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草魚Ctenopharyngodonidellus屬鯉形目鯉科，是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，它與鰱、鳙和青魚一起，構(gòu)成了中國著名的“四大家魚”．草魚是草食性魚類，已經(jīng)有1700多年的養(yǎng)殖歷史［1］．由于草魚養(yǎng)殖具有周期短、肉味鮮美、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，目前草魚已經(jīng)成為烏江網(wǎng)箱養(yǎng)殖量最大的魚類品種．然而，隨著烏江流域的工農(nóng)業(yè)發(fā)展和人口增長(zhǎng)，每年都有大量的工業(yè)和生活污水流入烏江，使烏江水質(zhì)變差（尤其在枯水季節(jié)），魚病發(fā)生頻繁，給草魚養(yǎng)殖造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失．因此，其病害的防治顯得十分迫切．目前，rRNA和rDNA作為分子指標(biāo)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌遺傳特征和分子差異研究［2］．大量已知細(xì)菌的rRNA基因數(shù)據(jù)已被測(cè)定并輸入了國際基因數(shù)據(jù)庫，成為細(xì)菌鑒定和分類的參照系統(tǒng)［3］．本研究以患病草魚為材料，對(duì)分離所得菌株采用16SrRNA基因序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果輸入國際基因數(shù)據(jù)庫，通過同源性比對(duì)鑒定致病菌．然后用致病菌接種健康草魚，進(jìn)一步驗(yàn)證其致病性，從而為草魚的病害防治提供病原依據(jù)．

1材料與方法

1．1試驗(yàn)材料患病草魚標(biāo)本（5尾）于2008年4月采自烏江上游主要支流中的偏巖河養(yǎng)殖場(chǎng)，采集時(shí)標(biāo)本材料個(gè)體病征相似．其中2尾草魚病癥為爛鰓、爛尾、爛鰭，體表發(fā)紅；3尾草魚病癥為爛鰓、爛鰭，體表、腸發(fā)紅，腸道出血．

1．2細(xì)菌的分離用無菌棉簽分別沾取患病草魚體表患處、鰓部、腸內(nèi)溶物、體內(nèi)血液、肝臟表面和肝臟內(nèi)部，并分別涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上．將接種后的平板倒置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h．長(zhǎng)出菌落后取出平板，將平板中不同的菌落分別轉(zhuǎn)接到空白營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，轉(zhuǎn)接后的平板倒置于27℃恒溫箱中培養(yǎng)12h．重復(fù)此步驟幾輪，直至一個(gè)平板中只長(zhǎng)有一種菌落［4］．將純化后的平板取出，對(duì)細(xì)菌的厚薄、大小、表面、邊緣、隆起形狀和顏色等進(jìn)行觀察記錄．

1．3基因組DNA的提取和16SrRNA基因的擴(kuò)增、測(cè)序及數(shù)據(jù)處理參見李順等［4］的方法．

1．4細(xì)菌的回復(fù)感染

1．4．1細(xì)菌的培養(yǎng)將分離到的細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于27℃隔水式恒溫箱中培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落．

1．4．2細(xì)菌懸液的制備取已長(zhǎng)出菌落的平板，在超凈工作臺(tái)上用滅菌生理鹽水洗下菌苔于試劑瓶中制成細(xì)菌懸液，保存于冰箱中（4℃）．回復(fù)感染前，將細(xì)菌懸液用滅菌生理鹽水分別以0，5，10，100和1000倍梯度稀釋．

1．4．3細(xì)菌懸液體積分?jǐn)?shù)測(cè)定用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌懸浮液中活菌數(shù)目．各梯度菌液體積分?jǐn)?shù)（細(xì)菌密度）約為1×1010，2×109，1×109，1×108，1×107個(gè)／mL．

1．4．4感染草魚用于回復(fù)感染的健康草魚取于烏江偏巖河養(yǎng)殖場(chǎng)網(wǎng)箱中，體長(zhǎng)15～20cm，體質(zhì)量80～150g，每組10尾．用不同體積分?jǐn)?shù)的菌液以肌肉注射（1mL／尾）和浸泡兩種方式感染試驗(yàn)魚（兩種方式都用以上幾種梯度的菌液感染），對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水．將以上試驗(yàn)魚置于3m×3m的水泥魚池中（水深70cm，連續(xù)充氧），連續(xù)觀察15d．

2結(jié)果與分析

2．1菌落外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果將純化后的平板取出，對(duì)細(xì)菌菌落進(jìn)行形態(tài)觀察，再革蘭氏染色［5］后觀察．通過比較外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果，從5尾患病草魚中共得到7株不同菌株（表1）．

2．216SrRNA基因的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)分離到的7個(gè)菌株的16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出一條約600bp的片段（圖1）．

2．316SrRNA測(cè)序結(jié)果I菌株的測(cè)序結(jié)果（580bp，不包括引物序列）見表2（其余菌株的測(cè)序結(jié)果略）．

2．4菌株的鑒定對(duì)16SrRNA基因部分序列正、反方向測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接后的測(cè)序結(jié)果輸入到NCBI網(wǎng)站（）．利用BLAST工具，對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，所得結(jié)果見表3．

2．5回復(fù)感染將初步鑒定的以上細(xì)菌分別接種到健康草魚，發(fā)現(xiàn)注射感染后致病體積分?jǐn)?shù)在1×108～1×109個(gè)／mL之間．4．浸泡感染組和對(duì)照組在回復(fù)感染后的15d內(nèi)均無明顯癥狀．

3討論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，16SrRNA基因序列分析技術(shù)在微生物分子檢測(cè)及分類鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用．以16SrRNA基因?yàn)槟康幕虻默F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能精確地揭示微生物種類及遺傳的多樣性，從而使16SrRNA基因序列分析成了微生物分類鑒定的主要依據(jù)，已被廣泛應(yīng)用到菌種鑒定、群落對(duì)比分析、群落中系統(tǒng)發(fā)育及多樣性的評(píng)估等領(lǐng)域，是一種客觀和可信度較高的分類和鑒定方法［6］．本研究用微生物學(xué)常用的細(xì)菌分離純化方法從患病草魚中分離出7株菌株，分別擴(kuò)增出了16SrRNA基因約600bp的片段．一般認(rèn)為，16SrDNA序列同源性大于99％，可以認(rèn)為屬于同一種；同源性大于95％而小于98％，可以認(rèn)為是同一個(gè)屬的不同種；同源性在93％～95％之間，可以認(rèn)為屬于不同的屬［7］．通過對(duì)16SrRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，初步鑒定Ⅰ為沙雷氏菌，II為腐生葡萄球菌，III為熒光假單孢菌，IV為產(chǎn)堿普羅威登斯菌，V為嗜水氣單孢菌，VI為殺鮭氣單孢菌，VII為不動(dòng)菌屬．將以上初步鑒定的不同細(xì)菌接種到健康草魚，沙雷氏菌、腐生葡萄球菌、熒光假單孢菌、產(chǎn)堿普羅威登斯菌和嗜水氣單孢菌在體積分?jǐn)?shù)為1×108～1×109／mL時(shí)開始致病，對(duì)草魚的危害較大，可以判斷它們可能是網(wǎng)箱養(yǎng)殖草魚發(fā)病的主要病原．殺鮭氣單孢菌、不動(dòng)菌屬以及浸泡感染的癥狀不明顯，加大體積分?jǐn)?shù)是否致病有待進(jìn)一步研究．在對(duì)細(xì)菌引起魚類病害的研究中，對(duì)嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌可以引起魚類及其他多種水生動(dòng)物患病有大量報(bào)道［8－17］．

在本試驗(yàn)中，嗜水氣單胞菌在接種后第3天開始死亡，試驗(yàn)期間死亡率為60％，主要癥狀為豎鱗、掉鱗和皮膚充血等，與其他學(xué)者的結(jié)果［10－11］相一致；殺鮭氣單孢菌在本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果［18］不一致，我們將就此進(jìn)一步研究以證實(shí)其是否致病．