導(dǎo)語：水稻胚乳雙向電泳技術(shù)體系完善一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

胚乳是水稻的主要食用部位，胚乳的形成和發(fā)育直接影響著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。胚乳的主要成分是淀粉和蛋白質(zhì)，因此，籽粒灌漿過程也是淀粉和蛋白質(zhì)的合成與積累過程，在此過程中眾多的酶參與其中。有效地分離和鑒定灌漿過程中胚乳的蛋白質(zhì)對(duì)深入了解稻米品質(zhì)形成的生化學(xué)機(jī)理具有十分重要的意義。近年來，迅速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)能使我們更深刻地了解蛋白質(zhì)的功能及其相互調(diào)控機(jī)制，而且在逆境生理、雜種優(yōu)勢(shì)、品質(zhì)研究中的應(yīng)用也較廣泛[2]。單彩云對(duì)470份國內(nèi)外大豆資源進(jìn)行室內(nèi)分級(jí)篩選，并對(duì)耐低溫資源綏農(nóng)14的子葉和真葉進(jìn)行低溫處理，利用2D技術(shù)尋找耐低溫相關(guān)蛋白。在綏農(nóng)14子葉處理試驗(yàn)中，處理與對(duì)照表達(dá)量相差3.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共獲得29個(gè)，其中4℃處理上調(diào)表達(dá)有13個(gè)點(diǎn)，下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)16個(gè)[3]。白月等用雙向電泳技術(shù)分析水稻少側(cè)根突變系MT10及其野生型IR8的根系全蛋白質(zhì)組，建立二者間的差異表達(dá)圖譜，得到了11個(gè)差異點(diǎn)，其中只在MT10中表達(dá)的蛋白點(diǎn)有2個(gè)，只在IR8中表達(dá)的蛋白點(diǎn)有4個(gè)，兩者間有明顯差異的蛋白點(diǎn)有5個(gè)[4]。劉文文等應(yīng)用雙向電泳（2-DE）技術(shù)分析了烯丙異噻唑誘導(dǎo)后水稻蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，在誘導(dǎo)4d的雙向電泳圖譜上找到了10個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，選取其中3個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析，分別具有泛醌-細(xì)胞色素C還原酶、蘇氨酸肽鏈內(nèi)切酶和蘋果酸脫氫酶活性[5]。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)，它包括蛋白質(zhì)的提取、純化、等電聚焦和SDS-PAGE電泳、凝膠染色、圖像分析等技術(shù)[6]。其中蛋白質(zhì)提取和上樣量大小、膠條轉(zhuǎn)移等對(duì)蛋白質(zhì)分離效果影響很大。郝強(qiáng)等以北海道黃楊為模型植物，比較了TCA/丙酮法、酚法和酚/SDS法三種蛋白質(zhì)提取方法，結(jié)果表明三種提取方法使得電泳結(jié)果相差很大，而改進(jìn)的酚/SDS法所得結(jié)果最好[7]。本試驗(yàn)選用水稻抽穗后10d的籽粒，采用不同的蛋白質(zhì)提取方法和上樣量、膠條轉(zhuǎn)移等對(duì)胚乳蛋白質(zhì)進(jìn)行分離效果比較分析，旨在建立適用于水稻胚乳蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)體系，為分離鑒定水稻胚乳蛋白質(zhì)提供技術(shù)平臺(tái)。

1材料與方法

1.1材料

選用東農(nóng)08-18穩(wěn)定品系的直鏈淀粉含量不同的兩個(gè)材料進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。盆規(guī)格為直徑25cm，高度30cm，每盆4棵生長一致的秧苗，穴間距一致，每個(gè)材料重復(fù)3次，按常規(guī)方法進(jìn)行肥水管理。抽穗時(shí)選取同一天抽穗掛牌標(biāo)記，抽穗后10d取掛牌標(biāo)記的5個(gè)穗，取穗中上部灌漿一致的籽粒，剝?nèi)シf殼置于凍存管中-80℃保存。

1.2方法

1.2.1水稻胚乳蛋白的提取

1.2.1.1TCA-丙酮法取凍存籽粒20粒，用滅菌預(yù)冷的剪刀和鑷子在預(yù)冷的研缽中迅速剝?nèi)シN皮，切去胚，加0.2%PVP迅速研磨至糊狀，懸浮于含0.07%DTT的預(yù)冷10%TCA-丙酮，-20℃過夜。次日4℃35000r•min-1離心15min，棄上清，將沉淀重懸于80%丙酮，于-20℃溫浴lh，4℃16000r•min-1離心15min。沉淀重懸于100%丙酮，于-20℃溫浴lh，4℃16000r•min-1離心15min。重復(fù)此步驟2~4次，倒出上清液，離心管置于冰浴中抽真空15min至丙酮完全揮發(fā)，得到的蛋白為粗蛋白。

1.2.1.2酚法參照易克等方法[8]，取凍存籽粒20粒，加5倍體積提取緩沖液及0.5%PVP。12000r•min-1離心10min，取上清液。加入等體積的水飽和酚（pH8.0），充分振蕩，靜置10min后，12000r•min-1離心5min。取酚相液體，加入5倍體積0.1mol•L-1乙醇銨，置于-20℃下30min，充分洗滌沉淀4次以上，除盡乙醇銨，冷凍抽干，所得干粉為粗蛋白。

1.2.2蛋白裂解及含量測(cè)定

用離心管稱取30mg粗蛋白干粉，向干粉中加入500μL裂解緩沖液（8mol•L-1urea，2mol•L-1thiourea，4%CHAPS，2.5%pH4~7IPGbuffer，1%DTT），36℃溫浴1h，離心時(shí)間取上清，其余兩份作為該樣品的重復(fù)。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量[5]，以蛋白質(zhì)裂解液為空白，1mg•mL-1的牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin，BAS）標(biāo)準(zhǔn)蛋白（標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液用蛋白質(zhì)裂解液配制）為標(biāo)準(zhǔn)，在紫外-可見分光光度計(jì)下測(cè)定595nm的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的含量。

1.2.3雙向電泳

1.2.3.1樣品被動(dòng)上樣及等電聚焦選用17cmIPG膠條（pH4~7）。IPG干膠條膠面朝下放入水化液的水代盤中，覆蓋一層礦物油以防止等電聚焦時(shí)尿素析出，蛋白氧化及產(chǎn)生冷凝水，被動(dòng)水化14h后，置于Bio-Rad等電聚焦儀中，等電聚焦在20℃條件下自動(dòng)進(jìn)行，每膠條限流50μA。等電聚焦參數(shù)如下：①500V4h除鹽；②1000V1h線性上升（Gra）；③8000V2.5h線性上升（Gra）；④8000V0.5h聚焦。

1.2.3.2膠條的平衡將等電聚膠后的膠條膠面向上置于5mL平衡緩沖液Ⅰ（50mmol•L-1Tris-HCL，pH8.8，6mol•L-1urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚藍(lán)，1%DTT）中平衡搖床震蕩15min，然后再置于5mL平衡緩沖液Ⅱ（50mmol•L-1Tris-HCL，pH8.8，6mol•L-1urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚藍(lán)，2.5%碘乙酰胺）中平衡15min，取出后放在濕潤的定性濾紙上，以吸去表面多余的液體。

1.2.3.3SDS-PAGE采用Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)，膠的濃度為12%，將平衡后的膠條放置于已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面上，用0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂液封閉排除氣泡。在電泳槽中加入約1.5L電泳緩沖液（0.025mol•L-1Tris，0.192mol•L-1Glyeine，0.1%SDS）第一步每塊膠10mA下電泳30min，第二步每塊膠20mA下電泳至溴酚藍(lán)前沿距離玻璃板下緣0.5cm時(shí)停止電泳。

1.2.3.4考馬斯亮藍(lán)染色電泳后將凝膠立即放入固定液（40%甲醇，l0%乙酸）中至少30min，可過夜；充分固定后用Milli-pore純凈水洗2次，每次5min；換置考馬斯亮藍(lán)染液（10%硫酸銨，10%磷酸，20%甲醇，0.06%考馬斯亮藍(lán)G250染色，至少2h；用脫色液（25%乙醇，8%乙酸）脫去底色，或者直接用Millipore純凈水脫色，直到蛋白點(diǎn)清晰為止。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法對(duì)胚乳蛋白分離效果的影響

蛋白質(zhì)樣品制備是雙向凝膠電泳最為關(guān)鍵的步驟之一。樣品制備中關(guān)鍵為有效的去除淀粉等干擾成分，盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚，盡量減少蛋白提取過程中的降解和丟失，以提高分辨率。圖1A、B分別為利用TCA-丙酮法和酚法提取蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果。通過比較圖1A和B可以看出，不同的蛋白質(zhì)提取方法對(duì)雙向電泳的分離效果有較大影響。使用PDQuest分析軟件對(duì)圖1A、B進(jìn)行分析，圖1A共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)數(shù)（321±5）個(gè)，圖1B共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)數(shù)（195±5）個(gè)，而且TCA-丙酮提取法的雙向電泳結(jié)果清晰度明顯好于酚法結(jié)果，酚法樣品在等電聚焦過程中電壓未能達(dá)到8000V，這可能是由于酚法提取的蛋白樣品會(huì)混有比較多的鹽離子，影響了聚焦效果。

2.2不同上樣量對(duì)胚乳蛋白分離效果的影響

上樣量大小對(duì)電泳結(jié)果的清晰程度有很大的影響。上樣量太小，低豐度蛋白就無法被識(shí)別；相反，如果上樣量過大，雖然可以看到低豐度蛋白，但是會(huì)導(dǎo)致一些蛋白點(diǎn)過大而多點(diǎn)重合，為分析造成困難。圖2中A、B、C分別是100、300、500μg三種上樣量的電泳結(jié)果。通過比較可以看出，100μg上樣量的電泳圖上共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)數(shù)為（102±5）個(gè)，幾乎看不到低豐度蛋白，而且其背景要深于圖2B和C；而500μg上樣量的電泳圖上共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)數(shù)（310±5）個(gè)，有明顯的橫紋且橫向分離效果不好，放大區(qū)域可以看到有些點(diǎn)重合在一起。而300μg上樣量的電泳圖上共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)數(shù)（331±5）個(gè)，蛋白點(diǎn)數(shù)與500μg上樣量結(jié)果相差不多，但是圖像清晰沒有橫紋和過大的蛋白點(diǎn)，便于分析。

2.3膠條的轉(zhuǎn)移與封閉對(duì)胚乳蛋白分離效果的影響

等電聚焦完成后，將IEF膠條轉(zhuǎn)移到第二向SDS-PAGE這一過程同樣是雙向電泳的關(guān)鍵過程之一，主要涉及IEF膠的固定和平衡以及包埋[9]。在這個(gè)過程中最容易出現(xiàn)膠條不平整和蛋白質(zhì)擴(kuò)散的問題，從而影響電泳的分辨率和準(zhǔn)確度，應(yīng)該加以精細(xì)的操作和調(diào)控。如圖3所示，左邊圖中為包埋不平整的電泳圖片，可以明顯看出圖中標(biāo)出區(qū)域中的蛋白點(diǎn)相對(duì)右邊包埋較好的圖片中同一區(qū)域的蛋白點(diǎn)位置發(fā)生了偏移，而且向中間聚集。影響了電泳圖片的比對(duì)和分析。這可能是由于在加入封頂液時(shí)產(chǎn)生了較大的氣泡造成的。

3討論與結(jié)論

3.1水稻胚乳蛋白的提取

蛋白樣品的提取和制備是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵步驟，蛋白樣品的純度和再溶性直接影響雙向電泳（2-DE）分離結(jié)果的清晰度和重復(fù)性[10]。一般的蛋白質(zhì)樣品制備過程常采用丙酮、三氯乙酸或硫酸銨進(jìn)行沉淀[11]。本試驗(yàn)比較了TCA-丙酮法和酚法提取水稻胚乳蛋白的雙向電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)利用TCA-丙酮提取蛋白，不僅提取效率高，而且雜質(zhì)干擾少，得到的電泳結(jié)果，蛋白條帶清晰，數(shù)量較多。酚法雖然所得到的蛋白再溶性要好于TCA-丙酮法，但是樣品中混雜的鹽離子等小分子雜質(zhì)較多，使得等電聚焦不容易上升到設(shè)定的最高電壓。當(dāng)然這種影響可以通過多次溶解來去除，但是這樣會(huì)損失一些低豐度蛋白，也有違提取操作盡量簡單的原則。因此，綜合考慮應(yīng)該選擇TCA-丙酮法。TCA-丙酮法所得的粗蛋白很多，但是再溶解性較差。在對(duì)粗蛋白用裂解液溶解的時(shí)候，可以用多個(gè)離心管同時(shí)溶解，離心取上清時(shí)合并同一樣品，這樣可以加大溶解效率，減小蛋白樣品中不溶物的干擾。提取的整個(gè)過程要在低溫條件下進(jìn)行，以防止蛋白被蛋白酶降解。由于要提取的是水稻籽粒的胚乳蛋白，為避免引入種皮和胚中蛋白的干擾，就要把種皮和胚完全去掉，這個(gè)過程要盡可能快速且在預(yù)冷的研缽中完成，所用的鑷子和剪刀要滅菌預(yù)冷。由于操作精細(xì)，可以事先多加練習(xí)以加快操作速度。

3.2上樣量的選擇

上樣量的選擇是一個(gè)比較精細(xì)的工作，有的時(shí)候僅僅相差幾十微克的上樣量，所得到的電泳結(jié)果卻相差很大。因此，需要在參考前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)，還應(yīng)該對(duì)上樣量進(jìn)行多次試驗(yàn)和摸索，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多次比較，從而確定最佳上樣量[12]。本試驗(yàn)比較了100、300、500μg三種不同上樣量的雙向電泳的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在上樣量為300μg時(shí)，得到最多的蛋白點(diǎn)數(shù)和背景清晰的電泳圖。這是由于，在電泳槽中加入含有100μg胚乳蛋白的水化液時(shí)，由于蛋白質(zhì)含量較少，很多低豐度的蛋白雖然存在，卻不能被分離出來。這樣所得的圖像就如圖2A所示，只有一些高豐度蛋白能被看到，而且背景相對(duì)要深一些。如果上樣量達(dá)到過高，反而蛋白點(diǎn)要少，這是因?yàn)榫劢惯^程中蛋白質(zhì)濃度過高而在膠槽中沉淀，不能很好地進(jìn)入IPG膠條中造成的[13]。