導(dǎo)語(yǔ)：肥大心肌細(xì)胞分析論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的：觀察壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞表面AT1和AT2受體mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化.方法：構(gòu)建壓力超負(fù)荷性心肌肥大模型，于不同時(shí)間點(diǎn)急性分離心肌細(xì)胞.采用RTPCR法觀察肥大心肌細(xì)胞中AT1和AT2mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化.結(jié)果：隨著大鼠心肌肥厚程度的逐漸加重，于術(shù)后4wk起，AT1與AT2mRNA的表達(dá)水平較之假手術(shù)組均逐漸升高，8wk時(shí)繼續(xù)升高.主動(dòng)脈縮窄12wk組AT1的表達(dá)水平與8wk組無(wú)顯著性差異，但AT2的表達(dá)水平從0.438±0.088進(jìn)一步升高至0.580±0.066，且差異有顯著性（P<0.05）.各時(shí)段假手術(shù)對(duì)照組間心肌細(xì)胞中AT1與AT2的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化.結(jié)論：在壓力超負(fù)荷性心肌肥大過(guò)程中，心肌細(xì)胞AT1與AT2mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程.表達(dá)增多的AT2受體可能會(huì)在隨后心力衰竭的發(fā)生中發(fā)揮一定作用.

【關(guān)鍵詞】心肌細(xì)胞受體血管緊張素II1型受體血管緊張素II2型

0引言

目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面主要存在著血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的兩種受體，即Ⅰ型受體（AT1）及Ⅱ型受體（AT2）.已知AT1介導(dǎo)了幾乎所有AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)［1］，而AT2的功能至今尚不完全清楚.目前認(rèn)為，AT2與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、凋亡等生物過(guò)程有關(guān)，且在某些方面具有與AT1相拮抗的作用.AT2可以減輕或逆轉(zhuǎn)心臟纖維化以及血管重塑［2］，從而對(duì)抗AT1介導(dǎo)的促纖維化作用；AT2可以引起血管舒張［3］，而這也與AT1引起的血管收縮效應(yīng)相反.成年期AT2的表達(dá)水平低下，在某些病理?xiàng)l件下,AT2及AT1的表達(dá)水平將會(huì)發(fā)生變化.由于這兩型受體可能存在拮抗作用，因而在不同疾病條件下二者表達(dá)水平的變化將會(huì)對(duì)心臟的功能和結(jié)構(gòu)起重要的調(diào)節(jié)作用.目前，有關(guān)心肌肥大過(guò)程中心肌細(xì)胞上AngⅡ受體動(dòng)態(tài)變化的報(bào)道不多.我們以壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察在細(xì)胞肥大過(guò)程中其表面AT1和AT2受體mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及與心肌肥大之間的相互關(guān)系，以期進(jìn)一步深入理解兩型受體在心肌肥大發(fā)生中的作用及其機(jī)制.

1材料和方法

1.1材料雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量220～250g（西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心).AngⅡ，collagenaseⅠ，protease及BSA（Sigma公司）.Trizol及Taq酶（Promega公司），dNTPs及100bpDNALadder（華美生物工程公司）.引物由上海康成生物技術(shù)有限公司合成.其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1壓力超負(fù)荷性心肌肥大模型的構(gòu)建將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組各18只，腹主動(dòng)脈縮窄組于左腎動(dòng)脈上方小心分離長(zhǎng)約3mm的腹主動(dòng)脈，套以內(nèi)徑為0.8mm的銀夾造成縮窄；假手術(shù)組除不以銀夾縮窄腹主動(dòng)脈外，其余操作同腹主動(dòng)脈縮窄組.術(shù)后分別飼養(yǎng)4wk（6只）、8wk（6只）及12wk（6只）.

1.2.2心肌細(xì)胞的分離及心肌肥大指數(shù)測(cè)定采用膠原酶Langendorff法對(duì)心臟進(jìn)行逆行灌流,待灌流結(jié)束首先測(cè)取左心室質(zhì)量(包括左心室游離壁和室間隔)，計(jì)算左心室質(zhì)量與體質(zhì)量比值(LV/BW).而后獲取含有左心室游離壁和室間隔的肥大心肌細(xì)胞.由于心肌細(xì)胞的體積和質(zhì)量較成纖維細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞等大的多，因而經(jīng)50g溫和離心1min后，在置換上清液的同時(shí)梯度恢復(fù)溶液中Ca2+的濃度.此過(guò)程重復(fù)3~4次后，基本去除所含非心肌細(xì)胞［4］.提取部分心肌細(xì)胞,使用目鏡測(cè)微尺測(cè)量心肌細(xì)胞橫徑（TDM）.高倍鏡下（10×40）隨機(jī)選取20個(gè)視野,計(jì)算其中桿狀心肌細(xì)胞橫徑，取其均值為該例左心室心肌細(xì)胞橫徑（LVTDM）.

1.2.3RTPCR一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增.條件為：94℃變性1min,退火1min.72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，而后于72℃再延伸5min.引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度如下所示.βactin：正義鏈5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，反義鏈5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′，211bp；AT1：正義鏈5′CAGCCGTCATCTACCGAAAC3′，反義鏈5′AGGAAAGGGAACACGAAGC3′,142bp；AT2：正義鏈5′ATCTGGCTGTGGCTGACTT3′,反義鏈5′AGCATATTTCTCAGGTGGG3′，362bp.以βactin作為內(nèi)參照，用二者凝膠成像后的灰度值與βactin相比，代表其相對(duì)表達(dá)水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，GraphPadPrism統(tǒng)計(jì)軟件分析，不同時(shí)間點(diǎn)的LV/BW，LVTDM，AT1和AT2mRNA的表達(dá)變化分析采用雙因素方差分析，各組間相互比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1左心室質(zhì)量/體質(zhì)量及心肌細(xì)胞橫徑大鼠腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后4，8，12wk時(shí)LV/BW，LVTDM與其同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組相比均顯著增高(P<0.05).且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后LV/BW和LVTDM呈明顯遞增關(guān)系(P<0.01，表1).表1左心室質(zhì)量/體質(zhì)量及左心室心肌細(xì)胞橫經(jīng)

2.2RTPCR與假手術(shù)組相比，隨著大鼠心肌肥厚程度的加重，AT1與AT2mRNA的表達(dá)水平于術(shù)后4wk起逐漸升高，8wk時(shí)繼續(xù)升高.12wk組AT1mRNA的表達(dá)水平(0.505±0.059)與8wk組(0.468±0.094)比較雖有升高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而AT2mRNA的表達(dá)水平從0.438±0.088進(jìn)一步升高至0.580±0.066，差異有顯著性.各時(shí)段假手術(shù)組心肌細(xì)胞中AT1與AT2mRNA的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化（P>0.05，圖1,2).

3討論

目前的資料表明，AT2受體的作用較為復(fù)雜有時(shí)甚至是相互矛盾的.研究結(jié)果提示AT2在細(xì)胞和組織中的作用與當(dāng)時(shí)的特定環(huán)境密切相關(guān)［5］.因此，分離并觀察壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞AT1與AT2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于研究其在壓力超負(fù)荷性心肌肥大過(guò)程中的作用是非常必要的.

有關(guān)資料顯示：正常成年大鼠心肌細(xì)胞AT2處于較低水平，心肌肥厚時(shí)AT2表達(dá)增加，AT1表達(dá)增加或降低的幅度趨緩［6］；心肌梗死后AT2與AT1(主要是AT1α)均明顯上調(diào)［7］.我們的結(jié)果表明：正常情況下，成年大鼠心肌細(xì)胞上AT1與AT2mRNA均處于較低水平.隨著大鼠心肌肥厚程度的加重，AT1mRNA的表達(dá)水平于術(shù)后4wk起逐漸升高.術(shù)后8wk明顯升高，在12wk繼續(xù)保持較高水平，但8wk組與12wk組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.但AT2的表達(dá)水平從4wk起升高，8wk時(shí)繼續(xù)升高，而12wk時(shí)進(jìn)一步升高.結(jié)合此階段大鼠心肌細(xì)胞的病理改變主要以肥大為主，提示此時(shí)AngII可通過(guò)細(xì)胞膜上表達(dá)逐漸上調(diào)的AT1促進(jìn)細(xì)胞的重塑.與表達(dá)上調(diào)并逐漸達(dá)到頂峰的AT1相比，AT2的上調(diào)幅度較大并有繼續(xù)增高的趨勢(shì).但此時(shí)AT2受體將發(fā)揮何種作用，目前尚無(wú)定論.有研究表明AT2對(duì)肥大的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用.心肌梗死后，阻斷AT1的同時(shí)活化的AT2在AT1阻斷劑的治療過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，這表明AT1阻斷劑的作用部分是由活化的AT2介導(dǎo)的［8］；在成年肥大的大鼠心臟中，抑制AT2將使左室對(duì)AngII的促生長(zhǎng)作用更為敏感［9］；而過(guò)度表達(dá)AT2將有助于保護(hù)心肌梗死重塑過(guò)程中轉(zhuǎn)基因小鼠的左室功能［10］.但也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)AT2對(duì)心功能也可有不利影響［11-12］,從而引起不斷進(jìn)展的泵功能衰竭、心律失常及心臟重塑.有關(guān)AT2在壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中的作用，我們的初步研究結(jié)果表明：在肥大心肌細(xì)胞中，AngII通過(guò)AT2的介導(dǎo)促進(jìn)TNFα和IL1β的生成及釋放，說(shuō)明AT2與心肌重構(gòu)過(guò)程中炎癥的發(fā)生有關(guān)，而這可以進(jìn)一步引起心功能的失常和心衰的發(fā)生.

總之，我們的結(jié)果表明：壓力超負(fù)荷性心肌細(xì)胞的肥大過(guò)程伴隨著細(xì)胞表面AT1與AT2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化.AT2受體表達(dá)程度的增加可能與隨后的心肌改建及心力衰竭的發(fā)生有關(guān).

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