導(dǎo)語(yǔ)：白細(xì)胞抗原鑒定管理論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：用單克隆抗體鑒定白細(xì)胞共同抗原并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行初步分析。方法：用B細(xì)胞株3D5免疫Balb/c小鼠得到單抗5H12，借助間接免疫熒光及流式細(xì)胞儀分析，檢測(cè)5H12抗原在多種白細(xì)胞表面的表達(dá)情況，并從白細(xì)胞膜中提取5H12抗原，通過(guò)增殖試驗(yàn)、聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡對(duì)其特性進(jìn)行初步分析。結(jié)果：5H12抗原表達(dá)于多種白細(xì)胞表面，包括休止T細(xì)胞、休止B細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、體外PHA激活的T細(xì)胞、體外anti-μ激活的B細(xì)胞、也表達(dá)在T細(xì)胞株(Jurkat、Peer)、B細(xì)胞株(3D5、Daudi、CESS、BJAB)、單核細(xì)胞株U937和髓細(xì)胞株K652表面。增殖試驗(yàn)表明，該抗原與相應(yīng)單抗結(jié)合后導(dǎo)致B細(xì)胞活化抑制。對(duì)抗原的初步分析顯示：5H12是一種單鏈蛋白質(zhì)分子，分子量為22kD。結(jié)論：5H12是一種單鏈膜蛋白分子，屬于白細(xì)胞共同抗原，與B細(xì)胞活化有關(guān)。

關(guān)鍵詞白細(xì)胞共同抗原5H12分子量

Identificationofleukocytecommonantigen(LCA)5H12anddiscoveryofitseffectonBcellactivation

WANGYun-Ping,ZHANGShu-Zhen,ZHULi-Ping.

DepartmentofImmunology,BinzhouMedicalCollege,Binzhou256603

AbstractObjective:Toidentifyleukocytecommonantigen(LCA)withmonoclonalantibody(McAb)andanalyzetheLCA.Methods:ImmunizedBalb/cmicewithBcellline3D5andobtainedMcAb5H12，thendetectedtheexpressionof5H12antigenonvariouskindsofleukocytesandwhitecelllinesbyindirectimmunofluorescenceandflowcytometricanalysisandfinallyisolatedandpurified5H12antigenfromcellmembraneandanalyzedthe5H12byproliferationtest,SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)andWestern-blotting.Results:5H12wasexpressedonapanelofhumanleukocytesandwhitecelllinesincludingrestingTcells,restingBcells,monocytes,neutrophils,PHA-activatedTcells,anti-μ-activatedBcells,Tcelllines(Jurkat,Peer),Bcelllines(3D5,Daudi,CESS,BJAB),binationof5H12antigenwith5H12McAbcouldinduceinhibitionofBcellactivationinadose-dependentmannerandthissuggestedthat5H12mightplayaroleintheprocessthatledtoBcellactivationandproliferation.SDS-PAGEandWestern-blottinganalysisindicatedthat5H12isa22kDone-peptide-chainprotein.Conclusion:5H12isaone-peptide-chainmembraneproteinmolecule,itisaLCAandrelatedtocellactivation.

KeywordsLeukocytecommonantigen5H12Molecularweight

白細(xì)胞共同抗原(leukocytecommonantigen,LCA)表達(dá)于多種白細(xì)胞表面，是一大類粘附分子，具有多種功能，與細(xì)胞活動(dòng)密切相關(guān)。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，LCA參與免疫細(xì)胞間的粘附，充當(dāng)協(xié)同刺激分子，與免疫細(xì)胞的識(shí)別活化、增殖分化、發(fā)揮效應(yīng)有密切關(guān)系。LCA表達(dá)缺陷，可導(dǎo)致免疫反應(yīng)異常。由于其作用重要，LCA已受到廣泛重視。本實(shí)驗(yàn)鑒定了一種LCA5H12，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析，為深入研究打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器、材料與試劑541型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Shel-Lab)；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，堿酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，DEAE-SephadexA50，anti-μ，PHA，SDS，過(guò)硫酸銨，HAT，TEMED(均為美國(guó)Sigma)；RPMI1640(美國(guó)GIBCO)；CNBr活化的Sepharose4B(瑞典Pharmacia)；3H-TdR(中國(guó)原子能研究所)；NP-40，PEG(瑞士Fluka)；硝酸纖維素膜(美國(guó)Bio-Rad)；其它均為國(guó)產(chǎn)試劑。各種細(xì)胞株由醫(yī)科院基礎(chǔ)所單抗室提供。

1.2單抗制備用人活化的B細(xì)胞株3D5免疫Balb/c小鼠。在50%PEG(MW：1450)條件下，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞經(jīng)兩步進(jìn)行篩選。先用ELISA法篩選產(chǎn)生高滴度小鼠Ig的陽(yáng)性孔。再用3D5細(xì)胞和人T細(xì)胞株Jurkat作靶細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，然后對(duì)與3D5和Jurkat兩種細(xì)胞均呈陽(yáng)性反應(yīng)孔的細(xì)胞作連續(xù)3次克隆，最后得到雜交瘤細(xì)胞株5H12。接種5H12雜交瘤細(xì)胞于Balb/c小鼠腹腔以制備腹水。單克隆抗體5H12的血清型用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)。

1.3人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)的制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)［1］。

1.4人外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離方法見(jiàn)文獻(xiàn)［1］。

1.5活化T、B細(xì)胞的制備用24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加T細(xì)胞懸液2ml(含2×106個(gè)細(xì)胞)，T細(xì)胞懸液中加PHA至終濃度2μg/ml，B細(xì)胞懸液中加anti-μ至終濃度100μg/ml，5%CO2培養(yǎng)箱孵育72h。

1.6間接免疫熒光試驗(yàn)一抗用5H12單抗腹水。二抗為FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)［2］。

1.7流式細(xì)胞儀分析儀器的工作條件為488nm，每個(gè)樣品均檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)參數(shù)為FALS，L90°LS和LIGFL，用儀器中的計(jì)算機(jī)分析陽(yáng)性細(xì)胞百分率及熒光強(qiáng)度。

1.8T、B細(xì)胞增殖試驗(yàn)96孔尖底培養(yǎng)板，每孔置1×105個(gè)PBMNC，分加PHA(終濃度2μg/ml)，anti-μ(終濃度100μg/ml)和/或5H12單抗腹水(稀釋度為1∶1000.0、1∶500.0、1∶250.0、1∶125.0、1∶62.5)，對(duì)照用SP2/0腹水，培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育72h，孵育前16h加3H-TdR，用細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，液閃計(jì)數(shù)cpm值，每一條件均設(shè)3個(gè)平行孔。

1.95H12單抗的純化先用硫酸銨分級(jí)沉淀法，后用DEAE-SephadexA50離子交換法得到純化的5H12單抗。

1.10膜蛋白的提取、純化和鑒定按文獻(xiàn)［3］提取3D5細(xì)胞膜蛋白，按文獻(xiàn)［4］用親和層析法從膜蛋白中純化5H12抗原，親和層析柱用的載體為CNBr活化的Sepharose4B，配基為5H12單抗，純化抗原先經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再進(jìn)行Western印跡分析，印跡分析時(shí)，一抗用1∶200稀釋的5H12單抗腹水，對(duì)照為CD8單抗腹水，二抗為1∶3000稀釋的堿酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG［5］。

2結(jié)果

2.1雜交瘤的篩選與克隆用3D5和Jurkat作靶細(xì)胞，用間接免疫熒光染色法對(duì)產(chǎn)生較多小鼠IgG的雜交瘤進(jìn)行篩選。取兩種細(xì)胞同時(shí)染色(5H12)的細(xì)胞，用有限稀釋法經(jīng)連續(xù)3次克隆，得5H12雜交瘤。把5H12雜交瘤注射入Balb/c小鼠腹腔制備5H12單抗腹水。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)表明5H12單抗為IgG2b。

2.25H12抗原的表達(dá)間接免疫熒光染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析可見(jiàn)休止T細(xì)胞、休止B細(xì)胞、單核細(xì)胞均明顯表達(dá)5H12抗原，而中性粒細(xì)胞弱表達(dá)，紅細(xì)胞不表達(dá)，B細(xì)胞經(jīng)anti-μ激活后及T細(xì)胞經(jīng)PHA激活后，細(xì)胞表面仍表達(dá)5H12抗原。各種細(xì)胞株包括T細(xì)胞株(Jurkat,Peer)、B細(xì)胞株(3D5、Daudi、CESS、BJAB)、單核細(xì)胞株U937和髓樣細(xì)胞株K562均表達(dá)5H12抗原。上述結(jié)果說(shuō)明5H12抗原表達(dá)于多種白細(xì)胞表面，屬白細(xì)胞共同抗原。

2.35H12抗原對(duì)人B細(xì)胞增殖的影響功能試驗(yàn)表明5H12單抗能夠抑制anti-μ誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖。

表15H12單抗抑制anti-μ誘導(dǎo)的PBMNCs的3H-TdR摻入

Tab.1Inhibitionof3H-TdRuptakeofanti-μ-inducedPBMNCsbymonoclonalantibody5H12

3H-TdRuptake(cpm)

—1∶1000.01∶500.01∶250.01∶125.01∶62.5

—1)—5H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/0

EXP1.1501324118753631131729921114243689425037432041

±243±616±92±183±67±352±165±203±112±442±83±428

EXP2.116528232155267118852858184929721358278913102453

±167±403±391±264±442±50±379±361±110±67±327±537

EXP3.164934112570332223513508221043431748450714562928

±400±386±90±274±86±238±594±404±245±223±251±92

EXP4.1266249750344174103647546353965830927482968

±461±1333±318±2029±74±111±91±1106±135±1182±338±702

Note：1×105PBMNCsin0.2mlof10%FCSRPMI1640wereincubatedatthepresenceof100μg/mlofanti-μfor72h，variousconcentrationsofMcAb5H12orSP2/0wereappliedtothecellcultureatthe0h;1)Withoutanti-μ，EXP：experiment

anti-μ為B細(xì)胞絲裂原，對(duì)T細(xì)胞無(wú)作用，因此用anti-μ刺激PBMNC就是刺激B細(xì)胞增殖。4次實(shí)驗(yàn)表明，anti-μ誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖均受到5H12單抗的抑制，此抑制作用隨5H12單抗?jié)舛鹊纳叨鰪?qiáng)，但抑制作用因個(gè)體而異。對(duì)照SP2/0腹水則無(wú)此作用(表1)。5H12單抗對(duì)PHA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖無(wú)影響，也不能誘導(dǎo)人PBMNC增殖。

2.45H12抗原的鑒定純化的5H12抗原在還原和非還原條件下經(jīng)SDS-PAGE，均只顯示一條帶，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得其分子量為22kD。Western印跡分析證明這條22kD的蛋白帶就是5H12抗原。

3討論

LCA表達(dá)于多種白細(xì)胞表面，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮生理功能具有重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)LCA60余種，作用極為廣泛，有些LCA的作用已經(jīng)清楚，而有些尚需探討。本實(shí)驗(yàn)中，我們用制備的單抗鑒定了一種LCA5H12，具有調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化的作用。5H12的分子量與已知的LCACD81分子量相同，均為22kD。CD81主要表達(dá)在B細(xì)胞表面，也表達(dá)在單核細(xì)胞及T細(xì)胞表面，屬白細(xì)胞分化抗原4次跨膜分子家族(TM-4)成員，具有離子通道作用，但CD81為增殖性抗體的靶抗原，而實(shí)驗(yàn)中的5H12為抑制性抗體的靶抗原(對(duì)B細(xì)胞而言)。因此兩者分子量雖然相同，但作用不同。但5H12與CD81的區(qū)別尚有待于對(duì)多肽鏈的進(jìn)一步分析，包括氨基酸的組成、排列、二硫鍵的數(shù)目與位置以及羧基端與氨基端的氨基酸種類。至于T、B細(xì)胞5H12抗原與相應(yīng)單抗結(jié)合后表現(xiàn)出不同效應(yīng)、可能涉及多種因素，如T、B細(xì)胞活化的途徑不同，表面抗原分布不同，受體與配體親和力不同，活化途徑不同，細(xì)胞基因功能活動(dòng)情況不同等。但只有對(duì)5H12抗原進(jìn)行深入的分子生物學(xué)研究，才能完整揭示其生理和病理功能。

張淑珍朱立平中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100730

作者簡(jiǎn)介：王運(yùn)平，男，34歲，碩士，講師，主要從事BRM的研究；

朱立平，男，59歲，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)研究

作者單位：（山東濱州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，濱州256603)

4參考文獻(xiàn)

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3HarlowE,LaneD.Antibodies：Alaboratorymanual.NewYork:Coldspringharborlaboratory,1988:446-450

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5HarlowE,LaneD.Antibodies：Alaboratorymanual.NewYork:Coldspringharborlaboratory,1988:473-506