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摘要摘要：目的觀察飼料中添加牛磺酸對光化學損傷后大鼠光感受器細胞凋亡的影響，并進一步從氧化應激基因cfos表達變化角度探索其防護機制。方法70只SD大鼠隨機分為對照組、牛磺酸組。分別喂飼標準飼料或添加4％牛磺酸飼料喂飼15d后接受(3000±200)lx持續0，1，3，6，9，12,24h光照，凋亡細胞原位末端標記法(TUNEL)檢測光感受器細胞凋亡情況并計算凋亡指數(AI)；RTPCR法及免疫印跡法檢測視網膜內cfosmRNA以及蛋白表達水平。結果感光細胞凋亡指數隨光照時間延長逐漸增加，牛磺酸組AI顯著低于對照組(P%26lt;005)，其中光照12h牛磺酸組和對照組AI分別為(123±47)％和(324±62)％；視網膜cfosmRNA光照1h后一過性表達增高，牛磺酸組較對照組低(P%26lt;005)；光照后視網膜cfos蛋白表達逐漸升高，于3h達峰值，牛磺酸組顯著低于對照組(P%26lt;005)。結論在視網膜光化學損傷條件下，牛磺酸可能通過抑制視網膜cfos的轉錄及表達，阻斷光感受器細胞凋亡轉導從而保護視網膜。

摘要：牛磺酸；視網膜光化學損傷；凋亡細胞；cfos

Effectsoftaurineoncfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage

Abstract摘要：ObjectiveToobservetheeffectofdietarysupplementationwithtaurineonphotoreceptorapoptosisandfurtherinvestigatechangesofcfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage.MethodsSeventyratswererandomlydividedintocontrolgroup(Control)and4%taurinesupplementationgroup(Taurine).Thesubjectswereexposedto(3000±200)lxtransmittedbysixcoldwhitelightsfor0,1,3,6,9,12,24h.TheapoptoticphotoreceptorcellsweredetectedusingTUNELmethod;TotalRNAandproteinofretinawereextracted;relativecfosmRNAlevelsweredeterminedusingRT-PCRandcfosproteinlevelsweredetectedbywestern-blotanalysis.ResultsWiththelightexposuretimeprolonged,apoptosisindex(AI)ofphotoreceptorcellswaselevated,amongwhichtheAIof12hwere(12.3±4.7)%and(32.4±6.2)%inTaurineandcontrolgroup(P%26lt;0.05).ThecfosmRNAofratretinawastransientlyinducedafterone-hourlightexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%26lt;0.05);cfosproteinlevelincreasedafterthreehourexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%26lt;0.05).ConclusionTaurinecanpartlyreducethetranscriptionandtranslationofc-fos,whichwouldfurtherinhibittheapoptosissignaltransductionandprotecttheratretinafromphotochemicaldamage.

Keywords摘要：taurine;photochemicaldamage;apoptoticcell;cfos

視網膜是視覺形成的重要組織結構，若光照時間或光照強度等超過視網膜承受力，則會導致光化學損傷〔1〕，損傷早期視功能減退，光感受器細胞丟失，后期內層神經元變性壞死，最終導致失明〔12〕。近年探究認為，凋亡是視網膜光化學損傷中光感受器細胞丟失的主要機制〔1,3〕，持續高強度光照使視網膜內自由基和脂質過氧化產物激增，同時氧化應激基因AP1表達上調促進凋亡信號轉導，且證實其亞單位cfos是必需調控因子。牛磺酸和視網膜生長發育和功能維持關系密切，前期實驗已證實，4％牛磺酸能有效保護光化學損傷條件下的大鼠視網膜〔4〕。本探究擬進一步觀察其對光感受器細胞凋亡的影響，并從cfos表達變化角度探索防護機制。

1材料和方法

11實驗動物及分組清潔級SD大鼠(第三軍醫大學第三附屬醫院動物中心)70只，體重150g左右，雌雄各半。隨機分為對照組、牛磺酸組，分別喂飼標準飼料或添加4％牛磺酸(北京世紀維他生物技術有限公司，純品)飼料15d后，各組5只大鼠分別接受(3000±200)lx持續0，1，3，6，9，12，24h光照。

12凋亡細胞的原位末端標記法(TUNEL)檢測光感受器細胞凋亡情況大鼠光照后立即取出眼球，4％多聚甲醛固定過夜，常規石蠟切片，TUNEL試劑盒(德國Roche公司)檢測視網膜光感受器細胞凋亡情況參照試劑說明書，計數10個油鏡視野下每張切片TUNEL陽性細胞數，其和光感受器細胞總數比值為光感受器細胞凋亡指數(AI)。

13視網膜總RNA提取及RTPCR大鼠光照后立即取出眼球，解剖顯微鏡下小心剝離視網膜，參考Trizol試劑說明書常規提取總RNA，核酸蛋白檢測儀測定其含量和純度。-20℃保存備用。RTPCR按照逆轉錄試劑盒說明書進行，以大鼠βactin為內參，上游引物序列為5′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物序列為5′GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，退火溫度為554℃，產物長度為684bp；cfos上游引物序列為5′GCCTTTCCTACTACCATTCC-3′，下游引物序列為5′ATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3′，退火溫度為533℃，產物長度為370bp。擴增條件為94℃5min40s，各退火溫度45s，循環32次，72℃10min。2％瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像分析系統掃描以及分析。PCR特異條帶以相對吸光度×面積(mm2)表示，以各組的校正吸光度和其βactin校正吸光度的比值表示(V)。

14免疫印跡法測定視網膜cfos蛋白表達情況大鼠光照后立即取出眼球，剝離視網膜，常規方法提取總蛋白，Lowry法定量。總蛋白(40μg)經十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)(5％積層膠、12％分離膠)后，采用BioRad半干轉印儀將凝膠中的蛋白轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用cfos多克隆抗體(1摘要：150稀釋，北京中杉生物制劑公司)檢測膜上蛋白。BioRad凝膠成像分析系統分析相對表達量，以0h組蛋白表達量為內參，其他各個時相點灰度值和內參比值為相對灰度值(A)。

15統計分析采用SPSS100統計軟件進行方差分析。

2結果

21牛磺酸對光照后大鼠視網膜光感受器細胞凋亡的影響對照組光照6h后，發現棕褐色TUNEL陽性細胞散在分布于外核層(ONL)內部，即受損的多為視桿細胞，而牛磺酸組光照9h后才開始出現陽性細胞，隨光照時間延長，陽性感光細胞增多，光照24h后視網膜內核層、節細胞層也出現大量陽性細胞(圖1)。光化學損傷后AI隨光照時間延長逐漸增高，牛磺酸組光照12hAI值(123±47)％顯著低于對照組(324±62)％，其他時相點也顯著低于對照組(P%26lt;005)。

A摘要：對照組，光照0h；B摘要：對照組，光照9h；C摘要：牛磺酸組，光照9h

圖1牛磺酸對光化學損傷后大鼠視網膜光感受器凋亡的影響(TUNEL，×400)（略）

22牛磺酸對光照后大鼠視網膜cfos轉錄以及表達的影響

221牛磺酸對光照后大鼠視網膜cfosmRNA表達的影響光照后對照組和牛磺酸組大鼠視網膜cfosmRNA表達均出現一過性增高，且在光照1h達到峰值，隨著光照時間延長其表達逐漸降低，于6h光照后其表達量接近未光照水平(圖2)。利用灰度掃描計算V值發現，光照1h時牛磺酸組大鼠視網膜cfosmRNA較對照組表達低(P%26lt;005)。

222牛磺酸對光照后大鼠視網膜cfos蛋白表達的影響光照后2組動物視網膜cfos蛋白表達逐漸增高，于光照3h達到峰值，隨光照時間延長其表達量逐漸降低，光照12h其表達量接近未光照時水平(圖3)。A分析提示牛磺酸組3h蛋白表達相對量比對照組低(P%26lt;005)。

D摘要：對照組；T摘要：牛磺酸組

圖2不同光照時間對大鼠視網膜cfosmRNA表達的影響（略）

D摘要：對照組；T摘要：牛磺酸組

圖3不同光照時間對大鼠視網膜中cfos蛋白表達的影響（略）

3討論

視網膜光化學損傷后光感受器細胞丟失的機制尚存在一定的爭議，但大部分探究者認為，凋亡是光化學損傷以及其他視網膜變性疾病光感受器細胞丟失的主要機制〔3，5〕。本探究在前階段證實，4%牛磺酸能有效保護持續高強度光照〔(3000±20)lx，24h〕條件下大鼠視網膜基礎上，結合凋亡細胞生化特征，采用TUNEL法檢測凋亡細胞。實驗結果提示，牛磺酸減少了光照不同時相點凋亡指數，和其他探究報道〔6，7〕牛磺酸具有抗神經元凋亡功能相符。近年探究發現，AP1是調控光感受器細胞凋亡的重要影響因子，其亞基cfos是必需的調控因子〔3，8〕。AP1參和了許多生理過程如細胞增殖、分化、死亡及惡性轉化等，脂多糖、氧化應激、紫外線等均能增加其活性，并通過調節靶基因轉錄發揮功能〔7〕，其中，cjun／cfos二聚體形式的AP1復合物生物活性最強〔6〕。光損傷條件下cfos(-／-)大鼠光感受器細胞幾乎未丟失，以及大鼠、小鼠和661W光感受器細胞短期光照后cfosmRNA表達一過性增高，均說明cfos在光誘導光感受器細胞凋亡中促進凋亡功能〔3，8〕。本探究發現,牛磺酸組cfosmRNA以及蛋白表達峰值均比對照組低，推測牛磺酸可能通過抑制cfos表達，導致整個AP1復合物減少，阻斷凋亡信號轉導，從而有效保護光感受器細胞。文獻報道，TauCl能降低FLS細胞AP1活性，而牛磺酸不能〔9〕。因此，牛磺酸可能通過捕捉次氯酸(HOCI)形成TauC1，TauCl才是牛磺酸的活性形式，上述推論還需進一步證實。

參考文獻

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