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白斑綜合征(whitespotsyndrome，wSs)是全球對蝦養殖業所面臨的危害性最大的病害之一，是國際獸醫局(OIE)規定需要報告的重要水生動物傳染病…。wss由白斑綜合征病毒(whitespotsyndromevims，WssV)引起，由于其給全世界對蝦養殖業帶來的危害巨大，且到現在仍無有效控制措施，所以世界各國都給以重點關注【2-5J。綜合國內外文獻報道，針對對蝦體內wsSV在養殖全程中動態變化的調查較少，而現有報道研究也存在采樣時間間隔較長，所體現的規律性不顯著，未能詳盡地反映其在整個養殖過程中的變動趨勢。本研究旨在通過利用實時定量PCR技術，對精養池塘凡納濱對蝦體內wsSV攜帶情況進行跟蹤，以期更有效和精確地反映對蝦體內wssv攜帶量的變動規律，了解實際養殖生產中影響WSSV流行的因素，從而增加對該疾病可控性的認識，為預防養殖對蝦病毒病暴發提供理論依據和參考。

l材料與方法

1．1實驗場地選擇

2010年7月一2010年11月，在廣東省汕尾市紅海灣鴻泰養殖場，從10口凡納濱對蝦高位精養池塘中隨機抽取6口池塘進行采樣。各池塘面積約為(0．45土0．1)hm2。池底鋪設土工膜，無泥沙層，水深1．8～2．2m，養殖用海水經沙濾井過濾所得。每口池塘配備12～15kw／hm2的增氧設備(增氧機和底部增氧曝氣管)。放養凡納濱對蝦∞f^妒e刀口P螂1，口刀，z口mef)蝦苗體長(1．0士0．1)cm，放苗量為270萬尾／h“。

1．2材料及方法

1．2．1樣品采集采樣時間和頻率按照養殖時間劃分。在第一批放苗的五口池塘中隨機選取卜3號3口池塘。從放苗日起，跟蹤其養殖全程，時間從2010年7月31日到同年11月24日，約14d取一次樣，跟蹤時長116d。根據第一批的調查結果，在第二批放苗的5口池塘中隨機選取4—6號3口池塘從放苗后的第10天起，進行養殖密集采樣跟蹤，時間從2010年9月18日到同年11月20日，采樣時間為7天1次，跟蹤時長63d。第二批采樣池塘均因wSS暴發而中斷養殖。所取蝦樣均為活蝦，每次每塘隨機采集對蝦不少于15尾，分別采集對蝦的鰓和肌肉組織，用濃度為75％的酒精固定。

1．2．2DNA的提取將每次采集的15尾對蝦隨機分成3組，每組5尾。任選一組，并分別取5尾蝦的鰓或者肌肉組織混合成一個樣品，鰓組織樣品總質量為(15士2)mg，肌肉組織樣品總克數為(20土3)mg。各組織樣品DNA采用“天根海洋動物組織DNA提取試劑盒”(天根生物技術有限公司制造)提取。所提取的DNA樣于一20℃保存待測。

1．2．3Real．timePCR引物和探針引物和探針的選擇。根據DurandandLi曲tner【6J設計，由Invitrogen公司合成(表1)

1．2．4Real．timePcR反應參照Li曲tIler等舊1建立的實時熒光定量PcR法檢測wSsV使用Eppendorf熒光定量PCR儀(EppendorfMastercy-clerRealplex)進行定量PcR檢測。選取20“LPcR反應體系：1O燦2xTaqManUniversalPCRMasterMix(TAKARA公司，代號DRR039A)，上下游引物各0．5燦(終濃度為10“m01／L)，探針0．5皿(終濃度為5“mol／L)，模板DNA2此，補充水至20此。PCR反應參數：95℃30s；95℃5s，55℃15s，72℃30s，40個循環，每個樣品重復4次，每批樣品設置空白對照和陽性對照。空白對照用滅菌超純水作模板，陽性對照用已知病原蝦提取的DNA調整濃度后作模板。

1．2．5標準品的制備和標準曲線的建立陽性質粒標準品制備根據Lightner[6]利用插入外源目的基因的方法得到純化陽性質粒DNA，其濃度為1．618×108copy／此。用10倍稀釋陽性質粒至7個梯度作模板并對其進行擴增，其平均CT值依次為34．90、31．04、27．65、24．57、20．24、17．11、13．66，標準曲線如圖l所示，R2=0．9991。

2結果與分析

2．1第一批放苗1～4池塘養殖全程對蝦攜帶wSSv檢測結果

2．1．114—34池塘對蝦鰓組織中WSSV攜帶量在養殖全程中，14—3”池塘對蝦鰓組織中wsSV攜帶量的動態變化如圖2所示。從圖中可以看出，3口池塘的對蝦苗種均攜帶wssv，且其攜帶量均達到了103copy幢以上。隨著養殖的進行，對蝦鰓組織中wssV的攜帶量整體呈現波動上升的趨勢。養殖前期上升幅度較小，最高攜帶量為1．o×105copy幢；到養殖60d左右，24、34池塘出現第一個波動高峰，此時鰓中wssV攜帶量最高可達到3．O×107c叩y／g。隨后其病毒攜帶量有所下降；到養殖后期，1”一3“池塘的wssv攜帶量均有較大幅度的上升，均在養殖末期達到最大峰值。養殖全程中，14池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為1．6×103—8．6×106c叩y恒，平均值1．1×106cdpy／g；2”池對蝦鰓組織wssV攜帶量的波動范圍為1．9×10’~2．1×107c叩y儋，平均值4．4×106copy悖；34池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為6．2×103～9．7×108copy／g，平均值1．1×108copy／g。

2．1．21L3”池塘對蝦肌肉組織中wsSv攜帶量在養殖全程中，1群一3j!j}池塘對蝦肌肉組織中wssV攜帶量如圖1所示，其動態變化情況與鰓組織中的趨勢相似，均呈現波動上升的趨勢，但整體低于鰓組織。結果顯示，14養殖池對蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動范圍為1．3×103～4．4×105copy／g，平均值3．2×105copy／g；24養殖池對蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動范圍為2．1×103～6．1×105copy／g，平均值2．8×105copy／g；34養殖池對蝦肌肉組織WssV攜帶量的波動范圍為6．5x103～1．1×106copy／g，平均值3．3×105copy／g。1虻38池塘病毒含量(取對蝦鰓和肌肉組織帶毒量的平均值)，環境指標及養殖環境狀況見表2。

2．2第二批放苗4L64池塘加密采樣對蝦攜帶WSSv的檢測結果

2．2．14牝礦池塘對蝦鰓組織wSSV攜帶量44—6“池塘對蝦鰓組織WSSv攜帶量在養殖過程中的動態變化如圖2所示。從圖中可以看出，前期病毒攜帶量均較低，隨著養殖的進行，3個池塘對蝦鰓組織中wssv攜帶量逐漸升高，30d左右各池出現第一個波動高峰，wssV最高攜帶量為1．21×106copy／g，隨后有所穩定和下降，但11月6日即養殖53d后，攜帶量快速增長。其中58池塘攜帶量在5天之內從2．3×105copy儋升高至8．2×1010copy／g，最終暴發wss，導致中斷養殖，最后一次采樣缺失：44、64池對蝦wSSV攜帶量在后兩次采樣中迅速增加，最后一次采樣11月20日(即養殖63d)時均達到各池檢測的最大值(分別為6×106copy／g和5×107c叩y／g)，雖未達到發病閾值但兩池最終也因暴發wsS而于11月27—30日停止養殖。調查結果顯示，在整個養殖過程中，48池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為8．1×103～6×106copy／g，平均值8．6×105copy／g；5“養殖池對蝦鰓組織wSsV攜帶量的波動范圍為1．7×104～8．2×1010copy／g，平均值7．0×109copy／g；6”養殖池對蝦鰓組織wSsv攜帶量的波動范圍為5．7×103～5．0×107copy／g，平均值4．3×106copy／g。

2．2．24L6”池塘對蝦肌肉組織中WSSV攜帶量44—64池塘對蝦肌肉組織wSSv攜帶量在養殖過程中的動態變化如圖2所示，其變化情況與鰓組織的趨勢相似，均隨養殖時間的進行逐漸波動上升，且無顯著性差異。調查結果顯示，4”池對蝦肌肉組織WSSV攜帶量的波動范圍為8．1×103～9．4×107copy／g，平均值1．1×1017copy／g；5“池對蝦肌肉組織wSsV攜帶量的波動范圍為1．7×104～1．2×1010copy／g，平均值1．1×109copy／g；6”池對蝦肌肉組織wSSv攜帶量的波動范圍為5．7×103～5．5×105copy／g，平均值1．1×10’copy／g。4牝64池塘病毒含量(取對蝦鰓與肌肉組織帶毒量的平均值)，環境指標及養殖環境狀況見表3。3討論TaqMan探針法熒光定量PcR是實時熒光定量PCR(Real．timePCR)的一種，可以針對微量的病毒進行檢測并實時監測病毒的復制情況，其特異性更強，準確度更高，被廣泛用于微量病毒復制的定量研究[7]。本研究采取實時定量PcR—TaqMan探針法，對高密度精養池塘對蝦wssV攜帶量進行跟蹤調查，以期能夠更加準確的了解對蝦養殖過程中體內wssv攜帶量的變化。本次檢測結果表明，被測對蝦苗種攜帶微量wSSV范圍在1．3×103～1．7×104copy儋。蝦苗攜帶病原體，說明了苗種生產過程中的病害控制還需加強，對育苗場銷售的苗種病害監控還需嚴格【8J。整個檢測結果表明，對蝦鰓組織中的wssV攜帶量整體多于肌肉組織，且兩者變動趨勢一致，但沒有顯著性差異(尸>0．05)。在對14—3“池塘整個養殖過程的調查中，wssV攜帶量在養殖前期(47d前)都有不同程度的增加，但均處于一個較穩定的水平，wsSV拷貝數總體保持在104copy／g左右，個別值高于105copy／g；養殖中后期(60～116d)攜帶量呈現波動上升的趨勢，并在最后一次采樣中達到相對最大值。根據1“一34池塘中對蝦體內wssv前期攜帶情況的調查，對第二批采樣的4虻64號3口池塘進行密集采樣，縮短了采樣時間，增加了采樣次數，以期更好的反應wssv的變化規律及其受各種環境因素影響所表現出的動態變化。在對4牝64池塘養殖的調查中發現，這3口池塘對蝦攜帶wssV的情況與1L38池塘較為相似，前期病毒含量有一定程度的上升，但均處于一個較穩定的水平，除個別池塘外，wssv拷貝數多保持在105copy／g以下。然而53d后急劇上升，其中5”池塘升高至109copy／g以上，導致wSS暴發。44和64池塘也緊急收獲，致使養殖中斷。

探討本次調查檢測中發病池塘對蝦wssv攜帶量急劇上升并率先暴發wss的原因，筆者發現，池塘水體中浮游微藻及水體溫差變化大是主要原因。其中浮游微藻的種群結構不良是重要因素；冬棚搭建后造成水體溫差變化大是主要誘因。有研究表明，良好的浮游微藻種群結構可以提高對蝦養殖生態系統的穩定性，增強系統的抗干擾能力，有利于對蝦健康安全的生長【9。1…。對蝦疾病的暴發與水體中浮游微藻群落結構的變化具有一定的相關性，蝦池中浮游微藻的種類和數量尤其是赤潮生物的類群和數量與對蝦發病的程度呈正相關，其多樣性指數與對蝦的發病程度呈負相關【11-”J。由表2、表3可知，在對以上各池塘的養殖環境指標中浮游微藻種群結構的檢測結果顯示：2一、3僦塘養殖初期均以赤潮藻為優勢種，在凡亞比臺風過境后的1周左右，24、34池塘均出現大量死蝦的情況，臺風后的第一次采樣，對蝦體內的病毒含量也出現急劇的升高。4牝64池塘養殖前中期的浮游微藻種類單一，且均以顫藻為優勢種，當池塘優勢種由顫藻演替為其他藻類時，對蝦帶毒量均出現較大的波動。水溫也是影響wSSV復制的重要因素之一【14，l6I，搭建冬棚前后，養殖水體在短時間內的最大溫差可達7℃，由原來的20℃左右升高到26℃左右，達到病毒復制的最佳溫度范圍。搭建冬棚后的采樣與之前采樣相比帶毒量有較大幅度的升高。所以筆者認為，當池塘浮游微藻群落結構長期不良，尤其是以顫藻等赤潮藻長期作為優勢種時，會致使對蝦免疫系統受到影響，使對蝦一直處于亞健康狀態，間接促進了wssV在體內的復制，而環境因素改變如水溫在適宜病毒復制的溫度范圍或冬棚的搭建使水溫在短時間內變化較大。使得對蝦產生應激反應，抵抗力有所下降，從而誘發了病害的發生。

綜上所述，筆者認為，對蝦可以在攜帶wSSV的情況下養殖生長，并成功上市，但前提是一個良好的養殖生態環境的構建和保持。降低或控制wssV的含量，使其低于發病閾值。影響wssV復制或暴發的關鍵因素有以下幾點：①對蝦免疫力的下降；②環境因子不穩定和惡化，如鹽度突變，溫度突變或者長期處于病毒最佳復制溫度25～28℃之間、pH突變、氨氮和亞硝酸鹽濃度突變或長期處于高值范圍[15-161；③池塘水體中浮游微藻和細菌的群落結構不良[17]等。④對蝦養殖前中期是各種對蝦病暴發的關鍵時期，更應注重對這些養殖時期對蝦抵抗力的增強。鑒于此，有效預防wSS病毒病的關鍵點在于生態防控：①構建優良的藻相，為對蝦生長提供適宜的環境，增強對蝦抵抗力，同時也可以減少不良藻相分泌的藻毒素等有害物質對對蝦的傷害；②定期投放微生態制劑改良養殖生態環境，如益生菌中芽孢桿菌的施放，有效調節池塘環境，利于對蝦生長[18_191；③針對臺風暴雨等天氣，要提前積極做好預防工作，緩解臺風暴雨給蝦體和養殖環境帶來的不良影響，如臺風暴雨前后加強投放微生態制劑，維持良好浮游微藻和細菌的群落結構；④提高對蝦自身免疫力，如在飼料中增加Vc、葡聚糖和中草藥等物質‘201；⑤采用混養模式‘211，增加捕食性動物，如少量混養羅非魚、石斑魚和蝦虎魚等兇猛魚類，可以捕食病弱對蝦，減少對蝦因殘食而導致的病害水平傳播。總之，筆者認為應對wss，防大于治，在本調查的結果中發現并總結，在高位池對蝦養殖環境中，藻相的優劣直接或間接的影響著對蝦抵抗力的高低，同時反映了對蝦抗病能力的強弱。構建良好的浮游微藻和細菌的群落結構，保持養殖水體環境穩定，可以最大程度的減少WSS暴發。