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【摘要】目的：構建人顆粒溶素(Granulysin,GNLY)基因的表達載體并在大腸桿菌中表達。方法：抽提體外培養的單個核細胞總RNA，通過RTPCR的方法獲得含有222bp的顆粒溶素cDNA,克隆到pMD18T載體，測序正確后再亞克隆到質粒pET28a(+)中，構建重組表達質粒pET28a(+)GNLY，在大腸桿菌中誘導表達并經Ni親和層析純化。用SDSPAGE和Westernblot對表達產物進行鑒定。采用MTT法檢測GNLY融合蛋白的生物學活性。結果：酶切結果證實，成功地構建了GNLY原核表達載體，并在大腸桿菌中獲得穩定的表達，表達產物的相對分子質量(Mr)同預期值相一致。結論：成功構建了重組表達質粒pET28a(+)GNLY，并在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中表達，獲得了具有良好的抗原性和特異性的GNLY融合蛋白，為下一步研究人GNLY的功能奠定了基礎。

【關鍵詞】顆粒溶素原核表達重組蛋白

Constructionofrecombinantexpressionvectorofgranulysingeneanditsprokaryoticexpression

QIANCheng,CHENSunXiao,KEJinShan,ZHOUYe,CHENYan,GUMingLi,LUHuiQi,DENGAnMei,ZHONGRenQian.

LaboratoryDiagnostics,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,andClinicalImmunologyCenterofPLA,Shanghai200003,China

［Abstract］Objective:ToconstructarecombinantexpressionvectorofhumangranulysingeneandtoexpressitinEcoli．Methods：TotalRNAfromculturedcellsandobtaineda222bpcDNAsegmentwithgranulysinspecificprimersbyRTPCRwereextracted.ThenthecDNAsegmentofgranulysinwasinsertedintopET28a(+)plasmid.Expressionoftherecombinantproteinwasinduced,whichwaspurifiedbyNiNTAaffinitychromatographyandapprovedbySDSPAGEandWesternblot.ThebioactivityofgranulysinfusionproteinwasmeasuredbyMTTassay.Results:RestrictionenzymedigestionshowedthattherecombinantprokaryoticexpressionplasmidpET28a(+)GNLYwasconstructedandexpressedinEcoil．Therelativemolecularmass(Mr)oftheexpressionproductwasidenticalwiththepredictedvalue．Conclusion：TherecombinantexpressionplasmidpET28a(+)GNLYhasbeenconstructedsuccessfullyinEcoilBL21(DE3)plysSandthetargetproteinareexpressedwithafineantigenicity，whichishelpfulforthefurtherstudyofthebiologicalfunctionofgranulysin．

［Keywords］Granulysin;Prokaryoticexpression;Recombinantprotein

人顆粒溶素(Granulysin,GNLY)是由激活的T淋巴細胞和NK細胞表達的一種溶細胞蛋白，對細菌、真菌、寄生蟲均具有殺傷功能，同時對哺乳動物細胞也有一定的毒性作用[1,2]。它屬于脂類結合蛋白皂角素(Saposin)樣蛋白家族的成員之一，與穿孔素、顆粒酶共存于CTL和NK細胞毒性顆粒中，最初由Jongstra等[3]學者在系統研究功能性細胞毒性細胞系的cDNA時發現，稱為519。1997年，Pena等[1]學者將其命名為顆粒溶素（Granulysin）。在機體免疫應答過程中，GNLY與穿孔素、顆粒酶顆粒分子從細胞毒性顆粒中一起排出體外，參與抗菌、抗病毒和殺傷腫瘤細胞等過程。近年來，國外對顆粒溶素在殺傷腫瘤細胞及病原微生物各方面的研究越來越引起人們的重視。鑒于GNLY具有廣闊的應用前景，我們構建了GNLY的原核表達載體并在大腸桿菌中誘導其表達，為進一步研究GNLY的功能及應用奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

pET28a(+)vector、BL21(DE3)plysS、DH5α為本科保存株；pMD18Tvector（TaKaRa公司）；限制性內切酶NdeI、EcoRI、DNA膠回收試劑盒及T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；RNeasyMiniKit(QIAGEN);TaqmanReverseTranscriptionRegents(AppliedBiosystem)；羊抗兔IgG抗體（KPL公司提供）；兔抗6His多抗（NOVUS公司）；HisBindResin（Novagen）。引物的設計與合成：根據檢索NCBI數據庫提供的GNLY基因的cDNA編碼序列（gi:49456672）進行了PCR引物設計。設計擴增3′引入終止密碼子（TGA）的GNLY9kD蛋白對應編碼區的一對引物。其序列為：上游引物：5′CATATGGGCCGTGACTACAGGACC3′，5′引入NdeI酶切位點；下游引物：5′GAATTCTCACCTGAGGTCCTCACAG3′，5′引入EcoRI酶切位點。

1.2方法

1.2.1人外周血單個核細胞的分離及體外培養

抽取正常人靜脈抗凝血5ml，用淋巴細胞分離液按常規操作方法分離單個核細胞。用含5%胎牛血清（FCS），5%人自體血清的RPMI1640培養基培養調整細胞濃度為1×106～2×106ml-1，于24孔細胞培養板中每孔加入1ml。加入卡介苗5μg和rIL250U用于誘導γδT細胞，根據細胞增殖情況適時擴孔培養，同時每隔3～4天補充rIL250U/孔，以維持細胞生長需要。收集細胞（約106數量級），用冷的無菌的1×PBS(pH7.4)洗滌后，即可用于抽提總RNA。

1.2.2目的基因的擴增與純化

按說明書操作，抽提培養12天的細胞總RNA。RTPCR反應條件為42℃45分鐘，94℃3分鐘，94℃預變性3分鐘，以94℃變性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸59秒,35個循環后，再于72℃延伸7分鐘。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，將目的條帶切下，用DNA回收試劑盒回收純化。

1.2.3重組質粒pET28a(+)GNLY的構建與鑒定

將純化的PCR產物和載體pET28a(+)vector用NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，分別回收酶切產物。在T4DNA連接酶作用下定向將GNLY基因片段與pET28a(+)vector連接，以連接產物轉化入DH5α感受態細菌，在LB(Kana+)培養基中篩選培養,挑取陽性克隆，培養后小樣提取質粒，用NdeI、EcoRI雙酶切篩選陽性重組質粒，送聯合基因公司測序。

1.2.4重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達及鑒定

1.2.4.1重組質粒的誘導表達及SDSPAGE分析

將鑒定成功的重組質粒DNA轉化感受態細菌E.coliBL21(DE3)plysS，在LB(Kana+)培養基中篩選培養。挑取陽性克隆，用NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，將含有重組質粒的E.coliBL21(DE3)plysS在LB(Kana+)中培養過夜。以1％接種于LB(Kana+)培養液中。于37℃培養至A600約為0.6時，加入1mmol/LIPTG繼續培養4小時，經超聲碎菌后，提取融合蛋白，利用Hisbindresin親和層析純化柱進行純化。將純化蛋白進行SDSPAGE分析后，用考馬斯亮藍R250染色后觀察結果。另外，取誘導前和誘導后1、2、3、4、5、6小時過夜的裂解菌液及超聲裂解菌離心后的上清和沉淀，分別進行SDSPAGE，分析目的蛋白的表達與誘導時間的關系，以及目的蛋白的表達形式。

1.2.4.2Westernblot分析

將表達產物經SDSPAGE電泳后，電轉移至硝酸纖維素膜上，用封閉液(含50g/L脫脂奶粉的TBST)室溫振搖封閉2小時。依次加入兔抗HIS抗體及HRP標記羊抗兔IgG，二氨基聯苯氨(DAB)底物液顯色后，觀察結果。

1.2.5MTT法檢測蛋白生物活性

胰蛋白酶消化收集人胰腺癌細胞株SW1990細胞，用RPMI1640培養液配制細胞懸液，根據初篩結果，確定每孔接種的細胞數為2×104/孔，接種于96孔培養板，37℃、5%CO2孵箱中培養24小時貼壁。將GNLY用RPMI1640完全培養基稀釋至實驗所需濃度：0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L共9個不同濃度。每板均設有純培養基空白對照組、癌細胞對照組及實驗組(不同濃度GNLY)，每組5復孔。于接種細胞24小時后棄去舊培養基，加入含不同濃度GNLY的完全培養基200μl繼續培養24小時，換新鮮1640完全培養基后MTT法測OD值計算相對抑制率。按如下公式計算細胞相對抑制率：

相對抑制率（%）=對照組OD值-實驗組OD值對照組OD值×100%。

2結果

2.1重組質粒的構建與鑒定

將重組質粒pET28a(+)GNLY用NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分別在5.4kb和222bp處有兩條清晰的條帶，表明目的基因已正確插入pET28a(+)載體中（圖1）。陽性重組質粒測序結果與GenBank人GNLY基因序列完全一致。

2.2融合蛋白的表達與鑒定

以重組質粒轉化感受態E.coliBL21(DE3)plysS，挑取陽性克隆后進行酶切鑒定。將經IPTG誘導表達的產物純化后，用SDSPAGE分析。結果表明，在分子量Mr為9000處有一條明顯的條帶，同預期的目的條帶相符。表達時間分析結果顯示，目的蛋白在誘導4～5小時表達量即達到最大，時間再延長，蛋白表達量無明顯變化，誘導過夜，蛋白表達量反而降低（圖2）。表達形式分析表明，目的蛋白大多以包涵體形式存在，少量以可溶形式存在于胞質中（圖3）。將純化的融合蛋白經SDSPAGE分析后電轉移至硝酸纖維膜上，Westernblot結果顯示，在Mr為9000處有一條明顯的條帶，說明目的蛋白具有良好的抗原性和特異性（圖4）。

2.3目的蛋白的活性鑒定

用MTT法檢測不同濃度GNLY對SW1990細胞生長抑制作用，結果顯示細胞的生長受到抑制且抑制作用呈濃度依賴關系（表1），說明GNLY的細胞毒作用具有劑量依賴性。表1MTT法測定不同濃度GNLY對人胰腺癌SW1990細胞的相對抑制率(略)

3討論

人顆粒溶素是存在于CTL和NK細胞毒性顆粒中的溶細胞蛋白,具有廣譜抗菌活性并且能夠誘導腫瘤細胞的凋亡[1,2]。GNLY不僅可以直接殺傷胞外結核桿菌，而且在穿孔素的協同作用下也可殺傷胞內結核桿菌[4]。TakamoriY等[5]研究顯示顆粒溶素進入靶細胞核后在核內聚集，誘導靶細胞凋亡。近幾年，國外學者研究證實了顆粒溶素在機體宿主免疫防御中起重要作用。Stegelmann等[6]研究CD8+Tcells中顆粒溶素與趨化因子配體5(CCL5)和穿孔素協同表達。在CCL5吸引含結核感染的巨噬細胞后，顆粒溶素和穿孔素發揮殺傷細胞內病原菌的功能。Takemoto等[7]發現顆粒溶素不僅在宿主免疫防御中起重要作用，而且在亞急性硬化性全腦炎的發病機理和病理生理學中也起作用。GNLY在抗菌、抗病毒和殺傷腫瘤細胞中的重要作用，近年來在國內外已經逐漸形成一個研究熱點。

在本實驗中，我們克隆的cDNA全長222bp，為活性GNLY9kD氨基酸對應的基因序列。相關文獻報道，GNLY在結核桿菌刺激的T細胞中有高表達[8]，因此我們經過體外培養，從活化的富含γδT細胞的殺傷細胞中提取GNLY的mRNA，用此為模板克隆GNLY基因的開放閱讀框的(ORF)中的目的基因序列，按正確讀碼框插入到pET-28a(+)原核表達載體中，構建了pET28a(+)-GNLY表達載體。由于GNLY本身對大腸桿菌具有一定的毒性，因此我們用不含T7RNA聚合酶的宿主菌BL21（DE3）pLysS克隆目的基因，這樣就避免了由于GNLY對宿主細胞的毒性而造成的質粒不穩定。在E.coli中表達的重組蛋白經常以聚集的形式表達（包涵體），但還是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET系統的高表達水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵體，也會有一部分可溶性目的蛋白存在。為了得到具有生物活性的GNLY，本實驗采用非變性條件純化目的蛋白。從Westernblot檢測結果來看，GNLY融合蛋白具有良好的免疫反應性，N端增加的6個組氨酸并不影響重組蛋白的抗原性。我們最終得到了具有生物學活性的GNLY融合蛋白，為研究GNLY蛋白的功能及進一步應用于臨床疾病診斷及實時監測奠定了基礎。

【參考文獻】

1PenaSV,KrenskyAM.Granulysin,anewhumancytolyticgranuleassociatedproteinwithpossibleinvolvementincellmediatedcytotoxicity\[J\].SeminImmunol,1997;9:117125.

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3JongstraJ,SchallTJ,DyerBJetal.TheisolationandsequenceofanovelgenefromahumanfunctionalTcellline\[J\].ExpMed,1987;165:601614.

4StengerS,HansonDA,TeitelbaumRetal.AnantimicrobialactivityofcytolyticTcellsmediatedbygranulysin\[J\].Science,1998;282(5386):121125.

5TakamoriY,OgawaK,NagataKetal.Granulysininducescelldeathwithnuclearaccumulation\[J\].JMedDentSci,2005;52(1):17.

6StegelmannF,BastianM,SwobodaKetal.CoordinateexpressionofCCchemokineligand5,granulysin,andperforininCD8+TcellsprovidesahostdefensemechanismagainstMycobacteriumtuberculosis\[J\].JImmunol,2005;175(11):74747483.

7TakemotoM,KiraR,KusuharaKetal.Geneexpressionprofilesinperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithsubacutesclerosingpanencephalitisusingoligonucleotidemicroarrays\[J\].JNeurovirol,2005;11(3):299305.

8ToossiZ,MayanjaKizzaH,KanostAetal.Protectiveresponsesintuberculosis:inductionofgenesforinterferonγandcytotoxicitybymycobacteriumtuberculosisandduringhumantuberculosis\[J\].ScandJImmun,2004;60(3):299306.