導(dǎo)語：小議銅綠假單胞菌整合子與多重抗藥性探索一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的在銅綠假單胞菌中檢測1類整合子并分析整合子對細(xì)菌耐藥性的影響。方法用VITEK-AMS微生物自動(dòng)分析儀鑒定細(xì)菌和藥敏試驗(yàn)，用PCR方法擴(kuò)增I類整合酶基因，經(jīng)電泳后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果158株銅綠假單胞菌中檢測出1類整合子42株，檢出率為26.6%。1類整合子陽性菌對氨基糖苷類、喹諾酮類及頭孢菌素類藥物表現(xiàn)出較高的耐藥率。攜帶1類整合子菌株易表現(xiàn)出對至少4種抗菌素的多重耐藥性，其多重耐藥率為68.6%(33/48)，明顯高于1類整合子陰性菌株（28.6%），P＜0.05。結(jié)論1類整合子廣泛存在銅綠假單胞菌中,1類整合子對細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生和傳播起著重要作用，應(yīng)加強(qiáng)臨床細(xì)菌基因水平的耐藥監(jiān)測，采取有效措施防止耐藥性的傳播。

關(guān)鍵詞銅綠假單胞菌整合子多重耐藥

銅綠假單胞菌為條件致病菌，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一。患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可導(dǎo)致血行散播，而發(fā)生菌血癥和敗血癥。燒傷后感染了銅綠色假單胞菌可造成死亡。隨著抗生素的廣泛使用和不合理使用，使包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的多種細(xì)菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重。

整合子是與細(xì)菌耐藥性傳播有關(guān)的基因系統(tǒng)，整合子通過捕捉和整合細(xì)菌耐藥基因，在細(xì)菌耐藥性的傳播和擴(kuò)散中起了重要的作用。整合子通過位點(diǎn)特異性的基因重組可整合多種耐藥基因?qū)?xì)菌多重耐藥的形成起著重要作用。

本文對158株銅綠假單胞菌進(jìn)行分析，以探討銅綠假單胞菌整合子與其多重耐藥性之間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

2009年10月～2010年5月從我院臨床標(biāo)本中分離的銅綠假單胞菌158株。標(biāo)本分別來自老年病房(53株)、呼吸科病房（49株）、普外科病房(28株)、泌尿科病房(16株)和內(nèi)分泌病房(12株)。菌株分別分離自痰標(biāo)本（68株）、膿汁(42株)、咽拭子(18株)、尿標(biāo)本(12株)、傷口分泌物（10株）和血液（8株）。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌（ATCC27853）。攜帶1型整合子銅綠假單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室分離株經(jīng)測序證實(shí)，作為PCR實(shí)驗(yàn)陽性對照。

1.1.2鑒定卡片

全自動(dòng)微生物分析儀(VITEK-AMS)采用的GNI鑒定卡、GNS藥敏卡均購自法國Biomerievx公司,GNS藥敏卡包括氨芐青霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、復(fù)方新諾明、頭孢噻肟、亞胺培南11種抗菌藥物職稱論文。

1.1.3PCR試劑

TaqDNA聚合酶,4種dNTP混合液,DNA分子標(biāo)準(zhǔn)參照物購自Takara公司;瓊脂糖,溴化乙啶等常用分子生物學(xué)試劑購自上海生工公司。

1.1.4主要儀器

VITEK-AMS自動(dòng)鑒定系統(tǒng)購自法國Biomerievx公司;PCR擴(kuò)增儀、DNA/RNA/proteinanalyzer分析儀和高速低溫離心機(jī)購自德國eppendorf公司;PCR電泳儀為北京崇文東方儀器廠產(chǎn)品;DGW-99型臺式高速微型離心機(jī)為寧波新芝科器研究所產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株鑒定

所有菌株都用VITEKAMS分析儀GNI細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行菌種鑒定。體外藥物敏感試驗(yàn)：采用GNS檢測卡測定13種抗菌藥物對158株銅綠假單胞菌的MIC值，操作方法按照VITEKAMS規(guī)定的方法進(jìn)行。

1.2.2加熱裂解法制備DNA模板

:用Luria-Bertani液體培養(yǎng)基200r/min振蕩培養(yǎng)8h獲得對數(shù)生長期菌株。攜帶1型整合子銅綠假單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室分離株經(jīng)測序證實(shí)，作為PCR實(shí)驗(yàn)陽性對照。

1.2.3篩選1型整合子陽性菌株

用PCR方法擴(kuò)增整合子可變區(qū)，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可變區(qū)下游引物aagcagacttgacctgat，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50ulPCR反應(yīng)體系為:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下94℃預(yù)變性4分鐘；94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分鐘，循環(huán)35次；最后72℃延伸10分鐘。

1.2.4PCR反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下拍照記錄結(jié)果。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有顯著差異。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS10.0。

2結(jié)果

2.11類整合子基因檢測結(jié)果

全部158株銅綠假單胞菌的DNA上有42株檢測到I類整合子，占細(xì)菌總數(shù)的26.6%。1類整合子的大小分別為600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根據(jù)各株細(xì)菌質(zhì)粒DNA上檢測到1類整合子的大小和數(shù)目，細(xì)菌質(zhì)粒NDA上的整合子可分為5種整合子譜。

2.21類整合子陽性菌株與耐藥性的關(guān)系

對比1類整合子陽性菌株與陰性菌株對抗菌藥物的耐藥率，并做統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。

1類整合子陰性菌株對11種抗菌藥物完全敏感率為54.4%（86/158）。1類整合子陽性菌株更易表現(xiàn)出對青霉素、喹諾酮類、磺胺類藥物的耐藥。耐藥率最高的是復(fù)方新諾明（100%）其次為氨芐青霉素（90.5%）和慶大霉素（85.7%），丁胺卡那也表現(xiàn)出較高的耐藥率（76.7%）。1類整合子陽性菌株對6種藥物的耐藥率顯著高于陰性菌株，P<0.05。

2.31類整合子與多重耐藥率的相關(guān)性

多重耐藥率(耐4種以上抗生素)為62.0%(98/158)，其中1類整合子陽性菌株多重耐藥率占85.7%(36/42)，陰性菌株多重耐藥率為20.7%(24/116)。1類整合子陽性菌株多重耐藥率明顯高于陰性株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.23，P<0.01)。

3討論

整合子是存在于細(xì)菌質(zhì)粒、染色體或轉(zhuǎn)座子上的一種遺傳結(jié)構(gòu)，可以捕獲耐藥基因，使細(xì)菌表現(xiàn)為對抗生素的多重耐藥[1]給臨床治療帶來極大的困難。整合子本身不能移動(dòng)，但常作為轉(zhuǎn)座子的一部分或借助可移動(dòng)性質(zhì)粒在同種細(xì)菌或不同種細(xì)菌間播散，造成細(xì)菌耐藥性的擴(kuò)大，是細(xì)菌多重耐藥迅速發(fā)展的重要原因。根據(jù)整合酶的不同分為6類[2]在臨床分離的菌株中以1類合子最為常見。1類整合子基本結(jié)構(gòu)由三部分組成,兩端為高度保守的序列，分別稱作5’CS和3’CS,5’CS和3’CS之間為可變區(qū)，可變區(qū)由一個(gè)或多個(gè)外來插入的基因盒組成[3]。在整合酶的催化下．通過位點(diǎn)重組系統(tǒng)整合外來耐藥基因，使耐藥基因得到不斷的累積，從而使細(xì)菌具有耐藥性和多重耐藥性。目前在1類整合子中發(fā)現(xiàn)的基因盒已超過80種，大部分是耐藥基因盒，編碼產(chǎn)物可賦予細(xì)菌對幾乎全部臨床抗生素耐藥。

銅綠假單胞菌作為醫(yī)院感染的重要的條件致病菌，在長期應(yīng)用激素、免疫抑制劑，進(jìn)行腫瘤化療、放射治療等導(dǎo)致病人免疫功能低下，以及手術(shù)后或某些治療操作后的病人易導(dǎo)致本菌感染，該菌常常具有多重耐藥的特點(diǎn)，因此其所造成的感染難以治愈，病死率高。而近年證實(shí)整合子介導(dǎo)的多重耐藥基因也是造成銅綠假單胞菌多重耐藥的主要原因之一[4]。

本研究顯示，銅綠假單胞菌在呼吸道的感染占首位為54.5%（86/158），這與大多數(shù)文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)相符合[5]究其原因，可能與銅綠假單胞菌容易定植于呼吸道，且由于氣管插管、流感病毒感染及其他各種炎癥等因素?fù)p害了呼吸道黏膜，在鞭毛或蛋白酶作用下，細(xì)菌易于移生、粘附有關(guān)。傷口創(chuàng)面也較易受其侵害，檢出率32.9%（52/158），居第二位，與其存在廣泛及醫(yī)院環(huán)境的隔離消毒程度關(guān)系頗大。實(shí)驗(yàn)證明，我院患者分離的銅綠假單胞菌對多種抗生素出現(xiàn)高耐藥，尤其是表現(xiàn)出對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類以及磺胺類等的多重耐藥性，更是不容忽視。

研究表明1型整合子在銅綠假單胞菌耐藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制上起著重要作用，它是引起細(xì)菌多重耐藥的重要因素。由于抗生素使用量和種類日趨增多，使細(xì)菌生存面臨更大的抗生素選擇壓力。本次研究客觀反映了我院銅綠假單胞菌的整合子攜帶情況，分析本次結(jié)果發(fā)現(xiàn)在158株銅綠假單胞菌中檢出42株整合子陽性，檢出率為26.6%，與其他報(bào)道銅綠假單胞菌整合子檢出率不完全相同[6]，這可能是由于地域的不同所造成的，也可能與菌株的來源有關(guān)。整合子陽性的細(xì)菌表現(xiàn)出多重耐藥性比整合子陰性菌高，證實(shí)了整合子介導(dǎo)了多重耐藥性產(chǎn)生。但由于銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，耐藥性還與抗菌藥物作用的靶位改變、OprD蛋白缺失引起的菌膜通透性下降、菌體細(xì)胞膜上主動(dòng)外排泵系統(tǒng)的上調(diào)以及產(chǎn)生B一內(nèi)酰胺酶等機(jī)制有關(guān)，對于銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，以采取有效措施控制其耐藥性傳播。抗生素的使用越廣泛，使攜帶新耐藥基因的優(yōu)勢菌越多，并導(dǎo)致攜帶耐藥基因菌群量更大，為1類整合子多重耐藥細(xì)菌提供了選擇性壓力，可能使其耐藥種類更多，傳播更廣泛。因此，這種耐藥機(jī)制引起的細(xì)菌耐藥應(yīng)該引起臨床的足夠重視，加大監(jiān)測力度，預(yù)防醫(yī)院感染的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

1.王志銳，李力，張堅(jiān)磊，等.耐藥銅綠假單胞菌攜帶的整合子及其耐藥基因盒檢測分析。中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(7)：802～803

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3.楊維青，石磊，尹曉琳，等.不同地區(qū)銅綠假單胞菌第一類整合子和整合子相關(guān)基因盒的分布J..中國抗生素雜志，2006，31(1):15