導(dǎo)語：小議生物人工腎小管的構(gòu)建一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要：目的為構(gòu)建一種既有濾過及抗凝功能、同時又有重吸收及內(nèi)分泌功能的新型生物人工腎小管提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。醫(yī)學(xué)論文方法以層黏連蛋白0.74mg/ml包被的AV400濾器為載體，將轉(zhuǎn)染人Nanog基因的血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)懸液與轉(zhuǎn)染人Nanog基因的腎小管上皮細(xì)胞(HKC)懸液等體積混勻，分次注入實(shí)驗(yàn)組濾器內(nèi)腔，構(gòu)建生物人工腎小管。對照組只在層黏連蛋白包被的AV400濾器內(nèi)腔注入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。采用PKH26、PKH67標(biāo)記法分別觀察ECV304、HKC在聚砜膜中空纖維上的分布；應(yīng)用掃描電鏡檢測混合細(xì)胞在聚砜膜中空纖維上的生長狀況及形態(tài)。結(jié)果混合細(xì)胞能在聚砜膜中空纖維上較好地黏附、生長。PKH26、PKH67標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈致密點(diǎn)片狀分布；掃描電鏡觀察可見細(xì)胞形成單層片狀。結(jié)論兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞在層黏連蛋白包被的聚砜膜中空纖維上生長良好，這為構(gòu)建一種既有血管內(nèi)皮細(xì)胞抗凝、同時又有小管上皮細(xì)胞重吸收功能的新型生物人工腎小管奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)染基因Nanog內(nèi)皮細(xì)胞上皮細(xì)胞混合種植聚砜膜中空纖維腎小管

生物人工腎(bioartificialkidney，BAK)是腎臟組織工程研究的重點(diǎn)之一。BAK的研究包括兩個方面：生物人工腎小管和生物人工腎小球。當(dāng)前，腎臟組織工程研究已取得了極大的進(jìn)展，但仍存在關(guān)鍵的問題有待解決。如何在一定時間內(nèi)快速獲得大量的組織工程種子細(xì)胞；如何讓構(gòu)建的生物人工濾器既有生物人工腎小球的濾過與抗凝功能，同時又有生物人工腎小管的重吸收及內(nèi)分泌功能。針對如何提高一定時間內(nèi)種子細(xì)胞產(chǎn)量的問題，我們在先前的研究中應(yīng)用促細(xì)胞增殖的人Nanog基因(hNanog)來促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖。而對生物人工濾器功能兼?zhèn)涞膯栴}，在本研究中我們采用了種子細(xì)胞混合種植的方法。

一、材料與方法

1、材料伊格爾最低濃度必需介質(zhì)(EMEM)培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(FCS，美國Hyclone)，胰酶(美國Sig-ma)，PKH26及PKH67(美國Sigma)，Hoechst33342(美國Sigma)。JSM—6000F掃描電鏡(日本JEOL公司)。腎小管上皮細(xì)胞(HKC)由南京醫(yī)科大學(xué)楊俊偉教授饋贈，血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院三所細(xì)胞室贈送，轉(zhuǎn)染種子細(xì)胞的rAAV2-hNanog重組病毒由北京本元正陽生物技術(shù)公司包裝完成，轉(zhuǎn)染rAAV2-hNanog重組病毒的2種細(xì)胞ECV304、HKC由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

2、中空纖維上混合細(xì)胞的分布

2.1混合細(xì)胞的PKH26/PKH67標(biāo)記：將轉(zhuǎn)染hNanog基因的兩種細(xì)胞ECV304及HKC細(xì)胞各接種在75cm塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中，用10%的FCSEMEM進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)兩種細(xì)胞各生長至匯合時，用0.25%的胰酶消化、離心并沉淀細(xì)胞后，然后再用無血清的EMEM洗滌細(xì)胞，400g/min離心，共5min，然后棄去上清，使殘留上清不要超過25μl，然后在獲得的細(xì)胞沉淀中加入1ml稀釋劑C溶液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液；按照PKH26和PKH67試劑盒說明書分別配制4×10-6mol/L的PKH26溶液和4×10-6mol/L的PKH67溶液，然后把ECV304細(xì)胞懸液加入到PKH26染液、HKC細(xì)胞加入到PKH67染液中，各自吹打均勻，并于室溫下放置2～5min。之后加入2ml血清，室溫下放置1min，再用10%EMEM4ml稀釋上述細(xì)胞懸液，25℃條件下1200r/min離心，共10min，棄去上清，去除染色液。用10%EMEM沖洗ECV304、HKC細(xì)胞4次，然后將細(xì)胞移到另一新管中，加入10ml完全培養(yǎng)基，離心，重懸，使兩種細(xì)胞各自的密度調(diào)整在(1.0～2.0)×107/ml，然后把兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞ECV304與HKC細(xì)胞懸液等體積混合，輕輕吹打均勻，制成混合細(xì)胞懸液。

2.2標(biāo)記細(xì)胞的種植：將實(shí)驗(yàn)組及對照組的AV400濾器(Fresenius公司0.7m2)均用無血清的EMEM培養(yǎng)基沖洗，再把無血清EMEM配制的層黏連蛋白0.74mg/ml[1]注入濾器中，置于37℃孵箱中1h，之后將其抽去。然后把標(biāo)記的種子細(xì)胞混合液平均分成4次注入濾器內(nèi)腔，兩次注射時間間隔為1h，每次注射完畢后按方向標(biāo)記放置濾器，待下次注射結(jié)束后依照固定方向?qū)V器轉(zhuǎn)動90°，總共進(jìn)行4次，完成360°循環(huán)。對照組只在AV400濾器中注入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，注射方法及放置方法同實(shí)驗(yàn)組。最后把兩組濾器的外腔注滿培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)，濾器中培養(yǎng)液pH<7.2時即予以更換。于培養(yǎng)第5天時從兩組濾器中取出中空纖維，用刀片將纖維絲縱向剖開，磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗2次，然后在熒光顯微鏡下觀察2種轉(zhuǎn)染細(xì)胞在中空纖維上的分布。

3、混合細(xì)胞在中空纖維上生長狀態(tài)的觀察把2種已轉(zhuǎn)染人Nanog基因的ECV304、HKC置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中，用10%FCSEMEM進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)兩種細(xì)胞生長至匯合狀態(tài)時，用0.25%的胰酶消化，并對2種種子細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。實(shí)驗(yàn)組及對照組所用AV400濾器仍用層黏連蛋白包被。把2種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度調(diào)至(1.0～2.0)×107/ml，然后把兩者等體積混合，輕輕吹打均勻，制成混合細(xì)胞懸液，然后把細(xì)胞混懸液注入濾器內(nèi)腔，注射方法與放置方法同2.2部分。對照組只在AV400濾器中注入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，注射方法及放置方法同實(shí)驗(yàn)組。最后將兩組濾器外腔注滿培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)，濾器中培養(yǎng)液pH<7.2時即予以置換。第7天時從兩組濾器中取出中空纖維，用0.1mol/LPBS沖洗1次，然后再用2.5%戊二醛于4℃冰箱中固定2h，之后再用0.1mol/LPBS溶液沖洗，用刀片將中空纖維沿縱向剖開，再用0.1mol/LPBS溶液沖洗2次，最后把剖開的中空纖維置于1%鋨酸中，4℃冰箱中固定1h。標(biāo)本制作完成后，進(jìn)行掃描電鏡檢測。

二、結(jié)果

1、中空纖維上混合細(xì)胞PKH26及PKH67標(biāo)記檢測：經(jīng)PKH26染色的ECV304轉(zhuǎn)染細(xì)胞及經(jīng)PKH67染色的HKC轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合種植于聚砜膜中空纖維上后，可見兩種種子細(xì)胞呈點(diǎn)片狀分布在聚砜膜中空纖維上。熒光顯微鏡下，ECV304細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，而HKC呈現(xiàn)黃綠色。而對照組則無紅色或黃綠色的點(diǎn)片狀細(xì)胞群分布。

2、中空纖維上混合細(xì)胞的生長形態(tài)：轉(zhuǎn)染的ECV304細(xì)胞與轉(zhuǎn)染的HKC細(xì)胞混合種植于聚砜膜中空纖維內(nèi)腔7d后，掃描電鏡檢測：對照組未見細(xì)胞生長；混合細(xì)胞在中空纖維內(nèi)腔上呈片狀生長，并可見細(xì)胞表面的微絨毛。

三、討論

早期的腎臟組織工程主要是模仿腎小球的濾過功能，人們利用具有類似腎小球?yàn)V過功能的生物膜(如聚砜膜)建立了血液透析的方法。然而，血濾器在血透過程中易出現(xiàn)血栓，最終導(dǎo)致濾過功能下降。為解決血濾器中出現(xiàn)血栓的問題，有人將轉(zhuǎn)染水蛭素基因的內(nèi)皮細(xì)胞種植在生物膜材料上，制成生物人工腎小球[3，4]，但這種具有抗凝功能的生物人工腎小球只能對小分子溶質(zhì)進(jìn)行清除和濾過，缺乏物質(zhì)重吸收及內(nèi)分泌等重要功能。

生物人工腎小管是把腎小管上皮細(xì)胞種植在中空纖維腔內(nèi)，上皮細(xì)胞在中空纖維內(nèi)腔的表面黏附生長并形成單層，從而發(fā)揮小管上皮內(nèi)分泌、重吸收作用[4-8]，但它缺乏抗凝的功能。在透析過程中，生物人工腎小管仍需要使用肝素抗凝。對血透患者來說，長期使用普通肝素(UFH)可引起脂質(zhì)代謝異常，加重患者的脂質(zhì)代謝紊亂[9，10]。盡管有研究認(rèn)為，血透過程中使用低相對分子質(zhì)量肝素(LMWH)在一定程度上可以緩解高脂血癥和改善脂質(zhì)代謝，但John等[11]的研究證明，無論使用UFH還是LMWH，均有導(dǎo)致嚴(yán)重的肝素誘發(fā)性血小板減少癥的可能(heparin-in-ducedthrombocytopenia，HIT)。因此，把兩種種子細(xì)胞混合種植在聚砜膜中空纖維上，構(gòu)建一種兼?zhèn)溲軆?nèi)皮細(xì)胞抗凝功能、小管上皮細(xì)胞內(nèi)分泌及重吸收功能的新型生物人工腎小管，是克服既往生物人工腎小球/腎小管不足的一個可行的方法。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，兩種種子細(xì)胞混合后，能在聚砜膜材料上較好地生長，證明利用混合種子細(xì)胞構(gòu)建新型生物人工腎小管是可行的。同時，兩種種子細(xì)胞混合種植，有可能使構(gòu)建的新型生物人工小管更符合生理結(jié)構(gòu)。Noishiki等把內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合種植在人工血管腔面，置于體內(nèi)血流環(huán)境中，結(jié)果形成了與血管壁類似的結(jié)構(gòu)。另外，混合種植的2種種子細(xì)胞之間還會發(fā)生相互作用，而這種相互作用可能是種子細(xì)胞持久、良好地黏附生長所必須的。有研究證明，與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞和單獨(dú)培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞相比較，共培養(yǎng)條件下的平滑肌細(xì)胞增殖速度明顯加快，蛋白合成量顯著增加。當(dāng)然，內(nèi)皮細(xì)胞與腎小管上皮細(xì)胞間是否確實(shí)存在這種相互作用，有待今后進(jìn)一步研究。

近年來，隨著新材料與新技術(shù)的發(fā)展，生物人工腎出現(xiàn)了小型化、可移植化的趨勢。Fissell等利用微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)，把人皮質(zhì)小管上皮細(xì)胞種植在縮微化的硅片及納米硅微孔膜上，為生物人工腎系統(tǒng)的縮微化提供了一條新途徑。此外，當(dāng)前的生物器官打印技術(shù)更為生物人工腎的微型化、可移植化及功能的復(fù)合化展現(xiàn)了美麗的前景，但上述技術(shù)存在諸多難點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中尚有極大困難。因此，利用混合工程種子細(xì)胞構(gòu)建具有復(fù)合功能的新型生物人工腎小管具有潛在的應(yīng)用價值。