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【摘要】小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell,EScell）體外培養(yǎng)可以分化成為外胚層組織，并進(jìn)一步分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞已用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞替代治療和治療藥物的研發(fā)。小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法主要有擬胚體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化、基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化、默認(rèn)模式介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化、單層粘附培養(yǎng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化和遺傳工程介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化等。本文綜述了這些分化方法。

【關(guān)鍵詞】胚胎干細(xì)胞;神經(jīng)細(xì)胞;分化

Progressindirecteddifferentiationofmouseembryonicstemcellsintoneuralcells

【Abstract】Mouseembryonicstemcellscangiverisetoectodermalderivativesincultureandcanbefurtherinducedintoneuronsandgliaforcell-replacementtherapiesinthecentralnervoussystemandforuseindrugdiscovery.Themethodsofdirecteddifferentiationofmouseembryonicstemcellsintoneuralcellsincludeneuraldifferentiationfromembryonicstemcellsviaembryoidbodies,stromalcellinducedneuraldifferentiation,defaultmodelmediatedneuraldifferentiation,adherentmonocultureinducedneuraldifferentiation,geneticengineeringmediatedneuraldifferentiationandsoon.Herewereviewthesemethodologies.

【Keywords】embryonicstemcell;neuralcell;differentiation

小鼠胚胎干細(xì)胞于1981年首次由Evans和Kaufman［1］成功分離建系，它們來(lái)源于胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass,ICM），這些細(xì)胞具有穩(wěn)定的二倍體核型，在體外可以分化為三個(gè)胚層的多種細(xì)胞。將小鼠胚胎干細(xì)胞重新植入胚泡可以參與形成胚胎。體外ES細(xì)胞維持未分化狀態(tài)依賴于一些細(xì)胞因子的存在，如白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor,LIF）［2］。撤去這種自我更新的刺激信號(hào)后，ES細(xì)胞很快分化為多種細(xì)胞。這些屬性使ES細(xì)胞成為非常有用的發(fā)育生物學(xué)和功能基因組學(xué)研究的生物系統(tǒng)［3］。

1擬胚體（embryoidbodies,EBs）內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的分化

小鼠ES細(xì)胞通過(guò)擬胚體分化為神經(jīng)細(xì)胞主要有以下兩種方案。

1.1“4-/4+方案”［4］將小鼠ES細(xì)胞無(wú)LIF培養(yǎng)4天，形成EB；再用維甲酸（retinoicacid,RA）處理4天，然后在明膠（gelatin）［5］或?qū)诱尺B蛋白（laminin）［4］包被的組織培養(yǎng)皿上培養(yǎng)［6］。培養(yǎng)6天后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，開始表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異的基因，如神經(jīng)微絲輕鏈（neurofilamentlightchain）、微管相關(guān)蛋白2和5（MAP2、MAP5）等。這些細(xì)胞對(duì)一系列神經(jīng)遞質(zhì)和去極化電流起反應(yīng)，證實(shí)了它們是可以傳遞興奮的神經(jīng)元。這一方案還會(huì)分化出神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，多數(shù)為星形膠質(zhì)細(xì)胞，但也有少突膠質(zhì)細(xì)胞的存在［7］。RA是一類促神經(jīng)生長(zhǎng)因子，不僅對(duì)多潛能干細(xì)胞有誘導(dǎo)作用，對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞也有促進(jìn)增殖、成熟的作用。RA與受體RAR、RXR結(jié)合，后者活化后與RA反應(yīng)元件（RARE）結(jié)合，激活神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因并抑制中胚層相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［8］。Wiles等人的實(shí)驗(yàn)表明RA通過(guò)激活抑胰蛋白（follistatin）抑制骨形態(tài)形成蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）而使小鼠ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化［9］。

該方案時(shí)間短、成本低，是目前使用較為廣泛的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)方法。其不足之處是EB的外層細(xì)胞先分化而內(nèi)層細(xì)胞仍保持未分化狀態(tài),分化不均一，得到的細(xì)胞種類復(fù)雜，不利于純化。

1.2“五步法”方案［10］(1)擴(kuò)增未分化的胚胎干細(xì)胞；(2)去除分化抑制劑或促有絲分裂素，ES細(xì)胞開始分化，不貼壁懸浮生長(zhǎng)，形成EB；(3)去除生長(zhǎng)因子，選擇巢蛋白（nestin）陽(yáng)性細(xì)胞（即神經(jīng)前體細(xì)胞）；(4)使用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液，添加生長(zhǎng)激素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，擴(kuò)增神經(jīng)前體細(xì)胞；(5)利用促神經(jīng)元存活因子誘導(dǎo)并維持神經(jīng)元成熟。該方案不用RA處理EB，而是將EB在一種選擇性的無(wú)血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)。因?yàn)镋B中的非神經(jīng)細(xì)胞不能在這種培養(yǎng)條件下生存，所以大部分存活下來(lái)的細(xì)胞是nestin陽(yáng)性的神經(jīng)前體細(xì)胞［11］。這些神經(jīng)前體細(xì)胞可被高效地誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元［12］。

該方案的主要優(yōu)點(diǎn)是在進(jìn)一步分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之前，神經(jīng)前體細(xì)胞已經(jīng)得到較高的純化，這有利于特定類型神經(jīng)細(xì)胞的獲得。但是，其操作較“4-/4+方案”復(fù)雜，而且多種生長(zhǎng)激素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)用增加了成本且不利于分化機(jī)制的闡明。

通過(guò)EB途徑由ES細(xì)胞分化而來(lái)的神經(jīng)元多數(shù)為γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元，少數(shù)是谷氨酰胺能神經(jīng)元。通過(guò)改變誘導(dǎo)分化的條件，可以得到不同類型的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并提高分化效率。腹側(cè)中腦和后腦是多巴胺能神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)元產(chǎn)生的部位，SHH(sonichedgehog)和FGF-8（fibroblastgrowthfactor-8）對(duì)這兩部分的形態(tài)發(fā)生起重要作用［13］，Lee等人［10］用這兩種分子處理EB來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞得到了多巴胺能神經(jīng)元和5-羥色胺（5-HT）能神經(jīng)元。2002年Wichterle等人［14］用背側(cè)分子（RA）和腹側(cè)分子（Hh-Ag1.3,一種SHH的拮抗劑）處理EB，得到了腹側(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。2005年Tsuchiya等人［15］在經(jīng)典的“五步法”方案基礎(chǔ)上，在第五步除去bFGF（basicfibroblastgrowthfactor），用含有層粘連蛋白的N2培養(yǎng)液中成功誘導(dǎo)分化出微小膠質(zhì)細(xì)胞，并進(jìn)一步用含有胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）和粒單細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI-1640培養(yǎng)液擴(kuò)增細(xì)胞，得到89.0%的微小膠質(zhì)細(xì)胞。

2基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的分化

第二類誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化的方法是基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)方法，該方法的誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，目前稱為“基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的誘導(dǎo)活性作用（stromalcell-derivedinducingactivity,SDIA）”［16］。

2000年Kawasaki等人描述了一種經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法［16］。這一方法中，神經(jīng)細(xì)胞的分化通過(guò)ES細(xì)胞與小鼠骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞PA-6細(xì)胞單層共培養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，92%的細(xì)胞表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（nervecelladhesionmolecule,NCAM）陽(yáng)性，其中多數(shù)為酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxylase,TH）陽(yáng)性細(xì)胞。酪氨酸羥化酶是多巴胺生物合成的限速酶，因此是多巴胺能神經(jīng)元的一個(gè)很好的分子標(biāo)志。2005年Yamozoe等人［17］用含有肝素的磷酸鹽緩沖液沖洗培養(yǎng)的PA-6細(xì)胞得到含有所謂神經(jīng)誘導(dǎo)因子（neuralinducingfactors,NIF）的溶液，用此溶液培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小鼠ES細(xì)胞可以在含有33%NIF溶液的培養(yǎng)液中生存，并且隨著培養(yǎng)液中肝素濃度的增加，ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的比例也增高。值得注意的是，PA-6細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化受到血清或BMP-4的抑制，血清和BMP-4的加入可引起ES細(xì)胞分化為多種非神經(jīng)細(xì)胞。PA-6細(xì)胞的SDIA作用并不能使所有類型的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，例如，2005年Roybon等人［18］報(bào)道，對(duì)于神經(jīng)前體細(xì)胞，PA-6細(xì)胞不能促進(jìn)其向多巴胺能神經(jīng)元分化，而是促進(jìn)其向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

2003年Barberi等人［19］描述的一種經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法可以將ES細(xì)胞分別誘導(dǎo)分化為多種神經(jīng)細(xì)胞。這一方法將小鼠骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞MS5或S17或主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)來(lái)源的原始基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞與ES細(xì)胞在血清替代培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)，得到神經(jīng)前體細(xì)胞，再用不同的細(xì)胞因子序貫處理這些神經(jīng)前體細(xì)胞，分別可以得到較高百分比的膽堿能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。將得到的多巴胺能神經(jīng)元注射到6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森模型動(dòng)物的患側(cè)紋狀體內(nèi)，8周后由中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑amphetamine或者紋狀體D1、D2受體激動(dòng)劑apomorphine所誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)不穩(wěn)定癥狀得到了顯著改善，并且可以在注射細(xì)胞的紋狀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞。

基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化的方法可以高效獲得某種特定的神經(jīng)細(xì)胞，例如，多巴胺能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元。然而，作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

3默認(rèn)模式（defaultmodel）介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化

2001年Tropepe等人［20］發(fā)現(xiàn)小鼠ES細(xì)胞在低密度、無(wú)血清、無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下培養(yǎng)7天后，約0.2%的細(xì)胞可形成神經(jīng)球（neurosphere），并進(jìn)一步自發(fā)分化為神經(jīng)細(xì)胞，這種分化方法稱為默認(rèn)模式。這是抑制神經(jīng)分化的信號(hào)分子表達(dá)降低的結(jié)果。Wiles等人［9］發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)分化過(guò)程中，可以檢測(cè)到BMP、TGFβ等基因的表達(dá)下調(diào)。BMPs在神經(jīng)發(fā)育早期與細(xì)胞表面絲/蘇氨酸受體結(jié)合激活Smad蛋白，后者進(jìn)入核內(nèi)抑制Mash1、Math1、Ngn1/2、NeuroD等轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)分化［21］。BMP4處理的小鼠ES細(xì)胞在分化過(guò)程中神經(jīng)元數(shù)量大為減少［22］；而用noggin、follistatin、chordin、Cerberus等BMPs的拮抗劑處理小鼠ES細(xì)胞則可促進(jìn)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向的分化。

該方法促進(jìn)神經(jīng)分化的效率較低，單獨(dú)應(yīng)用此法誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化并不多見。

4單層粘附培養(yǎng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化

2002年P(guān)acherník等人［23］在不形成EB和不用RA處理的情況下，將小鼠ES細(xì)胞生長(zhǎng)在含有胰島素（insulin）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin）、硒元素（selenium）和纖連蛋白的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)分化的細(xì)胞多數(shù)表達(dá)MAP-2等神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。2003年Ying等人［24］將細(xì)胞密度為0.5～1.5×104/cm2的小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)于0.1%明膠包被的組織培養(yǎng)皿上，以N2B27作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天后，60%以上的細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞。該方法形成的神經(jīng)前體細(xì)胞具有良好的可塑性：神經(jīng)前體細(xì)胞在N2B27培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到的細(xì)胞多數(shù)為GABA能神經(jīng)元；FGF8和SHH處理神經(jīng)前體細(xì)胞可以得到較多的多巴胺能神經(jīng)元。

此類方法將形成EB的三維培養(yǎng)模式簡(jiǎn)化為單層粘附培養(yǎng)的模式，降低了復(fù)雜程度，有利于神經(jīng)細(xì)胞分化早期事件的分子機(jī)制研究，而培養(yǎng)液中各成分發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步闡明。

5遺傳工程介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化

2002年Chung等人［25］將Nurr1（nur相關(guān)因子1）基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞，使其過(guò)表達(dá)，從而誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為具有中腦多巴胺能神經(jīng)元表型的細(xì)胞。Nurr1是一種轉(zhuǎn)錄因子，直接結(jié)合于TH基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)維持中腦多巴胺能神經(jīng)元表型的蛋白質(zhì)的表達(dá)，如L-芳香族氨基酸脫羧酶（aromaticL-aminoaciddecarboxylase,AADC）、囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（vesicularmonoaminetransporter2,VMAT2）［26］和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（dopaminetransporter,DAT）［27］。將這種方法得到的多巴胺能神經(jīng)元注射到腦內(nèi)可以改善帕金森模型大鼠的運(yùn)動(dòng)缺陷［28］。該方法存在的問(wèn)題是，在神經(jīng)細(xì)胞分化之前過(guò)表達(dá)Nurr1會(huì)上調(diào)其他多巴胺能神經(jīng)元分子標(biāo)志的表達(dá)，而且由ES細(xì)胞分化的其他細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)這種情況［29］。

2004年Ikeda等人［30］將MASH1基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞，該ES細(xì)胞多數(shù)分化為表達(dá)βⅢtubulin和泛NCAM（panNCAM）的神經(jīng)元樣細(xì)胞，其中半數(shù)進(jìn)一步分化為Islet陽(yáng)性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。MASH1是一種激活型堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于腹側(cè)端腦，調(diào)節(jié)GABA能中間神經(jīng)元和分支運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育［31］。將得到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞注射到偏癱小鼠腦室周圍的運(yùn)動(dòng)皮層，可明顯改善運(yùn)動(dòng)障礙。

遺傳工程介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化方法的優(yōu)勢(shì)是可以較高效率地得到感興趣的特定的神經(jīng)細(xì)胞。但是由于導(dǎo)入基因的功能多樣性和不確定性，較難判斷該基因?qū)?xì)胞的整體影響和長(zhǎng)遠(yuǎn)影響。

6問(wèn)題與展望

雖然小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法取得了較大進(jìn)展，目前可以較高效率地得到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但是仍有許多問(wèn)題亟待解決。首先，雖然“五步法”方案解決了“4-/4+”方案中分化細(xì)胞不易純化的問(wèn)題，但是其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明、操作步驟需要進(jìn)一步優(yōu)化；其次，SDIA誘導(dǎo)方法的作用機(jī)制和單層粘附培養(yǎng)的作用機(jī)制需要進(jìn)一步闡明，這將會(huì)有利于我們對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中信號(hào)通路的掌握；再次，遺傳工程方法導(dǎo)入的基因?qū)?xì)胞的長(zhǎng)遠(yuǎn)影響需要進(jìn)一步觀察和研究；還有，現(xiàn)在所得到的神經(jīng)細(xì)胞類型還不很明確，因?yàn)樯窠?jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞還可以分為很多亞型。例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元根據(jù)形態(tài)和生化特性就可以分為不同亞型，它們的分布和生理功能也不盡相同。因此有必要獲得特定部位和類型的神經(jīng)細(xì)胞。

ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究有利于人們了解胚胎神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制、發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因；建立體外定向誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化體系將為神經(jīng)疾病治療藥物的篩選以及基因工程藥物的開發(fā)等提供有用的材料；體外大量有功能的特定神經(jīng)元的獲得使神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)正一步步從理論走向?qū)嵺`。

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