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摘要：分子印跡技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、生物芯片技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)是4種常用的非生物學(xué)藥物篩選技術(shù)。文章簡(jiǎn)要介紹了每項(xiàng)技術(shù)的概念、原理和應(yīng)用，以期使其更廣泛地應(yīng)用于抗病毒等篩選難度大的藥物篩選領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：藥物篩選;分子印跡技術(shù);高通量篩選技術(shù);生物芯片技術(shù);生物信息學(xué)技術(shù)

藥物篩選是應(yīng)用適當(dāng)?shù)?a href="http://www.uv63h8.cn/lunwen/jiaoyue/yixue/201105/435701.html" target="_blank">方法和技術(shù)根據(jù)特定的目的對(duì)藥物進(jìn)行優(yōu)選的過(guò)程。藥物的種類(lèi)很多，從大量的藥物中找出對(duì)特定疾病有針對(duì)性治療作用的藥物是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。傳統(tǒng)的藥物篩選一般是采用生物學(xué)方法，也就是將藥物與相應(yīng)的病原作用，能夠有效抑制病原生長(zhǎng)或?qū)σ延胁≡袣缱饔玫募礊橛行幬铩Ｈ欢鴮?duì)于由病毒或細(xì)菌引起的具有強(qiáng)傳染性的疾病此種方法是一項(xiàng)既繁瑣，危險(xiǎn)性大又對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求極高的工作。因此，應(yīng)建立非生物學(xué)方法來(lái)替代傳統(tǒng)生物學(xué)方法。所謂的非生物學(xué)藥物篩選方法即在不接觸傳染性病原的情況下進(jìn)行藥物篩選。篩選的方法可以是間接的篩選藥物，如分子印跡法、生物信息學(xué)法;也可以是獲得病原的相應(yīng)結(jié)合靶點(diǎn)來(lái)選取有效藥物，如高通量篩選技術(shù)和生物芯片技術(shù)。本文將對(duì)非生物學(xué)藥物篩選方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述[1]。

1分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)也叫分子烙印技術(shù)或分子模板技術(shù)(molecularimprintingtechnique,MIT)，是一種模擬抗原與抗體相互作用的人工生物模板技術(shù)。分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，MIPs)也就是由分子印跡技術(shù)制備出來(lái)的，具有高效、穩(wěn)定、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。在對(duì)映體和異構(gòu)體的分離[2，3]、固相萃取[4，5]、緩控釋給藥系統(tǒng)[6]、臨床藥物分析、膜分離技術(shù)[7]、模擬酶催化[8]、化學(xué)仿生傳感器[9]等領(lǐng)域中MIPs都展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。MIPs的制備過(guò)程為：①在溶劑(致孔劑)中將模板分子和功能單體按照一定比例混合后一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵作用形成可逆的模板分子-功能單體復(fù)合物;②加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑，使模板-功能單體復(fù)合物通過(guò)聚合反應(yīng)在模板分子周?chē)纬筛呓宦?lián)的剛性聚合物;③將模板分子(印跡分子)從聚合物中洗脫解離出來(lái)，這樣在聚合物的骨架上便留下了一個(gè)對(duì)模板分子有“預(yù)定”選擇性的識(shí)別空位。空位中含有精確排列的與模板分子官能團(tuán)相互補(bǔ)的由功能單體提供的功能基團(tuán)[10]。分子印跡聚合物中的空位和模板分子形狀、大小完全一樣,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)模板分子的特異性識(shí)別。印跡聚合過(guò)程如圖1所示[11]。MIT具有分子識(shí)別性強(qiáng)、固定相制備簡(jiǎn)便快速、操作簡(jiǎn)單、性質(zhì)比較穩(wěn)定(耐酸堿、耐高溫、高壓等)、溶劑消耗量小、模板和MIPs都可以回收再利用等優(yōu)點(diǎn)。

應(yīng)用分子印跡技術(shù)，根據(jù)已篩選出的對(duì)相應(yīng)病原有抑制作用的化合物作為模板建立生物法替代篩選模型。一方面可以避免與病原的直接接觸，增強(qiáng)安全性;二是可以在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件要求低;三是有針對(duì)性的選擇有效藥物成分，縮短了篩選時(shí)間和實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度;四是精確有效篩選。如中草藥含的化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣，含量懸殊且許多成分是未知的，因此從中分離純化有效成分是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，而且容易丟失微量的有效成分。為了盡快從中草藥中尋找出高效的實(shí)體藥物及各配方的有效成分，以及將中藥推向國(guó)際市場(chǎng)并從中發(fā)現(xiàn)療效顯著的符合歐美市場(chǎng)要求的新藥，就可以應(yīng)用分子印跡技術(shù)來(lái)達(dá)到這個(gè)目的。謝建春等[12]以駱駝蓬種籽中抗腫瘤活性化合物哈爾滿(mǎn)作為模板,用非共價(jià)鍵法制備了對(duì)哈爾滿(mǎn)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物哈爾明及哈馬靈具有強(qiáng)親和性的分子印跡聚合物。分離鑒定了駱駝蓬種籽甲醇粗提物中所含的哈爾明及哈馬靈兩種抗腫瘤活性成分。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了通過(guò)分子印跡技術(shù)能夠有效地對(duì)中草藥活性成分進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)還說(shuō)明了通過(guò)分子印跡親和色譜與質(zhì)譜聯(lián)用可以分離鑒定復(fù)雜成分中有效成分。這對(duì)于篩選已知藥物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)疑是種簡(jiǎn)單快速安全的方法。

2高通量藥物篩選技術(shù)

高通量藥物篩選(highthroughputscreening,HTS)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)快速尋找新藥的技術(shù)。篩選的對(duì)象是藥物作用靶點(diǎn)，根據(jù)待選樣品與靶點(diǎn)是否相互作用來(lái)判斷待選化合物的生物活性。高通量藥物篩選技術(shù)涉及自動(dòng)化控制技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和管理技術(shù)以及計(jì)算機(jī)計(jì)算等。隨著各學(xué)科的發(fā)展及相應(yīng)技術(shù)的成熟[13]，高通量藥物篩選技術(shù)憑借其自動(dòng)化操作系統(tǒng)和微量靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)，使其篩選速度快、規(guī)模大、用量小實(shí)現(xiàn)一藥多篩。

高通量篩選的體外模型通常有分子水平模型和細(xì)胞水平的模型，分子水平模型主要分為受體模型、酶篩選模型和離子通道篩選模型。細(xì)胞水平藥物篩選模型是以細(xì)胞功能為基礎(chǔ)的篩選模型。各種模型篩選的原理有3個(gè)方面，一是待選化合物與靶點(diǎn)的作用。多數(shù)情況下藥物與靶點(diǎn)相結(jié)合從而產(chǎn)生治療作用。其作用原理如同受體-配體相互作用。可以與相應(yīng)受體結(jié)合的化合物就有可能是有活性的成分;二是待選化合物對(duì)酶活性的影響。生物體內(nèi)的許多生理生化反應(yīng)都必須有酶的參與，加入待測(cè)化合物的同時(shí)測(cè)定酶的一些指標(biāo)，以指標(biāo)的變化為依據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)化合物的作用。此種模型相對(duì)易于檢測(cè)，被普遍使用;三是待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的作用。通過(guò)化合物的篩選，了解整體細(xì)胞對(duì)化合物作用的反應(yīng)。靶向細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、離子通道和G-蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)在細(xì)胞水平上的功能性檢測(cè)中都取得了成功的進(jìn)展[13]。(i)復(fù)合物化(ii)聚合(iii)去模板分子a.模板分子b.聚合前復(fù)合物c.聚合后復(fù)合物d.模板分子去除后的聚合物圖1分子印跡聚合過(guò)程示意圖據(jù)統(tǒng)計(jì)高通量藥物篩選技術(shù)每天可以對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的樣品化合物進(jìn)行篩選，應(yīng)用得最多的是組合化學(xué)庫(kù)。我國(guó)中藥資源豐富，許多資源尚未開(kāi)發(fā)。有部分中藥及組方治療作用明確，但大部分作用機(jī)理尚不清楚。從而限制了中藥的發(fā)展及國(guó)際化的要求。由于中藥有效成分具有多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，故天然產(chǎn)物庫(kù)的建立將為高通量藥物篩選提供更多更全面的化合物[14，15]，同時(shí)中藥有效成分的作用機(jī)理也會(huì)明確。羅弟祥等[16]用PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酶1B)抑制劑高通量篩選模型對(duì)17940個(gè)植物提取物和其組分進(jìn)行了篩選，陽(yáng)性率為2.85%[17]。另外針對(duì)腫瘤、2型糖尿病[18]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病和感染性疾病等相關(guān)靶點(diǎn)明確的疾病，已經(jīng)逐步建立和完善了以高通量分子篩選模型為初篩的篩選體系。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及基因工程等學(xué)科的發(fā)展，疾病的發(fā)病機(jī)理越來(lái)越明確。特別是對(duì)于一些病毒和病菌，它們的致病靶標(biāo)也越發(fā)的清晰。只要針對(duì)相應(yīng)的靶標(biāo)進(jìn)行篩選，就能夠很快找到相應(yīng)的有效藥物，這樣就可以減少操作的危險(xiǎn)性，避免與相應(yīng)病原直接接觸，同時(shí)也加快了藥物的篩選速度及篩選的精確性[19]。曹鴻鵬等[20]以神經(jīng)氨酸酶(NA)為抗流感藥物的作用靶點(diǎn)建立可用于高通量藥物篩選的模型來(lái)篩選NA抑制劑，初篩發(fā)現(xiàn)12個(gè)化合物對(duì)流感病毒神經(jīng)氨酸酶有可重復(fù)的抑制活性。高通量藥物篩選過(guò)程是從藥物作用靶點(diǎn)水平篩選藥物即只是停留在分子細(xì)胞水平，而藥物的作用多數(shù)是要全面分析。由于藥物經(jīng)過(guò)體內(nèi)循環(huán)代謝到達(dá)靶點(diǎn)時(shí)的濃度及代謝物藥效是有變化的，所以必須在篩選之后進(jìn)行相應(yīng)的組織器官和整體動(dòng)物水平的藥物篩選來(lái)確定藥效。

3生物芯片技術(shù)

生物芯片(biochip)是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品以陣列式有序地固化于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過(guò)特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)分析來(lái)判斷樣品中靶分子的種類(lèi)和數(shù)量[21]，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其它生物組分的檢測(cè)，把生化分析系統(tǒng)中的樣品制備、生化反應(yīng)和結(jié)果檢測(cè)3個(gè)部分有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，具有快速、高通量、高信息量、平行化、集約化、微型化、自動(dòng)化、成本低、污染少、用途廣等特點(diǎn)[22]。

生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室(微全分析系統(tǒng))、細(xì)胞芯片以及組織芯片等。另外根據(jù)原理還有組件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。藥物通過(guò)不同的靶點(diǎn)作用于組織細(xì)胞，直接或間接地影響細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的生成。通過(guò)對(duì)用藥前后兩組樣品進(jìn)行表達(dá)譜生物芯片檢測(cè)，就可以反映出該藥物作用后相應(yīng)組織或細(xì)胞中基因表達(dá)譜及蛋白質(zhì)等的變化，從而揭示藥物的作用。生物芯片技術(shù)可以尋找藥物靶標(biāo)、進(jìn)行毒理學(xué)研究、研究藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況、藥物分析、中藥研究、指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥、抗藥性研究、建立生物技術(shù)平臺(tái)等[23]。

托婭等[24]研究基因芯片篩選抗腫瘤血管生成中草藥的相關(guān)基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示利用基因芯片技術(shù)可從基因水平解釋中藥的作用機(jī)制，為新藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。LiX等[25]采用微流體芯片技術(shù)檢測(cè)中藥成分對(duì)白血病細(xì)胞的早期細(xì)胞毒性，結(jié)果表明用此法不但能夠縮短藥物篩選的周期、降低實(shí)驗(yàn)成本而且還能解決傳統(tǒng)技術(shù)中遇到的顏色和化學(xué)干擾問(wèn)題。生物芯片技術(shù)使高通量藥物篩選的單靶點(diǎn)單模型模式轉(zhuǎn)變?yōu)橥瑫r(shí)對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行篩選的新模式，逐漸形成了超高通量藥物篩選的概念。由于生物芯片體積小，包含的藥物作用靶點(diǎn)多，從理論上講，生物芯片技術(shù)和高通量藥物篩選技術(shù)相結(jié)合，不僅可同時(shí)對(duì)大量化合物進(jìn)行生物活性篩選，而且可同時(shí)對(duì)大量藥物作用靶點(diǎn)篩選。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而建立起來(lái)的分子水平的藥物篩選模型，可以從更深入的層次評(píng)價(jià)藥物的作用，從而可以為許多疑難病癥提供新的治療途徑和方法。應(yīng)用生物芯片大規(guī)模的篩選研究可以減少大量的動(dòng)物試驗(yàn)，縮短藥物篩選所用時(shí)間，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的安全性，從而帶動(dòng)藥物的研究和開(kāi)發(fā)。

4生物信息學(xué)技術(shù)

生物信息學(xué)是借助計(jì)算機(jī)的運(yùn)算功能，以互聯(lián)網(wǎng)為平臺(tái)，應(yīng)用信息科學(xué)、生物計(jì)算數(shù)學(xué)、比較生物學(xué)等學(xué)科的知識(shí)，對(duì)基因、蛋白質(zhì)等生物信息、生命物質(zhì)相關(guān)的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行研究并對(duì)這些生物信息進(jìn)行提取、儲(chǔ)存、加工和分析，用信息理論和生物數(shù)學(xué)的方法去理解和闡述生物大分子，最終對(duì)它們進(jìn)行處理和應(yīng)用。簡(jiǎn)言之生物信息學(xué)就是通過(guò)數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)的分析手段將生命的數(shù)據(jù)(基因和蛋白)變?yōu)橐曈X(jué)化的信息，從而大大縮短藥物及生物技術(shù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的時(shí)間，且改變了傳統(tǒng)藥物篩選方法的無(wú)目的性[26]。

生物信息學(xué)中數(shù)據(jù)的獲得不僅是指通過(guò)實(shí)驗(yàn)或測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)，同時(shí)包括通過(guò)檢索從已經(jīng)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得需要的數(shù)據(jù)和信息，其是在原始資料的基礎(chǔ)上，建立能夠適應(yīng)特定研究目的需要的數(shù)據(jù)庫(kù)如基因序列庫(kù)，蛋白質(zhì)序列庫(kù)。這些規(guī)模巨大的數(shù)據(jù)庫(kù)，雖然可以保證數(shù)據(jù)庫(kù)信息的全面和豐富，但是由于數(shù)據(jù)的復(fù)雜性和來(lái)源的多渠道等原因，有些并非都是有使用價(jià)值的，而且有些也是待考證的。因此，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析剔除是相當(dāng)必要的。通過(guò)各種分析方法、計(jì)算方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的分析處理，方可獲得可供應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。如對(duì)基因測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可以分析基因序列的特征，也可以進(jìn)行序列比對(duì)找出同源基因等;而對(duì)蛋白質(zhì)序列信息的研究，不僅要分析蛋白質(zhì)序列特征，還要考慮其空間結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息。數(shù)據(jù)分析計(jì)算的方法有多種，如序列比對(duì)、數(shù)據(jù)模型、密碼子偏好檢測(cè)、蛋白質(zhì)辨識(shí)、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立以及各種預(yù)測(cè)方法，都是生物信息學(xué)研究中常用的方法[27，28]。圖2即為應(yīng)用Swiss-PdbViewer軟件分析達(dá)菲與唾液酸N1a鏈的作用位點(diǎn)。從圖中可以非常直觀(guān)的了解到達(dá)菲競(jìng)爭(zhēng)抑制神經(jīng)氨酸酶后與唾液酸單鏈相結(jié)合的各個(gè)位點(diǎn)。根據(jù)結(jié)合的位點(diǎn)可以指導(dǎo)藥物的化學(xué)合成及相關(guān)藥物的篩選。BaoYG等[29]克隆和表達(dá)了與結(jié)核分枝桿菌毒蛋白分泌有關(guān)的Rv3871基因，并使用生物信息學(xué)方法分析其分子結(jié)構(gòu)、功能和同源性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示致病性和非致病性的Rv3871基因在結(jié)構(gòu)和功能上存在著差異，從而闡明了結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制及可作為藥物篩選用的作用靶點(diǎn)。PhilippeBernard等[30]將民族藥學(xué)與生物信息學(xué)相結(jié)合，證實(shí)了白樺脂醇和其氧化形式樺木酸對(duì)磷脂酶A2具有抑制活性。隨著分子生物學(xué)、基因工程的發(fā)展及計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)的普及，各大數(shù)據(jù)庫(kù)的信息量越來(lái)越豐富，生物信息學(xué)在藥物篩選上的地位越來(lái)越重要。其在減少了盲目性的同時(shí)也增強(qiáng)了藥物篩選的科學(xué)性，將是未來(lái)藥物篩選的一大趨勢(shì)。虛線(xiàn)為氫鍵;氫鍵連接的中間部分為達(dá)菲;其余為唾液酸單鏈氨基酸殘基圖2達(dá)菲與唾液酸N1a鏈的作用位點(diǎn)非生物學(xué)篩選藥物的方法還有很多種，如計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)等。一般在藥物篩選的過(guò)程中為了達(dá)到最優(yōu)的篩選結(jié)果，多采用幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，如前文提到的生物芯片技術(shù)和高通量篩選相結(jié)合[31]。BirnbaumerGM等[32]應(yīng)用芯片實(shí)驗(yàn)室與分子印跡技術(shù)相結(jié)合來(lái)檢測(cè)病毒取得良好的結(jié)果。本文僅就目前常用的且比較綜合的幾種方法進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述。藥物篩選過(guò)程中還會(huì)出現(xiàn)很多有待解決的問(wèn)題，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展會(huì)有更多的篩選方法誕生。