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摘要:目的探討姜黃素衍生物c212對白血病細胞的周期阻滯和誘導凋亡作用。方法K562細胞分為低、中、高劑量實驗組和對照組(分別含1.5，3.0，4.5和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212)，HL－60細胞分為低、中、高劑量實驗組和對照組(分別含0.8，1.6，2.4和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212)。用噻唑藍法檢測細胞的生長抑制率，用流式細胞術檢測線粒體膜電位與細胞周期，用蛋白質印跡法檢測p53、p21和p27的表達水平。結果姜黃素衍生物C212對K562細胞24，48和72h的半抑制濃度(IC50)分別為(12.47±0.19)，(3.63±0.06)和(2.00±0.07)μmol·L－1;對HL－60細胞24，48和72h的IC50分別為(1.84±0.08)，(1.07±0.03)和(0.76±0.01)μmol·L－1。與對照組相比，4.5μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于K562細胞1，2和3h后，膜電位耗散的細胞從(2.43±0.78)%依次增加到(6.73±0.60)%，(18.30±0.54)%，(31.87±0.83)%;2.4μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于HL－60細胞1，2和3h后，綠色熒光部分細胞所占百分比比例從(2.27±0.57)%增加至(9.07±0.69)%，(15.37±0.77)%，(26.87±0.91)%。干預24h后，低、中、高劑量實驗組分別有(10.71±2.46)%，(25.45±2.10)%，(24.84±2.11)%的K562細胞和(13.85±2.12)%，(18.03±3.07)%，(21.40±1.94)%的HL60細胞阻滯于G2/M期。姜黃素衍生物C212劑量依賴性地上調周期調控蛋白p53、p27和p21蛋白的表達水平。結論C212一方面通過誘導白血病細胞線粒體膜電位的耗散，促使細胞凋亡;另一方面，可通過上調周期負調控蛋白水平，阻滯細胞周期，抑制白血病細胞的增殖。

關鍵詞:姜黃素衍生物C212;抗白血病;增殖抑制;線粒體膜電位

白血病是一類起源于造血干細胞惡性克隆性疾病［1］。姜黃素及其衍生物能夠明顯抑制白血病細胞的生長［2－3］。本實驗室發現一種新型的姜黃素衍生物C212可明顯抑制K562和HL－60細胞的增殖。本研究旨在探討姜黃素衍生物C212對白血病細胞的周期阻滯和誘導凋亡作用。

1材料與方法

1材料藥品與試劑姜黃素衍生物C212，純度:＞95%，本課題組對姜黃素進行結構改造合成。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)，均購自美國Sigma公司;JC－1細胞線粒體膜電位檢測試劑盒，南京凱基生物公司生產;β－actin單克隆抗體，美國SantaCruz公司生產;抗p21、p53等一抗，均為美國CST公司生產;BCA蛋白定量試劑、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G(IgG)二抗，均為美國Pierce公司生產。儀器CX31P－OC－1普通光學顯微鏡，日本Olympus公司產品;MicroplateReader450酶標儀、EPS600穩壓穩流電泳儀，均為美國Bio－Rad公司產品;FACSCantoⅡ流式細胞儀，美國BD公司產品;免疫印跡成像系統，美國Carestream公司產品。細胞株人慢性粒細胞白血病細胞K562細胞，人急性粒細胞白血病細胞HL－60細胞，均購自中科院上海細胞研究所。

2實驗方法

2.1細胞培養［4］K562和HL－60細胞培養在含10%胎牛血清、青霉素100U·mL－1和鏈霉素100μg·mL－1(1%雙抗)的RPMI1640培養液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養，取對數生長期細胞用于開展本實驗研究。2.2細胞分組與給藥方法25.00，12.50，6.25，3.13，1.56，0.78和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212分別作用于K562細胞和HL－60細胞24，48和72h，用于檢測姜黃素衍生物C212對細胞的生長抑制作用。將4.5和2.4μmol·L－1姜黃素衍生物C212(高劑量實驗組)分別作用于K562細胞和HL－60細胞1，2和3h，并設置未加藥空白對照組，用于檢測姜黃素衍生物C212對線粒體膜電位的影響。將K562細胞分為低、中、高劑量實驗組和對照組(分別含1.5，3.0，4.5和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212處置)，HL－60細胞分為低、中、高劑量實驗組和對照組(分別含0.8，1.6，2.4和0μmol·L－1姜黃素衍生物C212處置)，作用24h后，檢測姜黃素衍生物C212對細胞周期及周期調控蛋白表達的影響。2.3觀察指標2.3.1用MTT法檢測C212對K562和HL－60細胞的增殖抑制作用［4］取對數生長期K562細胞和HL－60細胞，稀釋至4×104cell·mL－1，接種于96孔板，每孔180μL，分別加入25.00，12.50，6.25，3.13，1.56和0.78μmol·L－1的姜黃素衍生物C21220μL作為實驗組及相同濃度的二甲基亞砜(DMSO)作為對照組，設置背景對照，每組均設定3個平行孔。藥物作用24，48和72h后，每孔加入5mg·mL－1MTT20μL，于37℃繼續孵育4h，以8000r·min－1離心5min，棄上清液，每孔加入DMSO150μL，震蕩10min，甲臜溶解后，于570nm處測定光密度(OD)值。細胞生長抑制率=(OD對照組－OD實驗組)/(OD對照組－OD背景孔)×100%。2.3.2用JC－1染色檢測C212對K562和HL－60細胞線粒體膜電位的影響［5］細胞分組和給藥方法同“2.2”，以1000r·min－1離心5min，收集細胞，重懸于1×IncubationBuffer500μL，37℃孵育20min。離心后，棄上清液，1×Incuba-tionBuffer洗2次，1×IncubationBuffer500μL重懸后轉移至流式管，4℃避光保存，在60min內上機檢測，JC－1是線粒體膜電位依賴性探針，線粒體膜電位正常時，其富集于線粒體以多聚體形式存在，發紅色熒光;當線粒體膜電位耗散時，JC－1以低聚體形式存在，發綠色熒光。JC－1紅綠熒光的比值變化反應C212對線粒體膜電位的影響。2.3.3用碘化丙啶(PI)染色檢測C212對白血病細胞的細胞周期的影響［6］細胞分組和給藥方法同“2.2”，以1000r·min－1離心5min，收集細胞，重懸于預冷的75%的乙醇5mL中，在－20℃下，固定24h。以5000r·min－1離心5min，棄上清液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗1遍，將細胞重懸于PI染色液(50μg·mL－1)，于室溫避光染色30min。將其轉移至流式管中，于4℃避光，保存在冰上，并在流式細胞儀上檢測。2.3.4用蛋白質印跡法檢測C212對p53、p21和p27蛋白水平的影響［4］細胞分組和給藥方法同“2.2”，收集細胞，用RIPA冰上裂解30min，以1.2×104r·min－1離心5min，收集上清細胞裂解液，進行BCA定量后，進行DSA－PAGE分離蛋白樣品后，經5%脫脂奶粉封閉1h，1×TBST洗3遍，4℃一抗孵育過夜，1×TBST洗3遍，HRP－IgG室溫孵育1h，1×TBST洗3遍后，進行顯影。

3統計學處理

用GraphPadPrism軟件和Origin8.5軟件進行One－wayanalysisofvariance實驗數據分析。結果用x珋±s表示。結果1C212對K562和HL－60細胞的時量效關系隨著時間延長，黃素衍生物C212對K562和HL－60細胞的抑制率逐漸增加，其對白血病細胞的增殖抑制作用呈劑量和時間依賴性，其中6.25μmol·L－1黃素衍生物C212作用于K562和HL－60細胞24，48和72h后，抑制率分別為(37.05±0.48)%，(59.61±1.66)%，(67.02±0.72)%和(63.63±1.23)%，(80.76±0.45)%，(90.43±1.73)%。黃素衍生物C212對K562和HL－60細胞24，48和72h的半抑制濃度(IC50)分別為(12.47±0.19)，(3.63±0.06)，(2.00±0.07)μmol·L－1和(1.84±0.08)，(1.07±0.03)，(0.76±0.01)μmol·L－1，且HL－60細胞對黃素衍生物C212更加敏感，具有比K562更低的IC50。結果見圖1。2姜黃素衍生物C212誘導線粒體膜電位的耗散4.5μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于K562細胞1，2和3h及空白對照組的綠色熒光部分細胞所占百分比分別為(6.73±0.60)%，(18.30±0.54)%，(31.87±0.83)%和(2.43±0.78)%;2.4μmol·L－1姜黃素衍生物C212作用于HL－60細胞1，2和3h及空白對照組的綠色熒光部分細胞所占百分比分別為(9.07±0.69)%，(15.37±0.77)%，(26.87±0.91)%和(2.27±0.57)%。與空白對照組相比較，高劑量實驗組能夠快速耗散白血病細胞的線粒體膜電位，差異均有統計學意義(均P＜0.05)。3各組白血病細胞(K562和HL－60)細胞周期比較隨著姜黃素衍生物C212濃度的不斷增加，G2/M期的K562和HL－60細胞比例也明顯隨之增加，差異均有統計學意義(均P＜0.05)，細胞被阻滯在G2/M期，見表1。4各組白血病細胞K562中p53、p21和p27蛋白表達水平的比較1.5，3.0，4.5μmol·L－1組和空白對照組白血病細胞p53蛋白相對表達量分別為0.69±0.04，0.66±0.03，0.72±0.02和0.38±0.02，p27蛋白相對表達量分別為0.60±0.03，0.73±0.03，0.92±0.05和0.33±0.02，p21蛋白相對表達量分別0.60±0.01，0.97±0.06，1.02±0.02和0.29±0.01。與空白對照組相比較，實驗組K562細胞中p53、p21和p27的水平均顯著性增加，呈劑量依賴性(均P＜0.05)。結果見圖2。討論在細胞凋亡的早期表現中，可以觀察到因線粒體膜的破裂，各種離子自由通過線粒體膜，使膜電位發生變化，細胞色素C(Cyt－C)被釋放進入細胞質中，激活Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。研究顯示，姜黃素衍生物C212能夠引起白血病細胞線粒體膜電位的耗散，預示著其可能誘導白血病細胞凋亡。據相關文獻報道，誘導細胞的衰老在抑制癌癥發生發展的初期具有重要意義［7］。p53/p21通路在調控細胞周期進展和細胞衰老中表現出重要作用［8］。p53蛋白是重要的抑癌因子之一，參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡及DNA損傷等重要過程［9］。p21基因是p53關鍵的下游靶標分子之一，能調控腫瘤細胞衰老的起始。p21與p53共同組成細胞周期檢查點，能降低受損傷DNA復制的機會，進而發揮抑癌作用。p53和p21蛋白在白血病細胞中的總表達率可達50%，所以，同時調控2種蛋白水平可以提高預測白血病預后的價值。另外，p27蛋白對細胞增殖的負調控的生物學功能，提示其可能作為一個抑癌候選基因，并且有報道說明了p27與白血病有著相關密切的聯系［10］。本實驗結果顯示，姜黃素衍生物C212能夠上調p53、p21和p27的表達，使受損傷的DNA不能進入復制狀態，導致細胞周期阻滯，姜黃素衍生物C212可能通過誘導白血病細胞的衰老來抑制增殖。

作者：沈云珠 劉碧 黃曉威 許建華