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摘要目的：探討水楊酸(SA)與載體蛋白間連接橋的改變對(duì)識(shí)別SA抗體的產(chǎn)生及SAELISA靈敏度的影響。方法：將SA、4-氨基水楊酸、5-氨基水楊酸分別用不同的方法與載體蛋白相偶聯(lián)，從而在SA苯環(huán)的C4、C5兩個(gè)不同位點(diǎn)合成了3種免疫原：SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)和SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)及4種包被物：SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA。免疫新西蘭白兔制備抗體，用ELISA法檢測(cè)。結(jié)果：獲得針對(duì)A和C的兩種多克隆抗體，后一種能專(zhuān)一識(shí)別游離態(tài)水楊酸，改變包被物中連接橋的結(jié)構(gòu)可提高SAELISA的檢測(cè)靈敏度，故選用SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA建立了SAELISA。結(jié)論：SA與載體蛋白間連接橋的改變對(duì)識(shí)別SA抗體的產(chǎn)生和SAELISA的靈敏度有很大影響。

關(guān)鍵詞水楊酸半抗原載體連接橋多克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)法

Effectofchangingconjugationbridgebetweenhaptenandcarrierproteinonthesensitivityofsalicylateelisa

WANGShu-Cai,ZHOUXie.

DepartmentofAgronomy,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095

AbstractObjective：TostudytheeffectofchangingconjugationbridgebetweenhaptenandcarrierproteinontheraisingofantibodiesagainstsalicylicacidandthesensitivityofsalicylateELISA.Methods:Threekindsofsalicylicacid(SA)immunogens:SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)andSA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)andfourkindsofSAcoatingconjugates:SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVAandSA(C5)-NH-CH2-NH-OVAweresynthesizedbylinkingSA、4-aminosalicylicacidand5-aminosalicylicacidrespectivelytobovineserumalbumin(BSA)andovalbumin(OVA)throughdifferentconjugationmethods.RaisingofantibodiesinrabbitsandeffectofchangingconjugationbridgeonthesensitivityofsaliaylateELISAweredetectedbyELISA.Results:TwokindsofpolyclonalantibodieswereraisedinrabbitsagainstimmunogensAandCrespectively.TheantibodiesagainstimmunogenCpossessedahighspecificity.UsingtheseantibodiesandchoosingSA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVAasacoatingconjugate,akindofELISAwasdevelopedwhichdisplayedalinearityrangefrom0.064to200.000nmolofSA.Conclusion:ConjngationbridgechanginghasagreateffectontheraisingofantibodiesagainstsalicylicacidandthesensitivityofsalicylateELISA.

KeywordsSalicylicacidConjugationbridagePolyclonalantibodiesELISA

定量檢測(cè)半抗原的ELISA在植物學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用［1］，但其建立比較困難，因?yàn)榘肟乖c載體蛋白相偶聯(lián)的人工免疫原所誘導(dǎo)產(chǎn)生的往往是特異性不同的抗體群，制備單克隆抗體時(shí)，可以通過(guò)篩選得到專(zhuān)一識(shí)別半抗原的抗體［2］，而基于多克隆抗體的ELISA往往因多種抗體并存，非特異結(jié)合率較高。通過(guò)改變包被物中載體蛋白種類(lèi)可以提高檢測(cè)靈敏度［3］，但反應(yīng)體系中仍存在識(shí)別連接橋抗體的干擾。能否通過(guò)改變連接橋的結(jié)構(gòu)以消除或減少這一類(lèi)干擾呢?作者對(duì)此進(jìn)行了探索。

1材料與方法

1.1化學(xué)試劑4-氨基水楊酸(p-aminosalicylicac-id,p-ASA)、4-氨基馬尿酸(p-aminohippuricacid,p-AHA)、碳化二亞胺(EDC)、5-氨基水楊酸(5-aminosalicylicacid,5-ASA)購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)購(gòu)自上海生化試劑采購(gòu)站；福氏不完全佐劑自制；其它試劑均為分析純。

1.2免疫原的合成

1.2.1SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)的合成通過(guò)重氮化氨基馬尿酸法［4］。

1.2.2SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)的合成按Bennett的方法［5］。

1.2.3SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)的合成用Mannich反應(yīng)［4］：100mgBSA溶于2ml蒸餾水，加入3mol/L乙酸鈉0.67ml,7.5%(W/V)甲醛1.2ml，最后加入5-ASA溶液(50mg溶于2.5ml1mol/LNaOH)，調(diào)節(jié)pH至8.5，室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)物裝入透析袋，4℃下先對(duì)0.1mol/LNaHCO3，后對(duì)蒸餾水充分透析，冷凍保存。

1.3包被物的合成

1.3.1SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA的合成合成程序與A相同，僅以O(shè)VA代替BSA。

1.3.2SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA和SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA的合成合成程序與B的相同，以O(shè)VA代替BSA合成SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。同時(shí)以5-ASA與OVA偶聯(lián)合成SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。

1.3.3SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA的合成合成方法與C的相同，僅以O(shè)VA代替BSA。

1.4抗血清的制備和純化參照Weiler的方法，每種免疫原免疫3只新西蘭白兔［6］。第4(或5)次免疫后9d行頸動(dòng)脈全放血。血樣置37℃2h后移入4℃冰箱過(guò)夜，4000r/min，離心20min，取上清。用飽和硫酸銨法純化抗血清。

1.5SAELISA操作程序非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA程序參見(jiàn)Zheng等，用于抗體的產(chǎn)生和效價(jià)的檢測(cè)［7］。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA程序參見(jiàn)張能剛等，用于SA對(duì)抗體與包被物結(jié)合的抑制率及抗體對(duì)SA類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率的測(cè)定［8］。

2結(jié)果

2.1抗體的產(chǎn)生4次免疫后，用連接橋相同的包被物的非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)免疫原A和C誘導(dǎo)產(chǎn)生了高效價(jià)的抗體即PAbs(A)和PAbs(C)，其最高效價(jià)分別為12800和25600(以O(shè)D值為1.0時(shí)的抗血清稀釋倍數(shù)表示)。而以戊二醛法合成的免疫原B，經(jīng)5次免疫也未能檢測(cè)到抗體的產(chǎn)生。

2.2連接橋不同的免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對(duì)SA的特異性競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)表明，PAbs(A)對(duì)SA的識(shí)別能力較低(基于連接橋相同的包被物，SA濃度高達(dá)400nmol/50μl時(shí)，其抑制率僅為31.05%)，而PAbs(C)在用同型連接橋的包被物時(shí)已表現(xiàn)出對(duì)SA較高識(shí)別力，而改用異型連接橋的包被物，其抑制率又有明顯提高(表1)。

在繼續(xù)使用異型連接橋包被物的條件下，我們檢測(cè)了PAbs(C)對(duì)13種SA類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率，結(jié)果表明：PAbs(C)除對(duì)5-ASA的交叉反應(yīng)率高達(dá)141.2%、對(duì)5-磺基水楊酸和4-氨基水楊酸的交叉反應(yīng)率也較高，分別為15.9%和3.7%，對(duì)乙酰水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、N-苯基鄰氨基苯甲酸、3，5-二硝基水楊酸、苯羥乙酸、水楊醛肟、2，4-二硝基酚、水楊酸鈉和2，4-二氯酚10種類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率均不高于2.1%，甚至表現(xiàn)為不識(shí)別，表明PAbs(C)對(duì)SA具有相當(dāng)高的特異性。

2.3SAELISA的建立基于上述結(jié)果，以PAbs(C)為第一抗體，SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA為包被物建立了SAELISA，其靈敏度為0.030nmol，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為0.064～200.000nmol。

表1包被物連接橋結(jié)構(gòu)的改變對(duì)PAbs(C)與SA特異結(jié)合的影響

Tab.1EffectsofchangingbridgeofcoatingconjugateonthebindingspecificityofSAtoPAbs(C)

CoatingconjugateInhibitoryrate(1-B/B0,%)

SA(nmol/50μl)0.1280.6403.20016.00080.000400.000

SA-NH-CH2-NH-OVA6.7810.1717.8024.5848.3180.34

SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA2.136.9424.3539.8164.5292.56

Note:B.bindingoftracertoantibodyinthepresenceofSA;B0.bindingoftracertoantibodyintheabsenceofSA

3討論

3.1半抗原的偶聯(lián)位點(diǎn)以及和載體之間連接橋的結(jié)構(gòu)對(duì)產(chǎn)生抗體的影響SA的分子量?jī)H138.1，與載體偶聯(lián)后才能具備免疫原性。作者在SA苯環(huán)的C4和C5位分別偶聯(lián)載體蛋白合成了3種結(jié)構(gòu)不同的免疫原。結(jié)果C4位偶聯(lián)合成的免疫原未能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，而B(niǎo)ennett等用同樣方法將SA與KLH偶聯(lián)卻制成了識(shí)別SA的羊抗體(但未見(jiàn)其建立ELISA的報(bào)道)［5］，這可能與KLH異源性比BSA強(qiáng)和不同物種的免疫應(yīng)答不同有關(guān)。C5位偶聯(lián)合成的免疫原C和A都誘導(dǎo)產(chǎn)生了高效價(jià)的抗體，而前一種能較強(qiáng)地識(shí)別SA。提示偶聯(lián)位點(diǎn)及連接橋的結(jié)構(gòu)對(duì)特異性抗體的產(chǎn)生有很大的影響。同時(shí)前一種抗體對(duì)SA類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率較低，從而可以排除樣品中SA衍生物的干擾，確保ELISA的可靠性。

3.2包被物中連接橋結(jié)構(gòu)的改變對(duì)SAELISA靈敏度的影響改變包被物中的蛋白種類(lèi)可以消除識(shí)別載體蛋白抗體的干擾，部分地提高了ELISA的靈敏度，但反應(yīng)體系中仍存在識(shí)別連接橋抗體的干擾，使抗體與包被物的非特異結(jié)合偏高。因此，作者在建立SAELISA時(shí)，針對(duì)免疫原C誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，不僅通過(guò)改變載體蛋白的種類(lèi)(OVA代替BSA)，而且嘗試改變連接橋的結(jié)構(gòu)即-N=CH-(CH2)3-CH=N-代替-NH-CH2-NH-來(lái)合成包被物，使SA對(duì)抗體與包被物結(jié)合的抑制率明顯提高(表1)，從而提高了SAELISA的靈敏度。

同樣，在檢測(cè)吲哚乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)等的固相抗原型ELISA中也存在著非特異結(jié)合率偏高的問(wèn)題，是否也可通過(guò)改變連接橋的結(jié)構(gòu)來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度呢?有待進(jìn)一步探索。

作者簡(jiǎn)介：王樹(shù)才，男，30歲，碩士；

指導(dǎo)教師，周燮，男，教授,博士生導(dǎo)師，主要從事植物激素及其免疫檢測(cè)技術(shù)的研究作者單位：(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)系，南京210095)

4參考文獻(xiàn)

1CarusoJL,PenceVC,LeslieA.Immunoassaymethodsofplanthormoneanalysis.In:herland:KluwerAcademicPublisher,1995:433-447

2ZhengZF,ZhouX,ChenJG.PreparationofmonoclonalantibodiesspecificformethylestersofgibberellinsA7andA4.ChineseJournalofBiotechnology,1996;11(4):221

3陳金桂，周燮.在吲哚乙酸不同位點(diǎn)偶聯(lián)載體蛋白對(duì)其抗體特異性的影響.生物技術(shù)，1996；6(6)：21

4RobinsRJ.Themeasurementoflow-molecular-weight,non-immunogeniccompoundsbyimmunoassay.In:LinskensHF,JacksonJFeds.ImmunologyinPlantSciences.Germany:Springer-verlag,1986:86-144

5BennettAP,GallacherG,LandonJ.Theraisingandcharacterisationofantibodiestosalicylate.AnnCliBiochem,1987;24:374

6WeilerEW.Planthormoneimmunoassaybasedonmonoclonalandpolyclonalantibodies.In:LinskensHFandJacksonJFeds.ImmunologyinPlantSciences.Germany:Springer-verlag,1986:1-17

7ZhengZF,ZhouX.Amonoclonalantibodyrecognizingnon-derivative13-hydroxygibberellinsandtheirglucosides.ActaBotanicaSinica,1995;37(10):761

8張能剛，周燮，吳頌如.吲哚乙酸間接酶聯(lián)免疫法的建立.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990；13(1)：116