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【摘要】目的：建立紫外分光光度法檢測血液中的氨濃度的方法，為臨床肝性昏迷、肝性腦病、重型肝病、尿毒癥等代謝障礙疾病的診斷提供參考。方法：血液離體后，立即加入定量過量的鎢酸鈉及硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時，血液中的氨與硫酸形成硫酸銨而存留于血濾液中，再以酚-次氯酸鈉顯色后于波長630nm處測定光密度OD值（以空白校正）。結果：血氨在20～60μmol/L范圍內濃度與OD之間呈良好的線性。結論：此方法快速、簡便，適合臨床檢測血氨的濃度。

【關鍵詞】血氨；方法學；光密度

正常人體內游離血氨（bloodammonia，BA）含量極低（正常值20～60μmol/L）［1］，其主要來源于體內蛋白質在代謝過程中產生的氨基酸，以及經脫氨作用分解而來的內源性氨，正常情況這種氨可形成酰胺及合成其他含氮化合物而不斷地被轉化；另一來源是蛋白質類食物在腸道內經細菌分解而成的外源性氨，正常情況下此氨經門靜脈進入肝臟被合成為脲，經腎臟排出體外。然而在發生代謝障礙性疾病，如肝性昏迷、肝性腦病、重型肝炎、尿毒癥等由于氨不能正常代謝排出體外而引起BA升高。肝功能極度衰竭或血液不能正常地流經肝臟轉換等嚴重肝臟疾病，氨不能從循環中及時清除均可使血氨增高［1］。高BA有神經毒性，BA的測定對于肝硬化門脈高壓、肝昏迷、Reve’s綜合征及兒科的一些先天性代謝紊亂等病的診斷、觀察和預后判斷有著重要意義［2］。BA的測定方法有微量擴散法、比色法、離子交換法、氨電極法、酶法等。筆者在結合本實驗室現有條件，參考國內外有關文獻建立快速、準確的檢測BA方法，為臨床該類疾病的診斷、治療提供參考。

1儀器與試劑

1.1儀器

電子天平COBS120型（朝鮮COBS公司），紫外分光光度儀HP8453（美國惠普），離心沉淀器800型（上海手術儀器廠），YKHI型液體快速混勻器（江西醫療器械廠），DHW420三用電熱恒溫水箱（北京東霞科學儀器廠）。

1.2試藥

鎢酸鈉（天津市大茂化學試劑廠，批號030906），硫酸銨（重慶北碚化學試劑廠，批號050329），亞硝基鐵氰化鈉（上海三愛思試劑公司，批號20020204），苯酚（重慶北碚化學試劑廠，批號：20000924），氫氧化鈉（重慶川江化學試劑廠，批號20000312），次氯酸鈉（重慶川東化工集團化學試劑廠，批號20040904），硫酸銨（重慶北碚化學試劑廠，批號050329），硫酸（重慶川江化學試劑廠，批號20000105），所用試藥均為分析純，水為新制無氨蒸餾水。

2方法與結果

2.1儲備溶液的配制［2］

無氨水的制備：參照文獻［3］取重蒸水1000mL，加稀硫酸1mL與高錳酸鉀試液1mL，蒸餾即得備用。

酚顯色劑：精取亞硝基鐵氰化鈉25.00mg，與適量苯酚混合后加無氨水至100mL,過濾即得。

堿性次氯酸鈉溶液：精取250mg次氯酸鈉，氫氧化鈉2500mg，溶于100mL無氨水中即得。

0.5mol/L硫酸溶液、5mmol/L硫酸銨溶液參照文獻方法［3］配制。

2.2標準溶液的配制

分別精取“2.1”項的硫酸銨儲備液20、200、500、1000、1500、2000、4000μL置于50mL容量瓶，立即加無氨水至刻度即得10、20、50、100、150、200、400μmol/L的硫酸銨系列標準溶液。

2.3標準曲線的制備

取“2.2”項的硫酸銨系列標準溶液各1mL，分別加入10%的鎢酸鈉溶液、0.5mol/L硫酸溶液各0.5mL，渦旋震蕩1min，4000r/min離心5min，分取上清液1mL，依次加入酚顯色劑和堿性次氯酸鈉溶液各1mL，渦旋1min后置37℃水浴20min，以空白管校正后于630nm處測定OD值；將所測得的吸收度OD值對濃度進行線性回歸處理得回歸方程：OD=0.0017C+0.23，相關系數r=0.9964，根據(NH4)2SO4與游離氨的定量關系，即得游離氨濃度在5～200μmol/L的定量線性范圍（見圖1）。

2.4臨床樣本的測定

參考國內外有關文獻，經優化后測定BA的方法為：離體血液立即加入過量定量的10%鎢酸鈉及0.5mol/L硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時，血液中的氨與硫酸形成硫酸銨而存留于血濾液中，再以酚次氯酸鈉顯色劑顯色后于波長630nm處測定OD值，即可定量測定BA。

2.5方法的回收試驗

按“2.2”項的方法分別配制高、中、低（400、200、40μmol/L）的硫酸銨標準溶液適量，各取1mL分別加入1mL無氨正常血漿，混勻后精密量取1mL按2.4項下的方法分別精密加入0.5mL10%鎢酸鈉和0.5mol/L硫酸溶液各0.5mL，以下按準曲線項下相應的方法處理并分別測定其OD值，將測得的OD值代入標準曲線計算測得量與回收率，結果見表1。表1血氨回收試驗（略）

2.6精密度試驗

配制低、中、高（25、50、75μmol/L）3個濃度含無氨正常血漿的硫酸銨溶液各3份，日內4℃冷藏保存，每間隔1h按2.3標準曲線項下的方法測定1次，連續測定5次。另取相同樣品18℃冷凍保存，每日測定1次，連續測定5日。所得OD值代入標準曲線方程計算得游離氨濃度，結果見表2。表2血氨精密度試驗（略）

2.7穩定性試驗

取硫酸銨溶液適量配制成75μmol/L含無氨正常血漿的硫酸銨溶液，分別置于4℃冰水浴和18℃條件下儲藏保存，每次平衡5min后各取1mL樣品，按“2.6”精密度試驗項下的測定方法，4℃下保存的標本在1d內每間隔2h測定1次，每次平行測定5份，直至14h共測定8次；18℃條件下保存的標本每天定時測定1次，每次平行測定5份，連續測定7d，將測得的OD值通過標準曲線方程計算游離氨的實際含量，結果見表3。由表可知新鮮血中游離氨極不穩定，常溫和4℃冷藏保存均不穩定，宜在2h內測定，在18℃下保存也宜在24h內測定。表3血氨穩定性試驗（略）

2.6臨床應用

選擇我院近2年來的住院患者，除外肝、膽、腎疾病患者。腦梗塞患者28例，其中男16例，女12例，平均年齡（55.8±10.5）歲；腦溢血患者25例，其中男15例，女10例，平均年齡（60.4±15.4）歲；腦炎患者10例，其中男6例，女4例，平均年齡（39.8±13.5）歲。全部病例均經臨床及CT和（或）MRI檢查。對照組25例，經檢查全部健康正常，其中男13例，女12例，平均年齡（57.2±14.3）歲。全部患者均在昏迷期及恢復期各采取肘靜脈血1～2mL，肝素抗凝，立即用上述方法測定血氨，對照組也同時采血測定血氨。

結果對照組血氨含量為（56.53±29.15）μmol/L，腦梗塞組昏迷期血氨含量為（179.00±108.59）μmol/L，恢復期為（66.89±26.67）μmol/L，昏迷期與對照組經χ2檢驗差異有統計學意義（χ2=12.68，P<0.05），恢復期與對照組相比差異無統計學意義（χ2=5.42，P>0.05）。腦溢血組昏迷期血氨含量為（146.97±72.41）μmol/L，恢復期為（60.46±24.39）μmol/L，昏迷期與和對照組比較差異有統計學意義（χ2=11.78，P<0.05），恢復期與對照組相比差異無統計學意義（χ2=4.68，P>0.05）。腦炎組昏迷期血氨含量為（197.17±62.10）μmol/L，恢復期為（59.83±39.59）μmol/L，昏迷期與對照組顯著增高（χ2=9.72，P<0.05），而恢復期與對照組相比差異亦無統計學意義（χ2=3.95，P>0.05）。

3討論

由表3結果表明：標本放置時間越長，其血氨濃度越高，主要原因可能是血液細胞自身代謝或部分微生物代謝后產生氨致使其血氨濃度升高。為保證測定結果的準確應注明標本的采集時間并立即送檢，送檢標本迅速測定（30min內），同時進行平行質控監測。病人標本采集后如不能立即測試，應在2～8℃冷藏最多3h測定，18℃冷凍保存最多24h測定。

正常情況下，體內大部分氨經過尿素循環形成尿素自尿中排出，部分為機體再利用，不會產生蓄積，而在尿素循環障礙疾病時則將出現血氨蓄積，在新生兒當血氨大于150μmol/L、嬰幼兒大于80μmol/L、成人大于70μmol/L可確定為高氨血癥［45］。血氨可干擾腦的能量代謝，腦組織在氨的生成中需消耗某些輔酶、高能磷酸及大量α酮戊二酸，引起高能磷酸化合物濃度的降低，過量氨還可能抑制丙酮酸脫氫酶活力而影響乙酰CoA的生成和乙酰膽堿的合成，干擾三羧酸循環，氨還可抑制Na+K+ATP酶，直接影響鉀、鈉在神經細胞膜上的正常分布，干擾神經傳導活動，當腦組織炎癥、缺血、缺氧時就影響了氨的代謝使氨增高。腦缺血后可導致生化代謝方面的變化，影響氨的平衡，腦組織內氨水平增高。有實驗表明，大鼠在腦循環中斷5min后，其缺血的皮層氨含量從對照值的0.28mmol/L升高到1.12mmol/L。在腦組織內，氨的解毒主要靠α酮戊二酸的氨化作用以及氨與谷氨酸結合生成谷氨酰胺，但后者的反應需要消耗ATP，在缺血情況下α酮戊二酸的氨化起主要作用。同時昏迷患者常常禁食，致使液體攝入減少或用脫水劑過量，從而致使血氨顯著增高。此外，由于感染、高熱等增加機體代謝，也使內源性血氨增高。國外學者KanamoriK等研究了小鼠體內的氨、谷氨酰胺以及谷氨酰胺合成酶與腦病的關系，表明腦病與氨相關［6］。國內李英杰等［7］測定22例腦梗塞患者的血氨和CSF氨含量，結果表明急性期血氨和CSF氨顯著高于對照組（P<0.01）梗塞面積與氨含量明顯相關。本文病例監測結果：患者組昏迷期血氨水平顯著高于恢復期和對照組（P<0.01），亦表明這一病理規律，提示對于腦血管病及腦炎患者、昏迷期患者，應注意檢查血氨，以了解患者的氨代謝情況。

【參考文獻】

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［2］孔祥云,徐勉忠.實用臨床醫學檢驗［M］.第1版.武漢:湖北科學技術出版社,1984:1121.

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［5］顧學范,葉軍.新生兒疾病篩查［M］.第1版.上海:上?？茖W技術文獻出版社,2003:227233.

［6］KanamoriK,RossBD,ChungJC,eta1.Severityofhyperammonemicencephalopathycorrelateswithbrainammonialevelandsaturationofglutaminesynthetaseinvivo［J］.Neurochem,1996,67:15841590.

［7］李英杰,顏京斌,黃勇華,等.腦梗塞患者血與腦脊液含量變化的研究［J］.中風與神經疾病雜志,1996,13(3):24