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【摘要】目的研究涼燥對小鼠的主要致病機制。方法216只無特定病原體級（SPF）昆明小鼠隨機分為常溫常濕組（A組），常溫燥組（B組），涼燥組（C組），每組72只。在模擬涼燥條件下造模，第7天與第14天檢測氣道與皮膚組織病理、氣管纖毛運動、氣道液分泌（RS）與氣道液IgG抗體（IgGR）、血液流變學、細菌攻擊實驗與氣管細胞bcl-2基因、bax基因表達。結果與A組相比，C組第14天氣管、肺與皮膚病變明顯，肺細菌數增高，IgGR增高，第7天RS降低（P<0.01），血液流變學影響不明顯，但氣管細胞bcl-2基因表達下降。結論涼燥傷肺、傷津，致氣道“纖毛-黏液毯”局部御邪屏障受損；肺津凝滯于肺，以致宣輸失司則皮膚失養。本結果為涼燥致病提供實驗資料。

【關鍵詞】涼燥致病機制

Abstract：ObjectiveToinvestigatethepathogeniceffectsofCool-Dryonmice.Methods216Kunmingmice(SPF)weredividedintothreegroupsincludinggroupA(normalmice),groupB(normaltemperatureandOuterDrymice),groupC(Cool-Drymice),72mice/group.RespiratorysecretionofMucopolysacchride(RS),IgGofRespiratory(IgGR)，hemorrheology，BacterialattackingandExpressionofbcl2，baxgeneweretestedinday7and14.ResultsIngroupCthepathologrealchangesofrespiratoryandskinswereobvious,andbacilliaquantityoflungincreased,bcl2geneexpressionwasreducedsignificantlycomparedwithgroupA(P<0.01).ConclusionIthasfirstprovidedtheevidencesofCoolDrythatinjuredthewindpipeandskinsandthedefencedof“lanketofCilla-mucus”andreducedtheexpressionofbcl-2gene,whichwasrelatedtothemechanismsofCoolDry.

Keywords：Cool-Dry;Pathogenicmechanism

燥氣清冷肅降，肅殺收引，“燥氣先傷于華蓋”，易傷津液。“秋深初涼，西風肅殺，感之者，多病風燥，此屬燥涼，較嚴冬風寒為輕。”外燥有溫燥與涼燥之分，但未見涼燥病機系統性實驗研究報道。在相關研究中證實外燥致小鼠氣道病變的基礎上［1］，本文研究涼燥及相兼細菌攻擊對小鼠氣管纖毛運動、氣道液分泌與氣道液IgG抗體、血液流變學及氣管細胞bcl2基因，bax基因表達等影響，為闡析涼燥致病機制提供資料。

1材料與方法

1.1動物

無特定病原體級（SPF）昆明種小鼠216只，體重（18±1）g，雌雄各半，湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2003-2005。

1.2儀器與試劑

LRH250人工智能氣候箱（溫度：（30～65±1）℃，相對濕度：（30～90）%±5%，廣東醫療器械廠），XSJD恒溫倒置顯微鏡（重慶顯微鏡廠），CS501超級恒溫器（重慶實驗儀器廠），756MC紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），FASCO全自動血液流變儀（重慶南方醫療設備公司）。咔唑（批號：054K078，Sigma公司），D-葡萄糖醛酸內酯（批號：2711EC，Sigma公司），四硼酸鈉與臺氏液試劑、10%甲醛、HE染料（分析純，批號：050108）上海精細化工科技有限公司。TUNEL試劑盒（MK1020，200503）、bcl2兔抗鼠IgG多抗（BA0412，200503）、bax兔抗鼠IgG多抗（BA0315，200503）和陽性對照片由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3菌株

金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC25923，北京天壇生物制品公司)。

1.4方法

1.4.1動物模型及分組

216只昆明小鼠隨機分為常溫常濕組、常溫燥組、涼燥組，每組72只，分批置人工氣候箱內、用昆明種小鼠飼料常規飼養。按表1模擬外燥“溫度相對濕度風”條件進行造模。各組第7天和第14天進行檢測前4h禁食、禁水。表1各組小鼠“溫度－相對濕度－風”處理條件（略）

1.4.2病理組織學觀察

斷頸處死小鼠，常規取氣管1.5cm，右肺組織（中）（40±10）mg/只、背部皮膚（0.5cm×0.5cm）及左足墊皮膚，HE染色、鏡檢。

1.4.3氣管上皮纖毛運動實驗（CiliamovementofTrachealEpithelium,CM,min/mm）：按文獻方法［2］。

1.4.4氣道液黏多糖（RespiratorysecretionofMucopolysacchride,RS,μg/ml）測定：咔唑比色法，參考文獻方法［2］。

1.4.5氣道液IgG（IgG-R）檢測

常規氣管插管，取灌洗液分離上清，按酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒說明書檢測。以包被液作空白對照，PBSpH7.4（10%小牛血清）作陰性對照。每份樣品檢測3次，記錄標本均值與陰性對照（P/N）倍數之平均值。

1.4.6血液流變學檢測［3］

受血液流變儀對血量標本的限制，每組取9只小鼠眼球血合為1份標本進行測試，3份/組。肝素抗凝管取眼球血，4h內測定血漿黏度、紅細胞聚集指數、紅細胞剛性指數。

1.4.7細菌攻擊實驗

取培養18h金黃色葡萄球菌，經標準比濁法配成細菌懸液（1×108cfu/ml），各組小鼠于第7天經鼻常規滴種金黃色葡萄球菌0.1ml/只，24h后重復1次。接種細菌第6天無菌取小鼠右肺（40±10）mg/只常規檢測肺細菌數（BacilliaQuantity,BQ，1×106cfu/g取均值），以及RS與IgGR［4］。

1.4.8氣管細胞凋亡檢測

第14天取氣管切片，按脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）試劑盒程序操作。結果判斷：氣管上皮細胞核內出現棕黃色顆粒為TUNEL染色陽性。鏡下隨機計數200個細胞，計算：

細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數200×100%

1.4.9氣管細胞bcl-2基因，bax基因表達檢測第14天常規取氣管標本切片、按試劑盒說明書操作。結果判斷：氣管上皮細胞漿內出現棕黃色顆粒為bcl-2（或bax）表達陽性。鏡下計數500個細胞，計算：

陽性指數（PI）=陽性細胞數記數細胞數×100%

1.4.10統計學處理

實驗數據以±s表示，采用SPSS13.0軟件，資料之間比較用ANOVA分析，顯著性檢驗采用多個樣本均數間q檢驗（Newman-Keuls法）；各組第7天與第14天比較用t檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義，檢驗水準為雙側α=0.05。

2結果

2.1氣管、肺結構觀察常溫常濕組第7、第14天氣管上皮結構完整、纖毛整齊，氣管腺體、細支氣管與肺泡未見異常，背部皮膚結構完整，毛球數多，新生毛干數豐富且層次清晰，足墊皮膚汗腺豐富。常溫燥組第14天部分氣管纖毛倒伏、黏連，肺泡輕度淤血，皮膚未見異常；涼燥組第14天氣管上皮鱗狀化生，氣管纖毛多呈灶狀缺損，≤20%氣管漿液腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水腫明顯，均較第7天嚴重；背部皮膚無明顯異常，但足墊部皮膚腺體明顯減少與皮下結締組織增生。

2.2涼燥對氣管上皮纖毛運動（CM）、氣道液黏多糖（RS）與IgGR的影響結果見表2。表2涼燥對小鼠氣管纖毛運動、氣道液黏多糖與IgG-R的影響(略)

2.3涼燥對小鼠血液流變學的影響見表3。與常溫常濕組比較，涼燥組血液流變學指標改變無顯著性。表3涼燥對小鼠血液黏度的影響(略)

2.4涼燥相兼細菌攻擊對小鼠肺細菌數（BQ）、呼吸道液黏多糖（RS）與IgG-R的影響見表4。表4細菌攻擊對涼燥小鼠BQ、RS與IgG-R的影響（略）

2.5涼燥對氣管細胞凋亡與bcl-2基因、bax基因表達的影響見表5。表5涼燥對小鼠氣管上皮細胞bcl-2、bax基因表達與細胞凋亡的影響(略)

3討論

按表1條件處理，病理檢查可見涼燥組第14天氣管上皮鱗狀化生與炎性細胞浸潤，氣管纖毛多呈灶狀缺損，肺泡充血、水腫明顯，表明涼燥傷肺、傷津，肺失其濡養而致組織細胞結構受損；≤20%氣管漿液腺上皮黏液腺化生，提示與涼燥肺津生成障礙相關；足墊皮膚汗腺明顯減少與結締組織增生等，表明肺宣輸失司、皮毛腠理失之濡潤，合以衛表不固，致“燥氣先傷于華蓋”。本結果為涼燥致病提供組織學證據。

氣道液內含黏蛋白（主為黏多糖和蛋白質），覆蓋于黏膜表面形成黏液毯，是氣道的重要保護性屏障之一；RS與氣道液分泌呈正相關，其主要作用是濕潤氣道黏膜、保護上皮的纖毛運動。與常溫常濕組比較，涼燥組第7天RS減少，顯示涼燥早期氣道液分泌嚴重減少而具“干”之特點。值得注意的是涼燥組第14天RS明顯增多（P<0.01），其機理可能是涼燥之邪的涼氣可傷肺陽而致肺津不化、凝聚成痰飲，故氣道液明顯增加。氣道纖毛受“涼凝”之氣道液刺激而病理性運動加快。涼燥組細菌攻擊后RS明顯減少，也提示生物病原攻擊可加重氣道分泌障礙與“正氣”受損［5］。IgG-R是氣道重要免疫防御成分之一，涼燥組第7～14天以及細菌攻擊后RS增高，與機體的保護性反應有關。涼燥相兼細菌攻擊，外則衛滯邪郁，內則津少氣虛，抗邪無力則病邪入里；肺津不化則凝成痰飲，細菌及其毒素可加重肺津生成障礙與宣輸失司更甚，加之氣道局部御邪屏障受損則對生物病原攻擊的敏感性增高，但故涼燥組肺細菌數是常溫常濕組的7.1倍，結果提示涼燥病機之一與損傷氣道分泌與“纖毛-黏液毯”有關。涼燥組血液黏度變化不明顯，但紅細胞剛性指數增高，提示血液運行障礙，其機理有待研究。

bcl-2屬于低豐度表達基因，編碼的bcl-2/bax家族蛋白如bcl-2/bax二聚體為抑制細胞凋亡構型，bax/bax二聚體可誘導細胞凋亡。結果顯示，常溫常濕組與涼燥組氣管細胞凋亡率均較低（≤0.3%），但涼燥組氣管bcl-2陽性細胞多見于氣管纖毛缺損或鱗狀上皮化生處，提示與涼燥致病機制相關。

結果表明，涼燥主要病機可能是：涼燥傷津，涼燥之邪的涼氣可傷肺陽而致肺津不化，凝集成痰飲，合以宣輸失司，皮毛腠理失養而致衛表不固；肺津生成銳減，氣道“纖毛-黏液毯”生物防御屏障受損，合以對生物病原攻擊敏感性增加等綜合因素致病。涼燥致氣管細胞bcl-2基因表達下調與涼燥致病機制的相關性值得研究。

【參考文獻】

［1］丁建中，張六通，邱幸凡，等.外燥對小鼠氣管上皮纖毛運動與呼吸道液分泌的影響［J］.中醫雜志，2006，48（8）：607.

［2］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學實驗方法，第3版［M］.北京：人民衛生出版社，2002：1360.

［3］童一秋.醫院體檢化驗檢驗技術標準數據解讀實用手冊［M］.吉林：吉林音像出版社，2003：382.

［4］許滸，許燕萍，黃慶華.細胞感染對大鼠呼吸道上皮細胞緊密連接蛋白的影響［J］.中華結核和呼吸雜志，2002，25（5）：306.

［5］湯毅.傷津證與生津法初探［J］.中醫雜志，2005，46（8）：628.