導語：甘草總黃酮含量測定論文一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的選擇適宜的對照品，建立能夠準確測定甘草中總黃酮含量的方法。方法針對甘草苷、柚皮苷、蘆丁3種對照品分別使用紫外分光光度法，通過全波長掃描，比較不同對照品和樣品與顯色前后的最大吸收波長，從而確定適合的對照品。結果甘草苷對照品和樣品液經過堿處理后最大吸收波長分別為334，334.5nm且全波長掃描后得到峰形基本一致，而柚皮苷對照品經過相同處理后最大吸收波長在419.5nm，蘆丁對照品和樣品分別經過Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2顯色后最大吸收波長在510nm和363nm。通過對3種方法的測定結果進行統計學分析，以甘草苷為對照品的測定結果分別與另外兩種方法差異顯著。結論選用甘草苷為對照品應用于紫外分光光度法測定甘草總黃酮成分準確度較高，是切實可行的含量測定方法。

【關鍵詞】甘草黃酮紫外分光光度法

Abstract:ObjectiveToselecttheappropriatestandardfordeterminationofflavonoidsinGlycyrrhiza.MethodsTocomparethelargestabsorptionwavelengthbywavelengthscanningofultravioletspectrophotometry.ResultsStandardLiquiritinandsamplesprocessedbyalkalihadthelargestabsorptionatthe334nmand334.5nmwavelength,andstandardNaringinatthe419.5nmwavelength.ConclusionTodeterminecontentofflavonoidsinglycyrrhizawithultravioletspectrophotometrybystandardLiquiritinisapracticalmethodwithhigheraccuracy.

Keywords:Glycyrrhiza;Flavonoids;Ultravioletspectrophotometry

甘草中的黃酮類成分包括黃酮類、二氫黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮類和雙黃酮類［1］化合物，其中以二氫黃酮類和查爾酮類含量較高［2］。二氫黃酮類包括：甘草苷(liquiritin)、甘草苷元(liquiritigenin)、新甘草苷(neoliquiritin)、甘草素（liquiritigenin）等，查爾酮類包括：異甘草苷(isoliquiritin)、異甘草素（isoliquiritigenin）、異甘草苷元(isoliquiritigenin)、新異甘草苷(neoisoliquiritin)等［3～7］。而其中比例較大的成分以甘草苷為主［8］。

甘草總黃酮的測定常用蘆丁［9～10］、柚皮苷［11～13］為對照品通過紫外分光光度法進行測定，而《中國藥典》中甘草項下沒有規范總黃酮成分含量的測定方法［14］，導致甘草總黃酮成分有多種不同的測定方法。本實驗研究通過對不同測定方法進行考察，比較不同對照品和樣品采用相應方法顯色后的最大吸收波長，對3種對照品相應測定結果分析，確定最適宜甘草總黃酮含量測定的對照品和測定方法。

1器材

1.1儀器HITACHIU-2000Spectrophotometer。

1.2樣品甘草生藥樣品由北京中醫藥大學王文全教授提供和鑒定,全部為甘草GlycyrrhizauralensisFisch（樣品按來源依次編號為1.杭錦旗1年生；2.杭錦旗2年生；3.杭錦旗3年生；4.杭錦旗4年生；5.杭錦旗5年生；6.新疆烏蘇3年生；7.杭錦旗野生；8.杭錦旗野生橫生莖；9.甘肅金塔野生；10.寧夏鹽池野生；11.甘肅酒泉野生；除杭錦旗野生橫生莖外其余10份樣品均為根）。

1.3試劑供含量測定用甘草苷（編號：111610）、柚皮苷（編號：110722）：中國藥品生物制品檢定所；蘆丁對照品由北京中醫藥大學馬長華教授制備；氫氧化鉀(AR)、甲醇(AR)、硝酸鋁（AR）、亞硝酸鈉（AR）、氫氧化鈉（AR）。

2方法

2.1對照品溶液的制備精密稱定甘草苷、柚皮苷、蘆丁標準品適量,用甲醇溶解,分別定容于25，10，10ml容量瓶中,制得濃度為0.07504g·L-1的甘草苷對照品溶液、0.968g·L-1的柚皮苷對照品溶液和1.003g·L-1的蘆丁對照品溶液。

2.2樣品的提取取甘草粉末適量,精密稱定,加甲醇50ml,稱重,（250W,20kHz）超聲提取80min,稱重,補足損失重量,過濾,收集續濾液,即得。

2.3測定方法

2.3.1甘草苷為對照品的測定方法精確吸取提取液0.5ml,加入1ml甲醇,其中一份加入10%KOH溶液0.5ml顯色,室溫放置5min,用甲醇稀釋至10ml，以相應溶劑為空白，在λ334nm處測定吸收度。

2.3.2柚皮苷為對照品的測定方法供試液制備同“2.3.1”項，在波長419nm處測定吸收度。

2.3.3蘆丁為對照品的測定方法精確吸取提取液0.5ml，加3ml蒸餾水，5%亞硝酸鈉溶液0.5ml放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.5ml，混勻后放置6min，加5%氫氧化鈉2.5ml混勻，放置15min后蒸餾水定容至10ml。以相應溶劑為空白，在波長510nm處測定吸收度。

2.4方法學考察

2.4.1以甘草苷為對照品方法學考察甘草苷方法標準曲線的測定：精確吸取甘草苷對照品溶液0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5ml置6個10ml容量瓶中,按“2.3.1”項下操作。以吸收度A為縱坐標,對照品的濃度C(mg/ml)為橫坐標,得線性回歸方程:y=66.753x-0.0178,r=0.9999,線性范圍為18.76～112.56μg。顯色30min內穩定。

甘草苷方法重復性實驗：取6份新疆烏蘇3年生人工栽培甘草粉末按“2.2”項下制備，按“2.3.1”項下方法測定。黃酮平均含量為3.33%，RSD=3.23%,（n=5）。

甘草苷方法加樣回收率實驗：取5份新疆烏蘇3年生人工栽培甘草粉末按“2.2”項下制備后分別精密量取已知總黃酮含量的提取液0.5ml，加入一定量甘草苷對照品溶液，λ334nm處測定吸收度。計算回收率,結果平均為98.7%,RSD=2.0%,（n=5）。

2.4.2另外兩種測定方法的方法

學考察柚皮苷標準曲線以吸收度A為縱坐標,對照品的質量m（mg）為橫坐標,得線性回歸方程y=0.0048x-0.0157，r=0.9993，線性范圍48.4～290.4mg，重現性RSD=1.38%（n=5），加樣回收率98.73%RSD=1.35%（n=5）；顯色30min內穩定。蘆丁標準曲線：以吸收度A為縱坐標,對照品的質量m（mg）為橫坐標,得線性回歸方程y=1.3163x-0.0063,r=0.9987，線性范圍0.1003～0.6018mg，重現性RSD=0.97%（n=5），加樣回收率101.35%RSD=3.57%（n=5）。顯色30min內穩定。

3結果和討論

3.1不同對照品吸收峰比較分析通過實驗測得甘草提取液樣品經KOH顯色后的最大吸收波長在334.4nm（圖1），甘草苷對照品KOH顯色后于200～500nm波長處掃描,最大吸收波長在334nm左右（圖2），二者相符。

柚皮苷經過KOH顯色后于200～500nm波長處掃描，最大吸收283.5nm紅移到419.5nm（見圖3），與樣品顯色后最大吸收波長不一致。

樣品通過Al2(NO3)3-NaOH-NaNO2方法顯色后最大吸收波長在363nm處（見圖4），蘆丁對照品通過Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2方法顯色后最大吸收波長在510nm左右，兩者相距甚遠。

3.2不同對照品方法實測結果比較分析對11份樣品依“2.2”項下制備，分別依據甘草苷、柚皮苷和蘆丁的顯色方法在不同波長處進行測定，結果見表1。表13種方法總黃酮含量測定結果（略）

通過使用SPSS10.0對表3中數據進行多因素方差分析，3種方法測定結果方差分析F值17.845，P≈0.000說明3種方法測定結果有差異，兩兩比較結果見表2。表2不同方法測定結果間黃酮含量均數的兩兩比較（略）

按α=0.05水準，柚皮苷方法和蘆丁方法測定的黃酮含量均數比較無統計學差異，而甘草苷方法分別與其他兩種方法測定結果差異顯著。柚皮苷和蘆丁方法測定結果分別較甘草苷方法測定結果低29.6%和28.1%。

3.3超聲提取時間考察在確定對照品等方法的基礎上我們對樣品提取時間進行了考察，分別對超聲50，60，70，80，90，100min的樣品進行測定，發現黃酮百分含量與時間關系如圖6，隨著時間的增加，黃酮百分含量有所提高，但達到80min后，升高趨勢明顯變緩，考慮到實驗效率和成本，我們采用80min作為提取時間。

4討論

在對照品的選擇上,由于蘆丁屬于黃酮類化合物（結構為5、7、3''''、4''''-四羥基黃酮-3-蕓香糖苷）,甘草中黃酮成分主要為二氫黃酮,其次為查爾酮,蘆丁在結構上差異較大,因此不適合用于甘草總黃酮成分測定。柚皮苷（結構為5、7、4''''-三羥基二氫黃酮）雖然是二氫黃酮類化合物，但同甘草苷(結構為7-羥基二氫黃酮-4''''-葡萄糖苷)相比，除都具有7位羥基外，還有5位的游離羥基，且4''''位的羥基是游離的，未結合成苷，結構上的差異，導致與堿反應后最大吸收波長紅移不一致，我們采用黃酮中含量最多的甘草苷為對照品，利用二氫黃酮與堿反應后生成查爾酮，由于帶I吸收較弱，不靈敏，因此用帶II最大吸收紅移到330nm左右進行黃酮成分的含量測定。

在選定以甘草苷為對照品的基礎上，我們進一步進行了顯色方法的考察，嘗試鹽酸鎂粉法進行測定，考察了鎂粉用量、加熱時間和溫度對顯色的影響，發現同樣條件顯色后甘草苷標準品和樣品均在560nm左右有一吸收峰，然而樣品在467nm處一吸收峰對其造成干擾（見圖5）。

黃酮作為重要的藥效組分在甘草中有著豐富的種類和較高的含量，如果不采用適宜的測定方法會使結果偏離真實值，從而影響我們對甘草質量客觀真實的評價。

【參考文獻】

［1］HongBAI,WeiLI,bKazuoKOIKE,etal.ANovelBiflavonoidfromRootsofGlycyrrhizauralensisCultivatedinChina［J］.ChemicalandPharmaceuticalBulletin,2003，51(9):1095.

［2］張雪輝.甘草中總黃酮的含量測定［J］.中國中藥雜志,2001,26(11):746.

［3］朱緒民,邸迎彤,彭樹林,等.烏拉爾甘草中的化學成分［J］.中草藥，2003,34(3):199.

［4］沈鳳嘉,胡金峰,虞亞川,等.烏拉爾甘草化學成分的研究［J］.高等學校化學學報，1995,16(4):572.

［5］高鴻霞,邵世和,王國慶.中藥甘草研究進展［J］.井岡山醫專學報，2004,11(5):8.

［6］TaroNomura,ToshioFukai,ToshiyukiAkiyama.Chemistryofphenoliccompoundsoflicorice(Glycyrrhizaspecies)andtheirestrogenicandcytotoxicactivities［J］.PureandAppliedChemistry,2002,74(7):1199.

［7］IsaoKitagawa.Licoriceroot.AnaturalsweetenerandanimportantingredientinChinesemedicine［J］.PureandAppliedChemistry,2002,74(7):1189.

［8］何三民,石森林.HPLC法測定甘草中甘草素、異甘草素、甘草苷的含量［J］.中草藥，2003,34(7):618.

［9］孫萍.甘草總黃酮的微波提取及含量測定［J］.時珍國醫國藥,2003,14(5):266.

［10］呂欣.紫外分光光度法測定甘草黃酮含量［J］.植物研究，2003,23(2):192.

［11］汪河濱.甘草中黃酮的超聲提取及含量測定［J］.時珍國醫國藥,2004,15(12):815.

［12］封士蘭.甘草黃酮的提取分離和含量測定［J］.蘭州醫學院學報，1998，24(4):20.

［13］李炳奇，汪河濱，李學禹，等.超聲聯合法提取甘草黃酮和甘草酸的研究［J］.山東中醫雜志，2005,24(1):38.

［14］國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部［S］.北京:化學工業出版社,2005:59.