導(dǎo)語：長春花懸浮培養(yǎng)管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要：實(shí)驗(yàn)研究了不同種類、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合和其他四種理化因子對長春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響。以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：單因子以2，4-D效果最好。其中以2，4-D的最佳濃度為0.5mg/L。而本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:組合因子比單因子更有利于細(xì)胞的生長，以0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA為最佳。在其它的四種理化因子中，1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基有利于細(xì)胞的生長。蔗糖的最佳濃度為30g/L；葡萄糖在研究范圍內(nèi)隨著濃度的增加，生長速度也在增加。最適于長春花的PH值為5.0-5.4。

關(guān)鍵詞：長春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)理化因子

一、引言

長春花（Catharanthusroseus(L.)G.Don）屬于夾竹桃科（Apocynaceae）長春花屬[1]。為多年生草本。原產(chǎn)于非洲東南部，現(xiàn)在我國各地均有栽培。長春花用途廣泛，主要含具有抗腫瘤作用的生物堿——長春堿和長春新堿等[2]。長春花組織和細(xì)胞培養(yǎng)的研究已經(jīng)有很多年，多數(shù)應(yīng)用于大量細(xì)胞生產(chǎn)和植物的再生，以成分分析、提取為主，應(yīng)用于次生代謝產(chǎn)物的提取卻很少[3]。

長春花的懸浮培養(yǎng)的就是植物細(xì)胞工業(yè)化的必經(jīng)步驟和固體培養(yǎng)基相比，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有繁殖速度快、能大規(guī)模培養(yǎng)和提供大量均勻一致的植物細(xì)胞培養(yǎng)物的特點(diǎn)。然而長春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)并不完善，在國內(nèi)外很少有此類報(bào)道。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)受到許多外界條件的影響。如激素、溫度、光照、營養(yǎng)、PH值等。本文就這方面選取了不同的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類、濃度組合以及其他的四種理化因子來培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，以便獲得細(xì)胞快速增殖的最佳培養(yǎng)條件。

二、材料與方法

1．材料

長春花（Catharanthusroseus(L.)G.Don）取自中科院武漢植物園

2．愈傷組織的誘導(dǎo)

取春天4月份的長春花幼嫩的葉片，為誘導(dǎo)及大量繁殖，必須對外植體進(jìn)行挑選[4]，用自來水沖洗1-2個(gè)小時(shí)，濾紙吸干，用75%的酒精侵泡30S后，用0.1%的升汞消毒8min，無菌水沖洗數(shù)遍。切成0.5cm×0.5cm的小塊。接種于含0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA（本文所用的生長調(diào)節(jié)劑購于上海，配成1mg/mL的母液）、瓊脂7g/L、蔗糖30g/L的MS固體培養(yǎng)基上（PH=5.8，高壓滅菌）在光強(qiáng)為40umol/ms12-14h/d.溫度為25±2℃條件先誘導(dǎo)[5]。

3．愈傷組織的篩選及細(xì)胞懸浮系的建立[6]

誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于含50ml固體培養(yǎng)基的150ml的三角瓶中，每瓶的接種量約3g。愈傷組織每25天繼代一次。經(jīng)3-5次繼代后，選擇生長均一、質(zhì)地疏松、分散性好的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中。每150ml三角瓶中分裝40ml的液體培養(yǎng)基（同上的固體培養(yǎng)基去掉瓊脂，以下的實(shí)驗(yàn)沒有特別說明的都是該種培養(yǎng)基）。每次接種量約為2g。懸浮培養(yǎng)采用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為120r/min。置于光照下培養(yǎng)。

4．細(xì)胞干重的測定

細(xì)胞懸浮周期為25天。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)減壓過濾后測其鮮重。然后收集培養(yǎng)物置于60℃烘箱中烘干至恒重稱其干重。換算成每天每升培養(yǎng)基增加的細(xì)胞干重毫克數(shù)，即mg/Ld.表示細(xì)胞的生長速度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值計(jì)算結(jié)果。

三、結(jié)果與討論

1．激素組合對長春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長的效應(yīng)

（1）2，4-D和6-BA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)

表42，4-D和NAA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)

2，4-D（0.5）+6-BAx（mg/L）

0.05

0.1

0.2

0.5

1.0

2.0

5.0

干重增加（mg/L）

2352

5008

8200

10109

6095

5832

4000

生長速度（mg/Ld）

95

201

328

405

244

234

160

由表4可以看出，2，4-D和6-BA組合使用比單獨(dú)一種更有利于細(xì)胞的生長。當(dāng)組合中6-BA在0.05-0.5范圍內(nèi)，細(xì)胞生長速度隨著濃度的增加而增加。在0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA時(shí)，細(xì)胞的生長速度最快。而在6-BA在0.5-2.0mg/L時(shí)，隨著6-BA的增加，其生長速度不斷地下降。

（2）2，4-D、NAA和6-BA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)

表52，4-D、NAA和6-BA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)

2，4-D（0.5）+NAA（0.5）+6-BAx（mg/L）

0.05

0.1

0.2

0.5

1.0

2.0

5.0

干重增加（mg/L）

2503

4313

6532

9205

9826

10294

8653

生長速度（mg/Ld）

101

173

262

369

394

412

347

由表5可以看出：2，4-D、NAA和6-BA三種激素組合時(shí)，更有利于細(xì)胞培養(yǎng)的生長，且在研究范圍內(nèi)較單因子有著更明顯的效果。在研究范圍內(nèi)的最佳濃度為0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA。

2．其他理化因子對長春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)

（1）不同種類培養(yǎng)基對對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)

在長春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，分別采取了1/4MS、1/2MS、MS、B5、White、N6六種不同的培養(yǎng)基〔6〕，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

表6不同種類培養(yǎng)基對對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)

培養(yǎng)基種類

1/4MS

1/2MS

MS

B5

White

N6

干重增加（mg/L）

9776

12526

10294

11328

8310

死亡

生長速度（mg/Ld）

392

501

412

454

333

——

由表6可以看出1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基對細(xì)胞的生長比較適合。而在N6培養(yǎng)基中細(xì)胞全部死亡。在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長的速度情況不同是由于作為氮源的狀態(tài)不同，含量不同所造成的。

（2）不同蔗糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)

表7不同蔗糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)

不同蔗糖濃度（g/L）

10

20

30

40

50

干重增加（mg/L）

死亡

2587

5278

10294

9775

7829

生長速度（mg/Ld）

——

104

212

412

391

314

由表7可以看出，在MS培養(yǎng)基中，隨著蔗糖濃度的升高，生長速度逐漸增大，說明在低濃度時(shí)，糖是細(xì)胞生長的限制性基質(zhì)〔7〕。甘煥遠(yuǎn)等〔8〕在總結(jié)前人和自己的工作的基礎(chǔ)上提出了培養(yǎng)基中蔗糖常常是使培養(yǎng)物生長達(dá)到最高的碳源。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的增加會導(dǎo)致干重的增加，而細(xì)胞數(shù)量并不顯著增加[9]。實(shí)驗(yàn)也證明了蔗糖的濃度為30g/L時(shí)，細(xì)胞生長最快。低于或高于此濃度，其細(xì)胞生長速度都將下降。

（3）不同葡萄糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)

表8不同葡萄糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)

不同葡萄糖濃度（g/L）

10

20

30

40

50

干重增加（mg/L）

死亡

2150

4415

6040

7281

8801

生長速度（mg/Ld）

——

87

177

242

292

353

由表8和上面兩個(gè)示意圖可以看出，在MS培養(yǎng)基中，在實(shí)驗(yàn)所研究的范圍內(nèi)，隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)胞生長速率隨之增加。而且較之于蔗糖相比，增長更明顯。此外還發(fā)現(xiàn)葡萄糖下的愈傷組織比蔗糖下的要疏松、均勻而且細(xì)小顆粒多。

（4）不同PH值對細(xì)胞生長的效應(yīng)

表9不同PH值對細(xì)胞生長的效應(yīng)

不同PH值

3.8

4.2

4.6

5.0

5.4

5.8

6.2

6.6

干重增加（mg/L）

4734

5948

8597

12808

16741

10294

7224

4636

生長速度（mg/Ld）

190

238

344

513

550

412

289

186

由表9和上面兩個(gè)示意圖可以看出：PH值對細(xì)胞的生長影響十分明顯。在研究范圍內(nèi)PH值在5.0-5.4時(shí)最適于長春花細(xì)胞的生長。PH值過大或過小都對愈傷組織的生長產(chǎn)生明顯的抑制，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)基的PH值在小范圍內(nèi)呈先降低后升高的變化趨勢[10]，這種變化趨勢主要是由于NO3-和NH4+之間供應(yīng)和吸收的不平衡[11]。在研究范圍內(nèi)的最適PH值為5.4。

四、結(jié)論

從以上的實(shí)驗(yàn)部分可以看出：不同的理化因子對長春花培養(yǎng)細(xì)胞有不同的影響。其中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物細(xì)胞培養(yǎng)起著重要而明顯的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也得到了驗(yàn)證。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類以及濃度對不同的植物有著不同的效果。在長春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，組合因子比單因子更有利于細(xì)胞的生長，以0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA效果最佳，細(xì)胞生長速度最快。從結(jié)果可以看出不是植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度越高、種類越多效果就越明顯。對不同的植物應(yīng)選擇相應(yīng)的種類和適宜的濃度。另外，不同的培養(yǎng)基在長春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中也有不同的效果。這主要是由于培養(yǎng)基的組分不同。其中1/2MS、MS和B5這三種培養(yǎng)基較有利于細(xì)胞的生長。這可能是由于這三種培養(yǎng)基中的氮元素相對于其他的培養(yǎng)要少一些的原因，而更有利于長春花細(xì)胞的生長。蔗糖和葡萄糖是培養(yǎng)基中碳素和能量物質(zhì)的來源。同時(shí)對保持培養(yǎng)基的滲透壓也有重要的作用。但在培養(yǎng)基中糖的含量不宜過高，一般在2-4%為宜。PH值是細(xì)胞培養(yǎng)的重要的外界環(huán)境，對細(xì)胞的生長起著重要的作用，不宜過高也不宜過低，本實(shí)驗(yàn)研究的長春花的最適PH值為5.0-5.4。

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