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【摘要】目的通過體外細胞培養(yǎng)技術，探討開口箭提取物的細胞毒活性，為進行深層次研究提供依據。方法采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法。結果開口箭甲醇提取物、總皂苷、30%總皂苷和70%總皂苷對HL-60和Caski細胞的抑制作用顯著，與陰性對照相比（P<0.05）,對HL-60細胞的抑制率達到60.12%，72.25%，89.09%，95.17%，其IC50為65.57，45.07，35.40，22.89μg/ml。對Caski細胞的抑制率達到63.94%，71.48%，62.49%，73.43%，其IC50為108.42，84.53，41.02，47.19μg/ml。結論開口箭提取物對HL-60和Caski細胞具有明顯的抑制作用。

【關鍵詞】開口箭；皂苷；MTT法；細胞毒活性

Abstract：ObjectiveToobservethecytotoxicitiesoftheextractsofTupistrachinensisBak.withinvitrocellculturetechnology,andprovideevidenceforthefurtherresearch.MethodsThecytotoxicitieswereassayedbyMTTmethodsonHL-60andCaskitumorcells.ResultsTheinhibitioneffectoftheextractsofTupistrachinensisBak.,totalsaponins,30%totalsaponinsand70%totalsaponinsonHL-60andCaskicellswereallprominent,comparedwiththenegativemodelgroup(P<0.05).TheirinhibitionratiosonHL-60tumorcellswereasfollows:60.12%,72.25%,89.09%and95.17%，andtheirIC50were65.57,45.07,35.40and22.89μg/ml.TheirinhibitionratiosonCaskicellswere63.94%,71.48%,62.49%and73.43%，andtheirIC50were108.42,84.53,41.02,47.19μg/ml.ConclusionTheextractsofTupistrachinensisBak.havesignificantcytotoxicityonHL-60andCaskitumorcells.

Keywords：TupistrachinensisBak.；Saponin；MTTmethod；Cytotoxicity

開口箭（TupistrachinensisBak.）系百合科Liliaceae鈴蘭族開口箭屬植物，為著名的傳統(tǒng)中藥，主治勞熱咳嗽、跌打損傷、風濕痹痛等癥，民間用于治療咽喉炎、扁桃體炎等。現證明開口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。

本實驗室通過實驗證實湖北省產開口箭含有甾體皂苷和甾體皂苷元,且含量較高［3］。皂苷具有增強免疫功能、抗輻射、抑制腫瘤生長、抗炎、降血糖等廣泛的生物學活性,近年越來越受人們的普遍關注。有研究證實開口箭同屬植物皂苷成分有細胞毒活性［4，5］。本文旨在通過體外抗腫瘤實驗,觀察開口箭提取物對HL-60和Caski細胞的細胞毒活性,現報告如下。

1材料

1.1細胞株人急性淋巴細胞性白血病細胞（HL-60）、人宮頸鱗狀上皮癌細胞(Caski)均由三峽大學免疫教研室提供。

1.2藥品與儀器RPMI-1640為美國GIBCO公司產品；新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產品；HEPES為美國Sigma公司產品，胰蛋白酶為美國GIBCO公司產品；四氮唑藍(MTT)為美國AMRESCO公司產品；絲裂霉素(MMC，浙江海正藥液股份有限公司，批號：051211)；酶聯(lián)免疫檢測儀(GENIOSTECAN)；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；LD4-2A離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；96孔板(美國Cornning公司)。

開口箭根莖于2002-07采自湖北省神農架林區(qū)，經三峽大學化學與生命科學學院陳發(fā)菊副教授鑒定為TupistrachinensisBak.，標本存放于湖北省天然產物研究與利用重點實驗室（編號：TC200207SNJ）。

1.3藥物制備開口箭根莖粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，濃縮后經石油醚脫脂用水飽和的正丁醇萃取，旋轉蒸發(fā)回收正丁醇，濃縮液抽干后即得到開口箭總皂苷，配成水液，過大孔樹脂柱，水洗，30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得開口箭四部分皂苷。

分別取開口箭甲醇提取物、開口箭總皂苷、30%開口箭皂苷、70%開口箭皂苷4個樣品，用含10%滅活的新生小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將其配制成所需濃度，依次為62.5,125,250,500,1000,2000μg/ml。絲裂霉素(MMC)用含10%滅活的新生小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置為250μg/ml。所有受試樣品均用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)HL-60和Caski細胞用RPMI-1640培養(yǎng)液（另加10mmol/LHEPES,2.0mg/mlNaHCO3，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁細胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2MTT比色法［6］按Mosmann氏法略加改進。將處于對數生長期的細胞制成單個細胞懸液，調整細胞濃度為0.8×105個/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種180μl，轉板6h后加20μl受試藥,另設陰性對照組(不加藥)、空白凋零組（只有培養(yǎng)基）和陽性對照組（MMC組），每組均設6個復孔，培養(yǎng)48h后加MTT(5mg/ml)15μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,棄去上清液，加DMSO100μl,用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀于492nm波長處測定吸光度(OD)值［7］,求出IC50。抑制率（%）=［1-（實驗組OD均值-空白組OD均值）/(對照組OD均值-空白組OD均值）］×100%。

2.3統(tǒng)計學處理實驗數據以±s表示，數據分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行。用Origin軟件，通過半對數擬合直線求IC50值。

3結果

3.1開口箭總提取物和總皂苷對HL-60細胞的影響結果見表1。

表1總提取物和總皂苷對HL-60細胞的抑制作用（略）

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；n=6

由表1可知開口箭總提取物和總皂苷對HL-60細胞的抑制作用顯著，與陰性對照組相比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），且呈良好的量效關系,總皂苷的抑制作用強于總提取物。

3.2開口箭30%總皂苷和開口箭70%總皂苷對HL-60細胞的影響結果見表2。

表230%總皂苷和70%總皂苷對HL-60細胞的抑制作用（略）

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；n=6

由表2可知開口箭30%總皂苷和70%總皂苷對HL-60細胞的抑制作用顯著，與陰性對照組比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。30%總皂苷最佳濃度為25μg/ml，其抑制率達89.09%，70%總皂苷對HL-60細胞的抑制作用雖藥物濃度的增加而增大，量效關系明顯。

3.3開口箭總提取物和總皂苷對Caski細胞的影響結果見表3。

表3開口箭總提取物和總皂苷對Caski細胞的抑制作用（略）

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；n=6

由表3可知開口箭總提取物和總皂苷對Caski細胞抑制作用明顯，與陰性對照組比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）,呈良好的量效關系，總皂苷的抑制作用強于總提取物。

3.4開口箭30%總皂苷和70%總皂苷對Caski細胞的影響結果見表4。

表430%總皂苷和70%總皂苷對Caski細胞的抑制作用（略）

與陰性對照組比較，**P<0.01；n=6

由表4可知，開口箭30%總皂苷和70%總皂苷對Caski細胞抑制作用顯著，與陰性對照組比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）,呈現一定的量效關系。

4討論

以上結果表明，開口箭甲醇提取物、總皂苷、30%皂苷和70%皂苷對體外培養(yǎng)的HL-60和Caski細胞株的抑制作用顯著，與陰性對照組比均有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），其細胞毒作用呈現較明顯的劑量依賴性。其中30%開口箭皂苷在25μg/ml時與同濃度下絲裂霉素作用于HL-60細胞的效果相當，70%開口箭皂苷在50μg/ml與絲裂霉素在25μg/ml濃度下作用于HL-60細胞的效果相當。藥理實驗顯示開口箭毒副作用小，因此開發(fā)其細胞毒作用有潛在價值。

開口箭總皂苷上大孔樹脂柱所得95%開口箭皂苷部分量較少，目前正在研究之中。至于不同的開口箭部位細胞毒活性存在差異，應與它們所含不同皂苷成分有關，還需要對其進行深入研究。

從植物中尋找抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物，在國內外均為抗腫瘤藥物研究的重要組成部分。據文獻報道開口箭對HepG2和S180細胞株亦有明顯的抑制作用［8］,本實驗室發(fā)現開口箭對HL-60和Caski細胞有較強的細胞毒作用，可見開口箭具有廣譜抗腫瘤作用，此外開口箭還有祛痰抗炎等作用。因此對開口箭的抗腫瘤作用及機制值得進一步研究。

【參考文獻】

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［3］黃麗,廖全斌,鄒坤,等.開口箭中甾體皂苷元含量的測定［J］.三峽大學學報·自然科學版,2003,25(6):562.

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［7］徐叔云.藥理實驗方法學,第3版［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002：1762.

［8］朱正光,余傳林,蔡晶,等.開口箭提取物的抗腫瘤作用研究［J］.中藥材,2006,29(3):277.