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【摘要目的摘要：探索維生素E(VitE)抗小鼠日本血吸蟲病肝纖維化功能及其機制.方法摘要：用日本血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染小鼠，構建日本血吸蟲病肝纖維化模型，以肝纖維化達Ⅱ級或Ⅱ級以上作為開始VitE治療標志.實驗分5組摘要：正常對照組、模型組及VitE高、中、低劑量組(每日150,50,5mg/kg),8wk末處死動物，HE和VG染色對肝組織進行病理學檢查，分光光度法檢測肝組織丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，免疫組化SP法檢測肝星狀細胞(HSC)標記物α平滑肌動蛋白(αSMA)表達，RTPCR方法檢測肝臟α1(I)型前膠原mRNA表達.結果摘要：VitE降低模型組肝臟MDA含量［(5.00±0.31)μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05］，提高SOD活性［(249.84±26.22)μkat/gvs(120.11±42.61)μkat/g,P%26lt;0.05］；減少αSMA陽性表達［(0.41±0.02)vs(0.68±0.02),P%26lt;0.05］；降低肝臟膠原含量［(0.23±0.01)vs(0.60±0.11),P%26lt;0.05］和α1(I)型前膠原基因表達［(0.28±0.01)vs(0.85±0.15),P%26lt;0.05］.結論摘要：VitE具有抗小鼠日本血吸蟲病肝纖維化功能，其機制和抗脂質過氧化功能、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前膠原基因表達和膠原合成有關.

【血吸蟲病，日本；肝硬化；維生素E；氧化性應激；肝星狀細胞；膠原I型

日本血吸蟲病是我國危害最大的寄生蟲病之一，而肝纖維化是日本血吸蟲病致死和形成嚴重并發癥最重要的原因.探究表明，在血吸蟲病肝纖維化形成過程中，氧化應激發揮重要功能，參和血吸蟲對宿主的損傷，自由基可能是血吸蟲病主要的致病因素［1］.VitE作為機體防御氧化應激損傷的重要抗氧化劑，已應用于治療肝纖維化，但有關VitE抗日本血吸蟲病肝纖維化功能的探究國內外報道甚少，而VitE治療血吸蟲病肝纖維化的功能機制尚未見文獻報道.我們觀察VitE抗日本血吸蟲病肝纖維化功能，探索其機制如下.

1材料和方法

1.1材料健康雄性昆明小鼠(18～22)g及日本血吸蟲尾蚴陽性釘螺(湖北省血吸蟲病防治探究所)，皮膚敷貼法感染日本血吸蟲尾蚴（20±1）條/只，于感染后8,10,12wk末分別處死6只小鼠后取肝組織進行病理學檢查，以肝纖維化達Ⅱ級或Ⅱ級以上作為VitE開始治療的標志，即在12wk末開始給予VitE治療.32只感染小鼠分為4組，每組8只摘要：1組，模型組；2組，VitE高劑量組(VitE每日150mg/kg)；3組，中劑量組(50mg/kg)；4組，低劑量組(5mg/kg).VitE膠丸由廈門魚肝油廠生產，剪破膠丸，用蒸餾水配制所需濃度的混懸液，灌胃給藥每日1次，連續8wk.另取同一批健康小鼠10只作為正常對照組.丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒(南京建成生物工程探究所)，免疫組化所用試劑(北京博奧申生物技術有限公司)，TRIzol(美國Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(美國Promega)，Taq酶(Gibco公司).α1(I)型前膠原引物序列參照GenBank，上游序列摘要:5′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′，下游序列摘要:5′TGCTGTAGGTGAAGCGACTG3′，擴增片段為419bp；內參照βactin引物上游序列摘要:5′TGTCACCAACTGGGACGATA3′，下游序列摘要:5′AGGTCTTTACGGATGTCAACG3′，擴增片段為654bp，引物由北京奧科生物技術有限公司合成.

1.2方法斷頸處死小鼠，取肝右葉相同部位肝組織2塊，1塊于-70℃保存，測定肝組織勻漿MDA含量、SOD活性及肝臟α1(I)型前膠原基因表達；1塊固定于100mL/L中性甲醛，石蠟包埋，行HE和VG及αSMA免疫組化染色.

1.2.1肝組織病理學及纖維化評分常規行HE和VG染色，光鏡下觀察肝小葉病理變化及肝纖維化程度分級摘要：0級20=1，正常；Ⅰ級21=2，膠原纖維包繞蟲卵肉芽腫四周；Ⅱ級22=4，匯管區有大量纖維，小葉間僅有少量纖維；Ⅲ級23=8，纖維組織大量延伸至肝小葉間.應用HPIAS1000高清楚度彩色病理圖文分析系統，每組每次測量20～30個由單個成熟蟲卵形成的肉芽腫兩個直角相交直徑，以(最大橫徑+最大縱徑)/2為平均值，并計算各組均值；測定VG染色切片膠原纖維灰度面積(S)和視野總面積(T)，用S/T比值表示膠原含量.

1.2.2肝組織勻漿MDA含量和SOD活性測定硫代巴比妥酸比色法測定肝臟MDA含量，黃嘌呤氧化法測定SOD活性，按試劑盒說明書要求操作.

1.2.3肝臟αSMA免疫組化采用SP法，兔抗鼠αSMA抗體稀釋度1∶100，用已知陽性片做陽性對照，PBS液代替一抗做陰性對照，細胞內出現棕黃色顆粒為陽性細胞.應用HPIAS1000高清楚度彩色病理圖文分析系統對αSMA免疫組化切片進行平均吸光度值檢測.

1.2.4肝臟α1(I)型前膠原基因表達應用TRIzol試劑盒，參照說明提取肝組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用20μL反應體系.PCR反應條件摘要：95℃變性5min,94℃30s,94℃30s,52.7℃退火30s,72℃延伸30s，循環30次，最后72℃終止10min，以βactin為內參照.PCR產物分析摘要：PCR產物經2kg/L瓊脂糖凝膠2μL電泳檢測，結果照相并存入凝膠分析系統，以βactin光密度值標化α1(I)型前型膠原基因光密度值，得到α1(I)型前膠原基因相對含量.

統計學處理摘要：采用SPSS12.0統計軟件對結果進行統計學分析，數據均采用x±s表示，采用方差分析進行比較，P%26lt;0.05為差異有統計學意義.多組均數間的多重比較采用LSD法.

2結果

2.1肝臟病理學變化對照組無明顯組織學異常.1組摘要：HE和VG染色示小鼠血吸蟲病肝纖維化模型建立成功.血吸蟲感染后8wk，蟲卵肉芽腫大小和數量達到高峰，大量炎性細胞浸潤；隨感染時間延長，肉芽腫逐漸縮小，肝細胞變性、壞死和炎性細胞浸潤明顯減輕，膠原纖維逐漸增多.至20wk，膠原纖維由最初的細線狀變為條索狀或網狀分布在匯管區、蟲卵肉芽腫四周并延伸至肝小葉間(圖1A，B).VitE組肉芽腫大小和1組比較無顯著差異(P%26gt;0.05)，對肝細胞變性、壞死和炎性細胞浸潤程度影響不明顯；2，3組雖有不同程度肝纖維化，但纖維帶變細、窄、短，膠原纖維局限于匯管區和肉芽腫內及四周，肝小葉間很少有膠原沉積(圖1C)，和1組比較，肝纖維化程度分級差異有顯著性(P%26lt;0.05).4組和1組比較無明顯差異(表1).

2.2肝臟MDA含量和SOD活性和對照組比較，1組SOD活性下降(P%26lt;0.05)，MDA含量增多(P%26lt;0.05)，有統計學意義.2,3組SOD活性和1組比較升高(P%26lt;0.05)，但和對照組比較仍相差甚遠(P%26lt;0.05)；2,3組MDA含量和1組比較減少(P%26lt;0.05)，2組和對照組比較無顯著性差異(P%26gt;0.05)；4組和1組比較無明顯差異(表1).

A摘要:模型組×100;B摘要:模型組×200;C摘要:VitE組×100.

圖1肝臟膠原纖維分布VG

2.3肝臟αSMA表達對照組肝臟血管壁、膽管壁平滑肌有少許αSMA陽性表達，匯管區及肝竇內基本無αSMA陽性表達；1組匯管區、蟲卵肉芽腫內及四周膠原纖維沉積處可見大量索狀αSMA陽性表達細胞，肝竇內可見多量αSMA陽性表達細胞(圖2A,B)；2,3組αSMA陽性細胞數目減少(P%26lt;0.05)，局限在匯管區、纖細的纖維隔及肉芽腫內及四周，肝竇內表達減少(圖2C)；4組和1組比較無明顯差異(表1).

A摘要:模型組×100;B摘要:模型組×200;C摘要:VitE組×100.表1VitE對蟲卵肉芽腫直徑、MAD含量、SOD活性、αSMA平均吸光度值及肝纖維程度的影響

2.4肝臟α1(I)型前膠原基因表達和膠原含量1組(即感染20wk末)α1(I)型前膠原mRNA和膠原含量高于感染12wk時(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)和對照組(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05).2,3組α1(I)型前膠原mRNA和膠原含量和1組比較差異有顯著性(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)；2組α1(I)型前膠原mRNA和膠原含量和感染12wk時比較有顯著性差異(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)，而3組無統計學意義(P%26gt;0.05)；4組和1組比較無明顯差異(圖3，表2).

M摘要:marker;1摘要:模型組;2摘要:感染12wk;3摘要:VitE高劑量組;4摘要:VitE中劑量組;5摘要:VitE低劑量組.

圖3RTPCR分析各組α1(I)型前膠原mRNA表達表2VitE對膠原含量和α1(I)型前膠原基因表達的影響

3討論

氧化應激是多種病因所致肝纖維化發生發展的重要環節之一［2］.VitE作為體內一個重要的抗氧化劑，有抗肝纖維化［3-5］、抗腫瘤、抗衰老等功能.宗道明等［5］探究表明，VitE可降低血吸蟲病肝纖維化患者血清肝纖維化各項指標，對肝纖維化組織形態學的好轉有積極功能，治療血吸蟲病肝纖維化療效顯著.但目前有關VitE抗血吸蟲病肝纖維化機制少見文獻報道.

Chojkier等［6］探究表明，VitE抑制HSCα1(I)型膠原基因表達.我們發現，VitE降低肝臟α1(I)型前膠原基因表達、膠原含量及肝纖維化程度分級；2組α1(I)型前膠原mRNA和膠原含量顯著低于感染12wk時.可見VitE可延緩血吸蟲病肝纖維化進程，減輕肝纖維化程度.本探究中，1組MDA含量增加，SOD活性下降，說明日本血吸蟲病肝纖維化之肝臟發生氧化應激反應，產生脂質過氧化損傷，和文獻［1］報道一致，而VitE能夠不同程度地逆轉這些改變，對此具有一定的治療功能；并且VitE抑制HSC活化和增殖.VitE可能通過抑制肝臟脂質過氧化功能和由此產生的活性醛，如MDA和4羥化壬烯(4HNE)，從而抑制MDA和4HNE蛋白加合物形成，該加合物是實驗性肝損傷和肝纖維化聯系的樞紐［7］，進而抑制氧化應激誘導的HSCα1(I)型前型膠原基因表達和蛋白合成［8］.我們發現VitE尚不能完全逆轉SOD活性，故對其劑量、療程以及和其它藥物的聯合應用有待于進一步的探究.

總之，VitE可延緩血吸蟲病肝纖維化進程，減輕肝纖維化程度，其機制和抗脂質過氧化功能、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前膠原基因表達和膠原合成有關，適當補充VitE進行抗纖維化治療是一種可行的手段，有望成為一種廉價、不良反應少、療效顯著的臨床用藥.

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