酶等處理后，首先加入特異性抗體（P53、Bax、Bcl2），4℃孵育72h。然后依次加入生物素化羊抗兔IgG，37℃、1h；SABC復合物，37℃、1h；DAB顯色5min。每步間均用PBS充分洗滌。所有爬片經脫水、透明、中性樹膠封片后，光鏡下觀察、攝片。

以正常兔血清和PBS緩沖液替代一抗作對照染色，結果為陰性。

124圖像分析用HPIAS1000高清晰圖像分析系統進行陽性細胞計數及平均光密度分析。所得數據應用SPSS統計軟件，以方差分析進行統計分析，P＜0.05定為差異有顯著性,數據以均數±標準差（±s）表示。

2結果

21形態學觀測結果

P53對照組：可見少數免疫反應陽性細胞，反應產物呈棕黃色，主要見于胞核（圖1）。10-5組：免疫反應陽性細胞增多，反應產物呈棕黃色，見于胞核，胞漿淡染（圖2）。10-4組：免疫反應陽性細胞明顯增多，反應產物呈棕黃色，見于胞核，胞漿也有表達（圖3）。10-3組：大多數細胞呈免疫反應陽性，反應產物呈棕褐色，胞核胞漿界限不清（圖4）。

Bax對照組：細胞大小形態一致，核膜著色呈棕黃色，胞核中央有透亮區，胞漿淡染（圖5）。10-5組：免疫反應產物顏色加深，細胞形態變化不大（圖6）。10-4組：顏色進一步加深，細胞形態無太大變化（圖7）。10-3組：免疫反應產物呈棕褐色，胞漿染色明顯加深，少數細胞體積縮小，核濃縮、深染（圖8）。

Bcl2對照組、10-5組、10-4組這3組細胞大小形態基本一致，細胞著色變化也不大，胞核胞漿均有著色，反應產物呈棕黃色（圖9~11）。10-3組：與前3組比較，10-3組細胞染色明顯變淺，尤其是胞漿明顯淡染（圖12）。圖1對照組P53的表達(×200)圖210-5組P53的表達(×200)

22圖像分析結果

221地塞米松對P53表達的影響不同濃度（對照組、10-5組、10-4組、10-3組）地塞米松與純化的星型膠質細胞共同孵育24小時后，P53的表達隨著地塞米松濃度的升高而逐漸增強，與對照組比較各組均有極顯著性差異（P<0.01），各濃度組（10-5組、10-4組、10-3組）之間兩兩比較也有極顯著性差異（P<0.01），見表1。

222地塞米松對Bax表達的影響不同濃度（對照組、10-5組、10-4組、10-3組）的地塞米松與純化的星型膠質細胞共同孵育24小時后，Bax的表達也隨著地塞米松濃度的升高而增強，但其幅度有所減緩，與對照組比較各組均有極顯著性差異（P<0.01），各濃度組（10-5組、10-4組、10-3組）之間兩兩比較有顯著性差異（P<0.05）,見表1。

223地塞米松對Bcl2表達的影響不同濃度（對照組、10-5組、10-4組、10-3組）的地塞米松與純化的星型膠質細胞共同孵育24小時后，Bcl2的表達變化較復雜，先是10-5組呈現增強趨勢，從10-4組開始出現減弱趨勢，至10-3組出現明顯減弱，其中對照組、10-5組、10-4組之間經過統計學分析沒有顯著性差異（P>0.05）,而10-3組與其他各組比較有顯著性差異（P<0.05）,見表1。表1星型膠質細胞經Dex處理后P53、Bax、Bcl2表達的平均光密度

224地塞米松對Bax與Bcl2表達比值（Bax/Bcl2）的影響把每一濃度組Bax表達的平均光密度與同組Bcl2的平均光密度作一比值，我們發現隨著地塞米松濃度的升高，Bax/Bcl2值也逐漸升高，而10-3組最為顯著，見表2。表2星型膠質細胞經Dex處理后Bax與Bcl2平均光密度比值

3討論

細胞凋亡（程序化細胞死亡）與細胞壞死完全不同，它是一種積極意義上的細胞死亡，它不但在病理條件下而且在多種生理條件下發揮著重要的作用［3,4］。有大量證據表明，在胚胎發育過程中發生的神經細胞的死亡大多與凋亡有關［5］。另外，局部缺血、興奮毒性作用、腦外傷和慢性退行性病變等都可促使凋亡的發生［4,6］。已有報道證實，大劑量的地塞米松可引起體外純化培養的星型膠質細胞凋亡［1］，但其確切機制尚不清楚。為了探討其中的機制，我們設計了本實驗，檢驗地塞米松是否引起了P53、Bax及Bcl2表達的變化。我們發現，P53的表達隨著地塞米松濃度的升高而逐漸增強，Bax的表達也隨著地塞米松濃度的升高而增強，但其幅度有所減緩，Bcl2的表達先是10-5組呈現增強趨勢，從10-4組開始出現減弱趨勢，至10-3組出現明顯減弱，這樣導致Bax/Bcl2值逐漸升高，10-3組最為明顯，這可能是10-3組引起星型膠質細胞凋亡的直接原因。

眾所周知，很多原因比如缺血、放射線以及興奮毒性作用都可以引起P53表達的增強，最終導致神經細胞凋亡［2，7］。P53基因編碼的產物，即P53蛋白可以調節Bax的表達，而Bax可能是介導P53依賴的神經細胞凋亡的主要因素［8］。另外，Whiteetal發現在敲除掉Bax基因的小鼠大腦中很難找到自然死亡的神經細胞［9］。有人發現P53可以通過降低Bcl2的表達來間接地引起細胞凋亡［10］。Bax可以通過與Bcl2形成同型或異型二聚體來促進凋亡的發生［11］，因此，Bax與Bcl2比例的變化就可以決定某些細胞是存活或是死亡［11］。在本實驗中，地塞米松引起P53持續升高，Bax也有類似的表現，而Bcl2是先升后降。總之，P53、Bax、Bcl2經過地塞米松作用后其表達都發生了顯著的改變，尤其是10-3組，這提示它們在地塞米松誘導星型膠質細胞凋亡的過程中發揮著重要的作用。Bax表達增強可能是P53表達增強的結果，因為P53可以促進Bax的轉錄和翻譯［10］。另一方面，P53表達的增強又可能抑制了Bcl2，使它表達下降［10］，但是細胞本身可能存在一種抗凋亡的補償機制［12］，使得在Bax表達增強的情況下Bcl2也加強表達，以對抗Bax的促凋亡作用，但這種抗凋亡作用是有一定限度的，因此，Bcl2的表達先增強后減弱。Bax/Bcl2值因此進行性升高，這可能直接導致10-3組星型膠質細胞凋亡。

地塞米松引起P53和Bax表達增強可能是通過作用于胞漿內的糖皮質激素受體開始的。L.E.Haynes報道地塞米松能引起在體紋狀體和海馬神經元凋亡，但這種作用可被糖皮質激素受體阻滯劑RU38486阻斷［13］。類似的報道還有，Karine發現地塞米松能誘導脾B淋巴細胞凋亡，但同樣可被RU486完全阻斷［14］。地塞米松與胞漿內的糖皮質激素受體結合后，受體的構象發生改變，激素受體復合物進入核內與激素反應元件GRE結合，可能激活或抑制某些基因的轉錄，最終導致P53和Bax表達增強，其確切機制有待進一步研究。Bax能與自身形成二聚體，這種二聚體在線粒體膜上可以組成離子通道［15］，線粒體膜內外的小分子和離子可通過該通道進行被動擴散，結果引起線粒體膜電位的改變，去極化，細胞色素C釋放入胞漿，繼而引起與細胞凋亡有關的一系列蛋白酶（Caspases）的活化，最終導致細胞的凋亡。

參考文獻

1王珍，劉仁剛，周潔萍，等地塞米松誘導培養的大鼠大腦皮質星型膠質細胞凋亡.中國組織化學和細胞化學雜志，2002，11（3）：282~285

2Crumrine,R.C.,Thomas,A.L.andMorgan,P.F.Attenuationofp53expressionprotectsagainstfocalischemicdamageintransgenicmice,J.Cereb.BloodFlow.Metab,1994，14：887~891

3Kerr,J.F.,Wyllie,A.H.andCurrie,A.R.Apoptosis:abasicbiologicalphenomenonwithwiderangingimplicationsintissuekinetics,Br.J.Cancer,1972，26：239~257

4Leist,M.andNicotera,P.Apoptosis,excitotoxicity,andneuropathology,Exp.CellRes,1998，239：183~201

5Raff,M.C.,Barres,B.A.,Burne,J.F,etal.Programmedcelldeathandthecontrolofcellsurvival:lessonsfromthenervoussystem,Science,1993，262：695~700

6Thompson,C.B.Apoptosisinthepathogenesisandtreatmentofdisease,Science,1995,267:1456~1462

7Hughes,P.E.,Alexi,T.Yoshida,T,etal.Excitotoxiclesionofratbainwithquinolinicacidinducesexpressionofp53messengerRNAandproteinandP5induciblegenesBaxandGadd45inbrainareasshowingDNAfragmentation,Neuroscience,1996,74:1143~1160

8Xiang,H.,Kinoshita,Y.,Knudson,C.M.,etal.Baxinvolvementinp53mediatedneuronalcelldeath,J.Neurosci,1998,18:1363~1373

9White,F.A.,KellerPeck,C.R.,Knudson,C.M.,WidespreadeliminationofnaturallyoccurringneuronaldeathinBaxdeficientmice,J.Neurosci,1998,18:1428~1439

10Miyashita,T.,Krajewski,S.,Krajewska,M.,Tumorsuppressorp53isaregulatorofbcl2andbaxgeneexpressioninvitroandinvivo,Oncogene,1994,9:1799~1805

11Oltvai,Z.N.,Milliman,C.L.andKorsmeyer,S.J.Bcl2heterodimerizesinvivowithaconeservedhomolog.Bax,thatacceleratesprogrammedcelldeath,Cell,1993,74:609~619

12S.P.Cardenas,C.Parra.Corticosteronedifferentiallyregulatesbax,bcl2andbclxmRNAlevelsintherathippocampusNeuroscienceLetters,2002,331:9~12

13L.E.Haynes.GriffithsDexamethasoneinducedlimitedapoptosisandextensivesublethaldamagetospecificsubregionsofthestriatumandhippocampus:implicationsformooddisorders.Neuroscience,2001,104:57~69

14KarineAndreau.InductionofapoptosisbyDexamethasoneintheBcelllineageImmunophamacology,1998,40:67~76

15HughJ.M.Brady,GabrielGilGomezMoleculesinfocusinBax.TheproapoptoticBcl2familymember,BaxTheinternationaljournalofbiochemical&cellbiology,1998,30:647~650