導語：如何才能寫好一篇基因工程載體的種類，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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學生做好這一模塊的題目，就需要從四個方面入手。即如何切入，何為重點，何為難點，如何改進。

關鍵詞：基因工程；復習；切入點；重難點；改進和調整

中圖分類號：G633.91 文獻標識碼：A 文章編號：1992-7711（2016）08-0005

在過去三年的江蘇高考卷中連續出現了三道基因工程方面的題目，而且分值較高。這就不禁讓筆者有理由推測明年的高考卷中勢必還會出現這種類型的題目，所以筆者在復習這一模塊時，特別總結了相關注意事項，并思考如何才能讓學生理清思路、游刃有余地把這一模塊的題做好。過去三年出的三道題目很類似，都是提供幾種限制酶識別序列及切割位點圖和轉基因操作流程圖，考查的重點問題都是限制酶對質粒和目的基因的識別與切割，以及切割后的重組問題，即目的基因的獲取和表達、載體的構建。那么，我們的學生要想做好這種題目，還需要形成哪些方面的認識呢？筆者認為在復習時應該從以下四個方面入手：

一、以肺炎雙球菌轉化實驗為復習的切入點

復習前先帶學生重新認知該實驗的過程，復習鞏固生物之間的自然的基因轉接過程。從學習角度分析，借助學生所熟知的原型，可以啟發、引導以實現溫故而知新。這個實驗是一個很好的認知原型，讓學生能夠感悟到大自然的鬼斧神工造就了自然發生的重組DNA，那我們人為地也可以改變，即我們的基因工程?；蚬こ痰牟僮鞒绦蛑饕ㄋ膫€步驟：目的基因的獲取，基因的表達與載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。其中，獲取目的基因和基因表達與載體的構建是整個工程的核心技術。這一技術涉及許多知識點，如DNA的結構、DNA的復制、限制酶和DNA連接酶及DNA作用與特性、基因的表達、載體的結構組成和作用等。因此，命題者可以從多個角度考查學生對這一系列知識的整體掌握程度及相關的能力。前幾年的題目都分別考查了不同的限制酶切割目的基因和質粒后可得到重組質粒的種類、目的基因導入質粒后對質粒結構和功能的影響、DNA水解酶、毒素蛋白與受體細胞中受體間的特異性結合、轉基因植物栽培中降低害蟲種群抗性基因頻率增長速率的措施等問題?；蚬こ虄热葜匾A性知識要求較高，涉及的知識和技術多，同一個問題還可以從不同的角度設置問題，筆者認為，教師在教學中、學生在學習中仍然要格外重視這部分內容。

二、基因工程是現代生物技術的核心內容

高中生物選修內容包括選修一《生物技術實踐》、選修二《生物科學與社會》、選修三《現代生物科技專題》。其中，選修三選擇了現代生物技術中深刻影響著人類社會的生活、生產和發展的四大工程：基因工程、細胞工程、胚胎工程、生態工程。由于基因工程是現代生物技術的核心內容，所以顯得尤為重要。因此，我們在給學生復習的時候要特別重視基因工程的復習，但在復習方法上要側重理論與原理，注重理解和應用，注重與必修內容、社會熱點、生物科技發展的最新成果的聯系，注重這些技術在農業、工業以及在醫療衛生事業上的應用，努力用已學的原理和技術去分析理解并解決其中的一些實際問題。復習的深度不宜過深，在操作技術上至少要求一般性了解，不宜過細。另外，微觀的技術要注意采用模擬操作的方法加強理解，宏觀的技術要盡可能走進工廠或研究所參觀學習，加強直觀理解，實在沒有條件的學校，要想辦法找一些視頻或錄像反復地觀看。只有做到理解，才能達到真正掌握和應用。筆者認為，學生之所以一直感到這部分內容難，主要原因就在于他們缺乏這一學習過程，而是局限于看書和記憶。所以，我們在復習這部分內容時一定要將這個過程給他們補上。

三、對雙基的掌握和分析、解決問題的能力是復習的重難點

近幾年的生物高考命題指導思想都強調以能力測試為指導，重點考查對基礎知識和基本技能的整體掌握程度，力求引導中學全面實施素質教育。這一指導思想通過近幾年的高考實踐已經得到充分的證明，也就是要求學生全面掌握《生物課程標準》和考試大綱規定的基礎知識和基本技能。這種整體掌握不但體現在必修和選修上，還體現在要求考生能在相對簡單的情境中綜合運用進行分析、判斷、推理和評價。這一指導思想表現在試題上為：知識覆蓋率高，注重基礎知識和基本技能，重點內容、主干知識的考查出現頻率高且相對穩定，試題的學科內、專題內和專題間綜合性強。那么，像基因工程這么重要的知識在近三年高考題中連續出現的現象就不足為奇了。事實上像遺傳規律的應用、人類遺傳系譜圖的分析、免疫、生態等內容也是連年考，但設置的問題和考查的角度不完全相同。這一指導思想要求我們學生既應踏踏實實地、全面系統地、重點突出地掌握基礎知識和基本技能，也要能從不同的角度去理解知識，要能挖掘知識之間的區別和聯系，并在不同的情境中運用知識。

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葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進入子代細胞;1909年baur和correns通過在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質體是母本遺傳的。人們便開始對葉綠體遺傳方面產生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉化了單細胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復光合作用能力,標志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發展前景的植物轉基因技術,在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。

1葉綠體基因工程概述

1.1葉綠體簡介

葉綠體是植物進行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細胞器,能夠進行自我復制,含有雙鏈環狀dna。葉綠體dna分子一般長120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個反向重復序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個大的單拷貝區(大小約80kb)和1個小的單拷貝區(大小約20kb)。

1.2葉綠體基因組轉化優點

葉綠體基因具有分子量小、結構簡單、便于遺傳的特點,故相對于傳統的細胞核遺傳更能高效表達目的基因,這是因為葉綠體基因本身擁有巨大的拷貝數[3]。葉綠體基因可實現外源基因的定點整合,避免位置效應和基因沉默;遺傳表達具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩定;目的基因產物對植物的影響小。利用葉綠體基因轉化的這些優點,可以加快育種速度和效率,節約育種時間。

1.3葉綠體轉化的主要過程

葉綠體轉化過程通常分4步:一是轉化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉化體系導入葉綠體;二是將外源表達框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉化的葉綠體細胞;四是繼代繁殖得到穩定的葉綠體轉化植物[4]。

1.4葉綠體轉化的主要方法

依據葉綠體轉化的主要過程,生物學家相應地研究若干種葉綠體基因轉化的方法,其中常用的葉綠體轉化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構建完整的質粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對重組葉綠體進行連續篩選,不斷提高同質化水平,最后獲得所需的轉基因植株[5]。二是農桿菌t-dna介導的遺傳轉化法。將外源目的基因、選擇標記基因等構建到農桿菌的ti質粒上,然后通過與植物組織或器官共培養,最后把所需外源基因轉化到葉綠體并獲得表達。三是peg處理法。只需將構建好的質粒(含外源基因、標記基因、同源片斷、啟動子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質體共培養。

2葉綠體基因工程的應用

2.1提高植物光合效率

植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉化為植物所需要的能量,從而轉變為人類需要的產品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費的能量[6]。很多科學家正試圖通過提高rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點整合試驗取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產高光合效率作物植物的最有價值的方法。

2.2合成有機物質

由于葉綠體型轉基因植物具有環境安全性好、底物豐富、產物區域化等優點,已被越來越多的人關注,并成為工業化生產特定有機物質的可靠場所。例如,有科學家已發明了用葉綠體基因工程表達聚3-羥基丁酸酯合成相關基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質,是自然界中多種細菌的碳源及能源儲備物。具有生物可降解性,如取代化學合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達盒的葉綠體整合及表達載體,通過基因槍轟擊法轉化煙草。northem點雜交、rt-pcr分析結果表明,葉綠體型轉基因植株中目的基因在轉錄水平的表達明顯高于核轉化植株中相應基因。

2.3生產疫苗

人類治療用蛋白質可以在葉綠體中實現表達,表達效率取決于外源基因的整合位點,增強轉錄和翻譯的調控元件以及外

源蛋白的穩定性等。人類已經在用葉綠體基因生產疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區和丙型肝炎病毒c區融合,并導入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達,且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經在葉綠體中轉化成功,預示著轉基因植物疫苗的可商業化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進行表達,為了增加mrna的穩定性及在煙草葉片內表達的可行性,他們將基因進行了密碼子優化,分別表達了未經改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達量分別為總可溶蛋白的25%和10%。

2.4在植物抗性方面的研究

在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報道bt表達量達46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼sod、apx等酶的基因已經轉入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對環境脅迫的耐受能力。

2.5葉綠體基因組在系統發育學上的應用

葉綠體在系統發育學上的優點:一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個較大的數據基礎;二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應用上很有價值。然而,用葉綠體dna研究系統發育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現象;二是雖然有越來越多的葉綠體dna被用作分子標記來研究類群間的系統發育關系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統的形態及生理特征結合起來獲得更多的信息,才能更接近系統發育的本來面目。

2.6葉綠體基因在消除環境憂慮問題上的前景

當今最為普遍的問題就是外源基因從轉基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴散,產生超級雜草或產生和其他作物之間的基因污染,對環境極為不利。葉綠體基因工程產生的基因逃逸現象的風險遠遠低于核轉化作物,因為大多數作物中的質體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對基因污染的憂慮。 　3葉綠體基因工程存在的問題

3.1葉綠體基因轉化在雜合體上的穩定性問題

由于高等植物的每個細胞中有10~100個葉綠體,每個葉綠體內有10~100個葉綠體基因組拷貝,因此轉化的葉綠體和未轉化的野生型葉綠體同時存在于轉基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩定的。在轉化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉基因植株易于同質化。

3.2植物的種類有待擴展

可能是由于大多數植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構建的同源重組片段和外源基因的插入位點。目前,已成功轉化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實的植物。

4展望

雖然在葉綠體基因工程領域人們已經取得了一定的進展,但對于改變葉綠體基因工程中所存在的缺點,科學界仍然要有大量的工作需要進行。為此,尋找更多更加合適的方法來改進葉綠體基因工程,使其優點更加明顯,必將在未來生物技術領域帶來又一場革命,為人類造福。

5參考文獻

[1] 劉良式.植物分子遺傳學[m].北京:科學出版社,1997.

[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.

[3] 李宏韜,趙淑青,趙彥修,等.葉綠體基因工程簡介[j].遺傳,2003,25(4):495-498.

[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.

[5] 沈桂芳,倪丕沖.植物葉綠體基因工程[j].高科技與產業化,1999(1):26-28.

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關鍵詞：植物疫苗；基因工程；表達系統；安全性

1 植物疫苗的免疫原理

植物疫苗可誘導粘膜免疫反應，小腸淋巴組織的粘膜上有一種特殊的細胞叫做膜細胞（M 細胞）。粘膜免疫應答就是由M 細胞識別抗原開始的。M細胞識別抗原并將其傳遞給巨噬細胞，巨噬細胞和其它抗原呈遞細胞，再將抗原展示給輔T細胞，輔T細胞識別外源蛋白質片段后就會刺激B細胞制造和釋放能中和抗原的抗體，當疾病因子出現時，記憶輔T細胞刺激胞毒T 細胞攻擊受感染的細胞，同時它迅速刺激記憶B 細胞分泌中和抗體消滅入侵的病原體?？偟膩碚f，轉基因植物疫苗可以誘導相應的血清型的IgA 和IgG 反應。

2 植物疫苗的特點

2.1 安全性高

植物是人類食物來源之一，除個別人群對某些特定的植物過敏外，其安全性高。用動物細胞生產疫苗，可能有動物病毒的污染，對人類存在潛在危害。而植物病毒不會感染人類，比較安全，同時也可避免微生物生產疫苗帶來的有害產物。

2.2 成本低

植物種植系統簡單易行，植物細胞培養條件簡單，便于進行遺傳操作，可通過大面積栽培獲得廉價的疫苗，且不需要技術、設備和種植條件等巨大投資。農作物可以當地生產，還易于儲藏和運輸，而且經過長期種植，植物栽培、收獲、貯藏、加工程序已經形成工業化。與植物生物反應器相比，原核生物反應器與動物生物反應器生產時需要昂貴的技術設備、大量的人力物力。

2.3 植物具有完整的真核表達系統

具有與動物相同的真核加工修飾系統。可以對重組蛋白進行糖基化、磷酸化、酰胺化、亞基正確裝配等。微生物系統不能對真核生物蛋白進行正確的翻譯后加工。

2.4 轉基因植物中的外源基因可重組

通過植物雜交的方法進行基因重組，進而在植物體內積累多種病原體的抗原基因，生產出方便高效的多聯疫苗。

3 植物基因工程疫苗外源基因的表達系統

3.1 瞬時表達系統

主要采用植物病毒作為載體，而外源基因插入到病毒基因組中，通過病毒感染植株，從而將外源基因導入植物細胞內，采用這種轉化方式，外源基因并不整合至植物基因組中，只是利用寄主細胞在細胞質中進行復制，以高拷貝的形式游離于植物中，并進行高效的表達，因此可在短時間內在植物細胞內積累大量的外源蛋白。采用農桿菌介導的轉化，外源基因蛋白的產量一般要低于細胞內可溶性蛋白總量的1%；而采用這種瞬時表達系統,外源基因蛋白總量會遠大于1%。

3.2 穩定整合系統

3.2.1 土壤農桿菌介導的遺傳轉化。目前根癌農桿菌主要用于雙子葉植物的遺傳轉化，其轉化植物的機制已從分子水平上基本得到解釋。而發根農桿菌，由于對Ri 質粒了解得還不充分，所以對這種轉化系統的研究主要集中在以生產次生代謝產物為目的的根組織培養和根的發育。采用農桿菌介導的植物轉化最常采用共培養法，即使用農桿菌菌液與葉盤、愈傷組織、懸浮培養細胞、莖段、下胚軸段、子葉切片等部分進行共培養，從而達到轉化的目的。

3.2.2 外源DNA 直接導入法。主要包括基因槍法、電激發、PEG誘導法、激光穿孔法、脂質體法、超聲波法，其中最常用的是基因槍法。它是將帶有外源基因的質粒用亞精胺包裹為直徑1μm 左右的金彈或鎢彈，再用高壓氦氣、火藥爆炸力、高壓放電氣體作為動力加速子彈，使它們穿過植物細胞壁和細胞膜，將外源基因帶入具有再生能力的植物組織，這樣可以在很大程度上縮短再生的時間，從而避免體細胞變異的發生。

4 以植物為載體的免疫技術

4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保護作用

由于植物疫苗一般是通過食用來被人體利用。所以如何避免消化酶的影響來保護抗原就是一個重要的研究課題。目前，避免消化酶的影響來保護抗原可分為2類方法：①用沙門氏菌和弧狀霍亂桿菌作為載體；②用保護性的包被對抗原進行包裝。

用減毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系統攝取所表達的抗原。但是基于減毒菌株的方法具有潛在安全缺陷，而后者可通過生物降解的多聚物、脂質體、蛋白質體或者表達抗原的轉基因植物來實現。許多研究表明，植物材料可潛在地保護所選定的抗原。特別在種子中，植物可為亞單位疫苗提供一個富含蛋白酶抑制物的糖類聚合物基質環境。其它的抗原包裝方法需要煩瑣的處理步驟；而通過植物種子來進行生物包裝不需要任何額外的代價，就可以為這些抗原提供保護。在有關轉基因馬鈴薯的研究中，從輪狀病毒和產腸毒素大腸桿菌中所選的抗原分別與霍亂毒素的B和A2亞單位融合，抗原的免疫反應顯示出對Th1的偏愛性，并可誘導白細胞介素2和干擾素γ，CD4 + 水平也相應增加。Th1的偏愛性很可能是抗原或者載體的選擇結果。在佐劑的幫助下，亞單位疫苗的釋放能增加免疫反應量?；魜y毒素和大腸桿菌的熱不穩定毒素，它們與抗原共表達，有利于誘導保護性的免疫產生，改變口服免疫低效率遞呈。另外，有人證實了轉基因植物疫苗的粘膜傳輸中所誘發的免疫應答所具有的黏膜佐劑的特征，這給口服免疫可不需佐劑提供了依據，同時也提高了其安全性。

在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候選的亞單位疫苗也具有較好的保護作用。馬鈴薯塊莖或谷物種子中表達的熱不穩定毒素的B 亞基和馬鈴薯中表達的霍亂毒素B 亞基用于小鼠口服免疫，可以保護老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物種子表達的傳播性腸炎病毒的S2糖蛋白，對乳豬能夠起到很好的保護作用。目前，通過植物遞送系統來生產B 型肝炎的疫苗也逐漸成熟。

4.2 提高抗原在植物中的表達水平

利用植物進行疫苗開發，首要的問題是，植物能否表達相關的蛋白？目前為止，許多亞單位候選抗原在轉基因植物中成功表達，這些抗原主要包括感染人類、家畜、野生動物的細菌和病毒抗原。表達水平很大程度上取決于表達的蛋白和用于表達的植物種類，同時，構建的表達系統也影響抗原的表達水平，比如用于表達的細胞器基因組(核和質粒)、啟動子的強度和組織專一性、非翻譯前導序列和信號序列的選擇和表達蛋白的靶細胞器的定位等均對表達產生影響。一般而言，利用上述策略可以實現抗原高水平表達。然而，很難對表達系統進行比較，因為特定抗原對植物表達系統的選擇很重要，在不同的系統中其表達效果是不一樣的。近來，研究人員利用內質網滯留信號可提高外源基因的表達量，Mason等利用一個核表達系統，把蛋白定位于內質網滯留信號之后，熱不穩定毒素B亞單位在馬玲薯塊莖中表達量可達總可溶性蛋白質的0.2% ；在谷物種子中的表達量約占總可溶蛋白的4%或12% ，這些都依賴于所用的調節序列。另外，霍亂毒素（B）亞單位在利用內質網滯留信號時在煙草葉片中的表達量約占總可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更難于在轉基因植物中表達，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表達量遠不及可溶性蛋白，這就需要優化表達系統以提高表達水平。

目前，轉基因馬玲薯表達B型肝炎的表面抗原水平已由馬玲薯大約1mg/g增加到馬玲薯大約16mg/g抗原，這樣可以大大減少口服劑量。目前許多研究表明，所欲表達的抗原在植物中能夠表達并裝配成四級結構。糖基化修飾的蛋白也可在植物中進行糖基化，盡管糖基化模式很可能存在著差別。在植物系統中表達的熱不穩定蛋白毒素的B亞單位和霍亂毒素的B亞單位，均有GM1受體結合活性，B型肝炎表面抗原和諾沃克病毒衣殼蛋白可形成類病毒顆粒，類病毒顆粒的形成，可認為有利于誘導免疫反應。

5 植物基因工程疫苗研究進展

5.1 反轉錄病毒載體

反轉錄病毒作為載體是在進行動物基因工程中發現的，許多研究人員認為它同樣適于植物基因工程，但目前研究的不多。

5.2 單鏈RNA植物病毒

單鏈RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作為mRNA的植物病毒，主要包括苜?；ㄈ~病毒(ALMV)、豇豆花葉病毒(CPMV)、雀麥花葉病毒(BMV)、煙草花葉病毒(TMV)等。它們作為外源基因載體主要通過以下步驟感染植物：病毒RNA 首先反轉錄為一條單鏈cDNA，在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA，將其克隆入細菌質粒中，將外源基因插入質粒的cDNA中，最后通過體外轉錄，用帶有外源基因的RNA病毒感染植物，將其轉入植物細胞。

5.3單鏈DNA植物病毒載體

在單鏈DNA 植物病毒載體中，研究最多的是Geminiviruses(簡稱GeNV) ，又叫做雙粒病毒或雙聯體病毒。它一般含有2個成對并存的病毒顆粒，大小約為18～20nm，遺傳物質是單鏈DNA ,每2個顆粒中包含1～2個、2. 5～3.0 kb的環狀DNA分子。該病毒寄主廣泛，單子葉植物和雙子葉植物均可被感染，但感染部位僅限于植物的維管組織，且其傳播媒介主要是昆蟲，不能通過機械接種。

5.4 雙鏈DNA植物病毒載體

雙鏈DNA植物病毒載體中最典型的是花椰菜花葉病毒，它的基因組長約8kb，主要感染花椰菜、油菜、擬南芥等，主要寄主是蕓苔屬植物，目前尚未發現可感染豆科和單子葉植物。

6 植物疫苗的安全性

6.1 對環境的影響

由于在植物疫苗中包含了病原體的DN段，因而花粉和種子的散播造成的基因逃逸可能給人類帶來新的病原、毒素、過敏原等，因此對可能引起的基因漸滲現象必須做出充分的安全性評價,并規范植物疫苗的利用和管理，同時尋求技術方法。如可恢復阻塞(RBF)技術，它能使自然界中因漸滲而攜帶RBF 的雜種或近緣系植物死亡或不育或利用葉綠體轉化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，這樣就可避免花粉傳播而帶來的潛在威脅，轉基因植物疫苗有著傳統疫苗無法比擬的優越性，已經成為一個研究熱點了。未來的研究應著眼于生產出作為醫藥商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。轉基因植物疫苗應用最大的限制就是表達量低。現在的研究表明：可以通過葉綠體轉化、植物育種和利用食品加工技術來提高表達水平，而且研究還指出，運用攜帶蛋白和輔助蛋白可以增加抗原被免疫系統識別的能力。這些研究都使我們越來越接近生產出廉價“安全口服的商品植物疫苗”，這樣的疫苗將可以幫助人們預防疾病的傳播。

6.2對人類和動物的影響

抗生素抗性基因是篩選轉基因植物常用的標記基因。長期食用這類轉基因疫苗是否會對人體或動物造成抗生素醫療無效。轉基因植物中的新基因會不會傳遞給人畜腸道的正常微生物，引起菌群和數量的變化或插入并表達，從而危害人畜健康？這些問題目前都無法解答，仍需大量學者繼續研究論證。

7 展望

利用植物來表達和遞送疫苗技術的發展給免疫研究注入了新的內容。以往的研究中,在植物中表達了包括過濾性病毒、細菌、腸道和非腸道的病原體等各種不同的抗原，并做了相應免疫學研究。但植物疫苗面臨的最大問題是抗原蛋白在植物細胞表達量不高，低劑量抗原蛋白往往不能激發足夠的免疫反應，這不能僅靠增加植物組織攝取量得以解決，因為低劑量的重復免疫可能會導致機體的免疫耐受，導致機體對此抗原免疫反應保持“低調”，即使以后增加抗原蛋白的劑量也不能改變。另外，機體每天對植物組織的攝取量是一定的，不可能無限增加。因此，未來研究的重點之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表達量。隨著生物技術的發展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗遞送系統將更具吸引力，并呈現出廣闊的應用前景。

參考文獻

1 余祖華，王紅寧.用植物生物反應器研制基因工程疫苗的進展[J].生

物技術，2004（8）

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1、基因工程中重組DNA分子的篩選

基因工程的第一步是提取目的基因，第二步是將目的基因與運載體結合，即把用同一種限制性核酸內切酶處理的目的基因與運載體混合，再加入DNA連接酶，使DN段相同的黏性末端能夠連接起來，因為這些DNA有相同的黏性末端，所以在DNA連接酶的作用下，必然形成一個封閉式的環狀的DNA。這些環狀的DNA有的是由一個DN段形成的，共有兩種，即目的基因環狀物和運載體環狀物；有的是由兩個DN段形成的，共有三種，即目的基因―載體連接物、載體―載體連接物 、目的基因―目的基因連接物。若要從這些連接產物中分離出重組質粒，需要對這些連接產物進行分離純化。常用的方法有抗藥性標記選擇法（插入失活法），即將目的基因插入帶ampR和tctR基因載體的tctR基因（或ampR基因）中，則tctR基因（或ampR基因）失活，再在分別含有氨芐青霉素和含四環素的兩個培養基中培養，進行篩選。

[例1]：(2008海南高考題) 右圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tctR為四環素抗性基因，P為啟動因子，T為終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內的多種酶的酶切位點。

（1）將含有目的基因的DNA與質粒表達載體分別用EcoRI酶切，酶切產物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DN段之間連接形成的產物有__________、__________、__________三種。若要從這些連接產物中分離出重組質粒，需要對這些連接產物進行__________。

（2）用上述3種連接產物與無任何抗藥性的原核宿主細胞接種到含四環的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是____________________。

（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是 ，其合成的產物是______________________________。

（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切后產生的末端發生任意連接，酶切時應選用的酶時 。

[解析]：考查基因工程重組DNA的構建與篩選，以及基因結構與表達調控。

(1)考慮載體的自連接、目的基因的自連接及載體和目的基因的相互連接。

(2)載體―載體連接物含有ampR(青霉素抗性基因)和tctR(四環素抗性基因)，其宿主細胞接種到含四環素、青霉素的培養基中均能生長。由于目的基因插入tctR四環素抗性基因位置，使得該四環素抗性基因完整性破壞而不能表達，但因含有tctR(四環素抗性基因)，所以將相應宿主細胞接種到含四環素的培養基中不能生長，接種到含青霉素的培養基中能生長。

(3)目的基因表達時,RNA聚合酶識別和結合位點是啟動子，作為轉錄起始信號，其合成產物是mRNA。

(4)質粒包括EcoRI、BamHI酶切位點，目的基因的兩端分別有EcoRI、BamHI酶切位點,若用該兩種酶同時處理質粒、目的基因會得到相同黏性末端，其目的基因――載體連接物就只能有一種。當然還有若干載體――載體連接物、目的基因-目的基因連接物。

[答案]：

（1）目的基因―載體連接物 載體―載體連接物 目的基因―目的基因連接物 分離純化 （2）載體-―載體連接物；目的基因-―載體連接物、載體―載體連接物 （3）啟動子 mRNA （4）EcoRI和BamHI

[例2]：科學家利用基因工程成功地將人的胰島素基因導入大腸桿菌體內生產出人的胰島素。在該過程中采用質粒作為運載體，已知質粒上含有抗氨芐青霉素（簡稱氨芐）和抗四環素的基因（位于不同區段），目的基因與質粒的結合位點剛好位于抗氨芐青霉素基因結構內，且受體大腸桿菌體內不含質粒，也不含質粒上的抗藥基因。導入完成后，在得到的大腸桿菌中，實際上有的根本沒有導入質粒，有的導入的是普通質粒，只有少數導入的是重組質粒。某科研機構想從培養基上篩選出含重組質粒的大腸桿菌（即“目的菌種”），他們設計了如下實驗方案：

第一步：將得到的大腸桿菌接種在含的培養基上，篩選出含有質粒的大腸桿菌。

第二步：為選出“目的菌種”，將第一步篩選出的大腸桿菌中選用“印影法”分離。

①采用涂布平板法，將第一步篩選的大腸桿菌以合適的稀釋度涂布_______________________上，經培養后形成單菌落，如圖1B所示。

②通過一消毒的“印章”（如圖1A所示），將培養基上的菌落分別按原位印跡到圖1所示的非選擇培養基__________和選擇培養基__________上（順序不能顛倒，C培養基成分與B相同，D上含有氨芐青霉素，含重組質粒的大腸桿菌不能生長）。

③培養后對照觀察C、D培養基上的單菌落。

④在C培養基上挑取D培養基上不生菌落的位置上的單菌落，從而獲得含重組質粒的大腸桿菌，即“目的菌種”。

⑤實驗結束后，使用過的培養基應該進行滅菌處理后才能倒掉，這樣做的的目的是____________________

[答案]：四環素 到含普通質粒的大腸桿菌和含重組質粒的大腸桿菌都能生長的培養基 C D防止污染環境

2、細胞工程中雜種細胞的篩選

2.1植物體細胞雜交中融合體的類型和雜種細胞的篩選

植物體細胞雜交中融合體的類型有以下三種：①未融合細胞：再生植株與親本相同；②自體融合：融合結果得到“同核體”； ③異體融合：融合結果得到“異核體”。例如，在一定的技術手段（物理法、化學法）協助下進行植物A、B細胞的人工誘導融合，先進行膜的融合，再進行核的融合，最后形成雜種細胞，雜種細胞有三種：AA型、BB型、AB型，只有AB型才是我們所需要的雜種細胞，所以需要進行篩選，再通過植物組織培養技術，培育成雜種植株。雜種細胞的篩選方法有以下幾種：①利用雙親細胞形態和色澤上的差異識別雜種細胞，這是最簡單的選擇方法。②遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻一個功能正常的等位基因，糾正另一親本的缺陷，從而使雜種細胞表現出正常功能的原理選擇雜種細胞；③抗性互補篩選法：利用親本原生質體對抗生素、除草劑及其他毒性物質抗性差異來選擇雜種細胞；④生長特性篩選法：利用原生質體對培養基成分要求與反應的差異選擇雜種細胞。例如，常用IOA（核失活―碘乙酰胺）處理與培養基相結合進行選擇：A親本用IOA處理，使細胞質不活化，這樣A原生質體不能分裂；使用的培養基是不利于B親本再生的培養基，這樣B原生質體也不能再生，最后能再生的只能是A + B 體細胞雜種；⑤物理特性篩選法：利用親本原生質體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種細胞；

[例3]：（2001上海高考題）現有甲、乙兩個煙草品種(2N=48)，其基因型分別為aaBB和AAbb，這兩對基因位于非同源染色體上，且在光照強度大于800勒克斯時，都不能生長，這是由于它們中的一對隱性純合基因(aa或bb)作用的結果。取甲乙兩品種的花粉分別按圖示操作培養成植株，將它們的葉肉細胞制成原生質體，并將兩者相混，使之融合，誘導產生細胞團。然后，放到大于800勒克斯光照下培養，結果有的細胞團不能分化，有的能分化發育成植株。

（1）在大于800勒克斯光照下培養，有_______種細胞團不能分化。

（2）能分化的細胞團是由__________的原生質體融合來的(這里只考慮2個原生質體的相互融合)。

（3）由該細胞團分化發育成的植株，其染色體數是_______，基因型是_________。

（4）該植株自交后代中，在大于800勒克斯光照下，出現不能生長的植株的概率是_________

[解析]：根據題意，基因型aaBB和AAbb的個體在光照強度大于800勒克斯時都不能生長，這是由于它們中的一對隱性純合基因(aa或bb)作用的結果，我們可推測出：能生長的植株一定同時含A、B基因。本題可用遺傳互補篩選法解題，見右圖所示。甲品種aaBB產生的花粉aB，花藥離體培養成的植株為aB，乙品種AAbb產生的花粉Ab，花藥離體培養成的植株為Ab，它們的葉肉細胞制成原生質體，將兩者相混融合，誘導產生細胞團有aaBB、AAbb 、AaBb，只有AaBb在光照強度大于800勒克斯下能生長。AaBb的個體自交后代中出現不能生長的植株的基因型aa___或___bb的個體，能生長的植株基因型是AABB、AaBb、AABb、AaBB，由于AaBb的個體能產生四種配子其比例相等，其后代產生AABB的比例為1/4×1/4=1/16、AaBb為l/2×1/2=1/4、AABb為l/4×1/2=1/8、AaBB為l/2×1/4=1/8，這些個體之和為9/16，其余為能生長的個體，其比例為7/16。

[答案]：（1）2 （2）甲乙兩品種 （3）48 AaBb （4）7/16

2.2單克隆抗體的制備中雜交瘤細胞的篩選

2.2.1雜交瘤細胞的第一次篩選

B淋巴細胞與骨髓細胞的融合隨機性很大，因此，細胞融合過程中將會形成多種細胞的混合體，包括B淋巴細胞、骨髓瘤細胞、B―B融合細胞、骨髓瘤―骨髓瘤融合細胞、B―骨髓瘤融合細胞（即雜交瘤細胞）和細胞多聚體（容易死亡，無需篩選）。在細胞混合體中，只有B淋巴細胞與骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞才有意義，所以必須從不同種類的細胞中篩選出雜交瘤細胞。目前常采用HAT選擇培養基篩選雜交瘤細胞，其原理是：DNA的合成有D和S兩種途徑。B淋巴細胞具有D和S兩種DNA合成途徑，但一般不分裂增殖；骨髓瘤細胞只有一種DNA合成途徑，即D途徑，可無限增殖；雜交瘤細胞具有D和S兩種DNA合成途徑，它利用其中任何一個途徑都可無限增殖。由于HAT選擇培養基是在普通培養液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質配制而成，由于氨基喋呤可阻斷D途徑，僅有D合成途徑的骨髓瘤細胞及其彼此融合的細胞就不能增殖，而且B淋巴細胞一般不增殖，淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜交瘤細胞可以利用淋巴細胞中的S途徑合成DNA而增殖。所以多種不同形式細胞的混合體在HAT選擇培養液中，只有雜交瘤細胞能存活下來并不斷增殖。

2.2.2雜交瘤細胞的第二次篩選

由于實驗小鼠在注射目標抗原前，其體內已存在大量的病原體，因此小鼠體內會存在大量的針對不同種類抗原的免疫B淋巴細胞。所以在細胞融合時產生的雜交瘤細胞的種類也很多，但是只有與目標抗原有特異性的免疫B淋巴細胞與骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞才是所需要的。第二次篩選的常用方法：①放射性免疫測定：用于可溶性抗原細胞的單克隆抗體的檢測；②酶聯免疫吸附試驗：用于可溶性抗原、細胞和病毒等的單克隆抗體的檢測；③免疫熒光試驗：用于細胞表面抗原的單克隆抗體的檢測。利用上述方法選出針對目標抗原的抗體的陽性雜交瘤細胞。

[例4]：1975年科學家首次利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體。請觀察下圖，回答問題：

（1）1984年以來，科學家針對如右圖所示的單克隆抗體來自_________，應用于人體，會作為__________產生___________，加速排斥反應，以及完整的抗體分子的相對分子質量過大，難以穿透腫瘤組織，達不到有效治療的濃度等問題，制備出可用于腫瘤治療的相對分子質量小的單克隆抗體。

（2）制備單克隆抗體的B淋巴細胞一般從 _______（器官）中采集。從下表看，用于篩選雜交瘤細胞的是特定的__________培養基。

篇5

【摘要】

目的: 制備和鑒定抗His標簽單克隆抗體（mAb）， 初步建立檢測和純化帶His標簽融合蛋白的方法。方法: 用碳化二亞胺法合成His-tag完全抗原， 免疫BALB/c小鼠， 采用雜交瘤技術進行細胞融合， 通過有限稀釋法和間接ELISA法克隆和篩選陽性雜交瘤細胞株。常規制備腹水， 用辛酸-硫酸銨法純化， 并對純化的mAb進行特異性鑒定。結果: His-tag完全抗原偶聯成功， 經細胞融合、 篩選及克隆化， 成功獲得1株分泌His標簽mAb的雜交瘤細胞株。制備腹水測得腹水效價高于 1∶106， 且此株mAb與其他融合蛋白標簽無交叉反應， 并在含His標簽融合蛋白的鑒定實驗中取得了滿意效果。結論: 成功制備了1株His標簽mAb， 為帶His標簽融合蛋白的研究應用提供了重要的工具。

【關鍵詞】 His標簽 單克隆抗體 蛋白印跡

His-tag是由6個組氨酸(His-His-His-His-His-His)組成的短肽，專門設計用于重組蛋白質的吸附純化， His-tag 融合標簽與其他標簽相比有很多明顯優勢， 是目前用于純化的融合標簽中使用最為廣泛的一種［1］。利用 His標簽可以建立一個基于融合蛋白的高效檢測和純化系統。目前商品化His-tag的單克隆抗體(mAb)種類不多， 且價格也十分昂貴。因此， 研制出 His-tag的mAb， 在融合蛋白質的研究中具有非常廣泛的應用前景。

1 材料和方法

1.1 材料 His六肽為西安藍晶生物科技有限公司合成; 卵清白蛋白 (OVA)、 牛血清白蛋白（BSA）、 兔抗小鼠 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3和IgM抗體均購自Sigma公司; HRP標記的羊抗鼠 IgG由河南省生物工程技術研究中心提供; MULTISKAN MK3酶標儀購自Thermo公司; 3326型CO2培養箱購自Forma公司; 硝酸纖維素膜（NC膜）購自Amersham公司; SDS-PAGE電泳儀購自BIO-RAD公司; BALB/c純系雄性小鼠（鼠齡6～8周， 體質量18～22 g）購自中國醫學科學院動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成 （1）免疫原的合成: 稱取4.4 mg His-tag和5 mg OVA溶于1 mL PB（0.05 mol/L， pH7.0）中， 充分溶解后， 將200 μL含有2.2 mg EDC的PB溶液逐滴加入， 邊滴入邊混勻， 搖床100 r/min反應4 h， 4℃靜置過夜， 用 0.01 mol/L， pH7.0 PBS透析 72 h， 存儲于-20℃備用。（2）包被抗原的合成: 合成方法同免疫抗原的合成，載體蛋白為 BSA。

1.2.2 雜交瘤細胞株的建立 按本室常規方法免疫BALB/c小鼠（20～30 μg /只）， 末次免疫后免疫小鼠血清效價達到 1∶10 000以上， 進行細胞融合， 并以間接ELISA法篩選分泌抗 His-tag的陽性克隆?？寺』案顾苽?， 均按實驗室常規方法進行。

1.2.3 mAb特性鑒定 （1）效價測定: 以 BSA-His-tag（100 ng/孔）包被 ELISA 板， 腹水從 1∶10 00 開始作10倍稀釋。用間接 ELISA法進行測定。（2）mAb特異性鑒定: 用于抗體交叉反應性研究的為常用蛋白標簽， c-myc、 多聚精氨酸、 FLAG、 鈣調蛋白結合多肽、 β-actin、 谷胱甘肽S轉移酶 (GST)、 葡萄球菌蛋白A(SPA)、 麥芽糖結合蛋白、 硫氧化還原蛋白及 Ig的 Fc段， 用間接 ELISA法測定。（3）抗體蛋白純度測定: 　抗體純度測定采用 SDS-PAGE凝膠電泳分析。（4）Ig類和亞類的鑒定: mAb類型及亞類鑒定采用雙向瓊脂擴散試驗［2］和用兔抗小鼠 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3和 IgM酶標抗體的間接 ELISA試驗檢測。

1.2.4 mAb在檢測帶His-tag的融合蛋白中的初步應用 （1）酶標抗體的制備及活性測定: 酶標抗體的制備采用改良過碘酸鈉法［3］。酶標抗體活性測定方法: 將包被抗原用包被液稀釋成100 ng/孔包被96孔酶標板， 4℃過夜， 洗滌后分別加入梯度稀釋的酶標抗體， 37℃溫育 30 min， 洗滌; 加底物顯色 20 min， 加終止液終止反應， 用酶標儀測吸光值。取A值為1.0左右時所對應的酶標抗體稀釋倍數為其效價。（2）融合蛋白的檢測: 采用蛋白印跡法對本基因工程實驗室所純化的帶His-tag的基因工程蛋白進行檢測［4］。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立及mAb的特性鑒定 獲得1株高親和力、 高特異性雜交瘤細胞， 命名為 3A-3。此株細胞經過多次傳代、 3次凍存及復蘇， 雜交瘤細胞分泌抗體穩定。此株mAb經檢測， 腹水效價達到 2×10-6 ; mAb經雙向瓊脂擴散試驗和間接ELISA法檢測為: IgG1; 各種融合蛋白標簽與His-tag mAb均無交叉反應性; SDS-PAGE電泳結果顯示: 抗體純度≥90%。

2.2 酶標抗體活性測定結果 由酶標儀（雙波長450 nm和630 nm）檢測A值， 測得酶標抗體活性達106。

2.3 帶His-tag的融合蛋白檢測結果 Western blot結果顯示， 制備的mAb與帶His-tag的融合蛋白有較強的特異性反應（圖1）。

圖1 帶His-tag的融合蛋白檢測結果（略）

A， C: SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;

B， D: Western blot檢測結果.

圖1B和圖1D分別是圖1A和圖1C的對應。其中11是不帶His-tag的陰性對照， 其余所用的12種蛋白均為本實驗室純化的帶His-tag的基因工程蛋白。其中1、 10中His6-tag與 RGS—相連， 位于基因工程蛋白N端， 2、 4、 5、 6、 8、 12、 13中His-tag位于基因工程蛋白內部， 3、 7、 9中His-tag位于基因工程蛋白C端。結果表明， 此株mAb與河南省生物工程技術研究中心基因工程實驗室所有帶His-tag的基因工程蛋白反應均呈陽性， 與不帶His-tag的基因工程蛋白無反應， 故此株mAb可以用于檢測帶His-tag的基因工程融合蛋白。

3 討論

融合標簽根據其相對分子質量(Mr)大小可以分為兩大類: 大的蛋白質分子(或蛋白質結構域及其衍生物)和小的多肽片段（His-tag等）。雖然有些作用機制尚不明確， 但已證實融合標簽的使用可以簡化蛋白質的純化過程、 控制蛋白質固定的空間取向及方便檢測、 使體內生物事件可視化、 提高重組蛋白質的產量、 增強重組蛋白質的可溶性和穩定性等［5］。標簽融合蛋白所具有的上述優越性， 使之成為后基因組時代的重要研究工具， 而抗標簽蛋白的mAb也將成為研究相應融合蛋白的主要方法之一。 His6-tag由于其Mr小， 單獨不具備免疫原性， 故需將其連接到蛋白質大分子上， 從而借助大分子的T細胞表位， 刺激機體產生特異性抗體免疫應答。本試驗采用碳化二亞胺法制備出了人工抗原。從免疫效果來看， 該方法合成的His6全抗原免疫原性較好， 能使機體產生較強的免疫應答， 小鼠抗血清效價（ELISA）達到106以上。應用淋巴細胞雜交瘤技術獲得的此株抗His6-tag的mAb， 經鑒定具有效價高、 特異性強、 親和力高等特點。在含His6-tag融合蛋白的鑒定中， His6-tag的mAb與N端、 內部、 C端帶His6-tag的基因工程蛋白均能發生反應， 取得預期效果。此將為后基因組時代大量涌現的新分子的結構和功能研究提供重要的工具， 有很高的實用價值。

目前純化帶His-tag的基因工程蛋白多采用固定化金屬螯合層析， 利用過渡態金屬離子與組氨酸側鏈之間的相互作用進而分離目的蛋白。雖然用此法純化His6-tag融合蛋白與其他標簽融合蛋白相比有很多明顯優勢， 但此法也有其缺點: 在金屬離子存在的情況下， 多聚組氨酸傾向于形成一種hem-like的結構， 這是一種疏水性的結構， 因而與某些蛋白質融合后， 有被埋藏在融合靶蛋白質內部的可能性［5］; 用咪唑洗脫會導致蛋白質的聚集。另外， 帶His-tag的基因工程蛋白的純化率還有一定上升空間， 能否通過His親和層析柱在盡量低損失的情況下來有效填補空缺， 仍需要進一步的實驗摸索。

參考文獻

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［2］ 余冰賓. 生物化學實驗指導［M］. 北京: 清華大學出版社， 2004: 123-124.

［3］ 楊利國， 魏平華， 郭愛珍， 等. 酶免疫測定技術［M］. 南京: 南京大學出版社，1998: 189-210.

篇6

抗菌肽(antimicrobialpeptides)是具有抗菌活性短肽的總稱。1975年瑞典科學家G.Boman等人[2]等從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離得到一種殺菌肽,并將其命名為cecropin。此后,許多抗菌肽相繼被分離、純化。一些抗菌肽的氨基酸一級結構和基因序列得到確定。80年代,有關抗菌肽的研究主要集中在大型的經濟昆蟲。90年代以來,在繼續對大型經濟昆蟲進行研究的同時,又擴展到一些小型昆蟲和其它無脊椎及脊椎動物,抗菌肽已成為免疫學和分子生物學研究的熱點。研究的內容包括:抗菌肽的分離與純化,氨基酸序列的分析,蛋白質構型與功能的關系,抗菌肽的作用機理[3,4],應用基因工程克隆與表達抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及動植物的轉抗菌肽基因工程等,其中昆蟲抗菌肽基因工程研究最受重視[5,6]。目前已發現抗菌肽或類似抗菌肽的小分子肽類廣泛存在于生物界,包括細菌、動植物和人類。這種內源性的抗菌肽經誘導而合成,在機體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用,更被認為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕木哂袕V譜殺菌作用,大多數對革蘭氏陽性菌有較強的殺滅作用,有些則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用。對某些真菌、原生動物,尤其對耐藥性細菌有殺滅作用,并能選擇殺傷腫瘤細胞,抑制乙型肝炎病毒的復制。

1.抗菌肽的分類

迄今為止從不同生物體內誘導的抗菌肽已不下200種,僅從昆蟲體內分離獲得的就多達170余種。根據抗菌肽的結構,可將其分為5類:(1)單鏈無半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由無規則卷曲連接的兩段а-螺旋組成的肽。該類包括天蠶素Cecropins,Magainins等。Magainins最初是從非洲爪蟾的皮膚中發現的,它是爪蟾的皮膚在一定的環境壓力下分泌出的抗感染和促進傷口愈合的成分,由兩個緊密相連的肽鏈組成,每一個肽鏈有23個氨基酸,低濃度便可抑制許多細菌和真菌生長[7]。(2)富含某些氨基酸殘基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)殘基的抗菌肽。如從豬腸內分離的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly[8]。(3)含一個二硫鍵的抗菌肽,該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。如爪蟾皮膚細胞中產生的Brevinins[9]。(4)有兩個或兩個以上二硫鍵,具有β折疊結構的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phormindefensin),分子內有6個Cys形成3個分子內二硫鍵,肽鏈C末段是帶有擬β轉角的反向平行的β片層[10]。實驗證明,分子中的二硫鍵在其抗菌作用中至關重要。(5)由其他已知功能較大的多肽衍生而來的具有抗菌活力的肽。

2.抗菌肽的作用及機理

2.1抗菌肽的抗菌作用及其機理抗菌肽分子可以在細菌細胞質膜上穿孔而形成離子孔道,造成細菌細胞膜結構破壞,引起胞內水溶性物質大量滲出,而最終導致細菌死亡?？咕姆肿邮紫冉Y合在質膜上,接著其分子中的疏水段和兩親性α-螺旋也插入到質膜中,最終通過膜內分子間的相互位移,抗菌肽分子聚集形成離子性通道,使細菌失去了膜勢而死亡[10-14]。但是,Gazit[15]等得出的實驗結果表明,抗菌肽只是結合到了單位膜的表面上,并未插入膜中,更未形成通道。然而,抗菌肽的作用靶部位是細菌細胞質膜,以及抗菌肽的作用結果是導致細菌細胞質膜通透性增大等基本內容是確切無疑的,這也正是抗菌肽與青霉素等傳統抗生素對細菌作用機制不同的本質所在。2.2抗菌肽的抗病毒作用及其機理研究發現煙芽夜蛾幼蝦的血淋巴對6種DNA、RNA病毒有明顯的抑制作用,使病毒感染力迅速降低,而且這種抗病毒活性具有廣譜性。Mariam[16]試驗表明來源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins類抗菌肽具有抗皰疹病毒-HSV的作用,還發現人的嗜中性粒細胞防御素(HNP-1)對一種皰疹病毒有抑制作用。此外,蜂毒素和天蠶素也可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表達,從而抑制減少HIV-1的增殖。這表明抗菌肽對于當今人類的頑癥———艾滋病也有抑制作用。

2.3抗菌肽的抗寄生蟲作用及其機理抗菌肽可以有效地殺滅產生人類及動物寄生蟲病的寄生蟲,如瘧疾、Chagas氏病、萊什曼病等。目前發現一種合成的天蠶素-蜂毒素雜合體對萊什曼原鞭毛蟲有損傷作用,起作用的靶目標是細胞質膜,它可以快速降低H-OH+的通透性,破壞膜電勢,質膜形態也受到損壞。Shahabuddin[17]研究發現昆蟲抗菌肽對感染蚊子的瘧原蟲發育的不同時期有不同的作用,主要對瘧原蟲的卵囊期和子孢子期造成明顯的損傷。

2.4抗菌肽對腫瘤細胞作用及其機理國內外已對抗菌肽殺傷腫瘤細胞的作用進行了廣泛研究,發現抗菌肽對體外培養的癌細胞的作用主要是使癌細胞膜上形成孔洞,內容物外泄,線粒體出現空泡化,嵴脫落。核膜界限模糊不清,有的核膜破損,核染色體DNA斷裂,并抑制染色體DNA的合成,細胞骨架也受到一定程度的損傷[18,19]。通過對荷瘤小鼠的研究證明,抗菌肽能顯著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的積累;對S180肉瘤和U14宮頸癌的抑瘤率亦達30%-50%[20]?？咕倪€可以調動機體的免疫機能,從體液免疫方面來抵抗癌瘤的入侵。

3.抗菌肽基因的融合表達

抗菌肽的天然產量低,合成或從機體中提取步驟復雜、產率低、價格相當昂貴,利用基因工程技術生產抗菌肽具有重要意義?？咕乃鶖y帶的堿性氨基酸使其對蛋白酶非常敏感,必須采用融合表達策略以抵消其堿性并降低其對宿主細胞的毒性。

謝維等合成了家蠶抗菌肽CMIV基因,并將其克隆到金黃色葡萄球菌A蛋白和IgG親合的結構域ZZ的融合表達載體中,得到Pezz318-CMIVV質粒,以此質粒轉化E.coliHB101,得到ZZ-CMIV融合表達的蛋白,用CBr切割后,得到CMIV肽。李秀蘭等[21]對天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改動,根據E.coli偏愛的密碼子人工合成了肽基因片斷,重組到測序載體,再將此片斷重組到表達載體Pet28上進行表達,融合蛋白經CNBr裂解后,具有與天然抗菌肽相同的生物活性。吳映雅等將柞蠶抗菌肽D基因連接在牛成纖維細胞生長因子cDNA的上游,在酵母中成功地得到了表達,表達產物具有抗菌活性和牛成纖維細胞生長因子的抗原性。Kevin等[22]HNP(humanneutrophilpeptide1)和CEME(syntheticcecropin/melittinhybrid)分別與GST(glutathione-S-transferase)、ORRF、IgG結合序列及SPA(staphylococcalproteinA)在E.coli或S.aureus中融合表達,結果在S.aureus中雖實現了與SPA的融合分泌表達,但表達產量較低;Zhang等[23]選擇RepA蛋白的序列作為抗菌肽的融合表達伴侶,并插入Histag等序列作為純化親和位點,實現了在E.coli中的融合表達。ChristsnenB等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一個供體抗菌肽的活性都高。

4.抗菌肽轉基因研究

王志興等把大麥α-淀粉酶的信號肽序列和抗菌肽CecropinB基因或HhivaA基因構成嵌合基因,并把此基因導入馬鈴薯,結果加信號肽序列的CecropinB轉基因植株發青枯病延遲,病情指數降低。Yarus等[24]用顯微注射法將牛氣管抗菌肽基因轉入小鼠,轉基因鼠在牛氣管抗菌肽基因控制序列的驅動下成功的表達了牛氣管抗菌肽,在鼠乳中的牛氣管抗菌肽對大腸桿菌具有抗菌活性。Reed等研究了以IL-2啟動子/增強子控制轉基因鼠中抗菌肽的合成及隨后對布氏桿菌的抑制作用。Reed[25]構建了這樣一個DN斷:Shivala片斷,SV40多腺苷酸化/剪切信號肽基因片斷,此片斷加到鼠IL-2基因5’側-593─+110區域。在受精卵精前核時將此融合基因注入受精卵(微注射法),得到26系小鼠。RT-PCR檢測:有兩系轉基因鼠,當其脾淋巴細胞置于3.25mg/kg的conA(刀豆蛋白,一種抗原誘導物)時,可以誘導產生成熟的ShivalamRNA。用一定量的布氏桿菌接種時,有兩系小鼠遭到攻擊。四星期后,在轉基因鼠脾臟組織布氏桿菌比非轉基因鼠少得多(P<0.05)。DavidWinder等[26]把編碼Ceropin或Melittin的基因放置在MLV(鼠白血病病毒)的啟動子下,轉染到EJ細胞(人膀胱癌細胞),然后把這些細胞注入到裸鼠內,發現這些腫瘤細胞停止生長或生長減弱DavidWinder等用PCR擴增,Prepromelittin(PPM前蜂毒素原),Premelittin(PM前蜂毒素)和Prececroppin(PC前抗菌肽)三種核酸片斷,均置于MLV啟動子下構建融合基因轉染進EJ細胞。三種類型的EJ細胞分別注入裸鼠后,測定50d后的腫瘤生長情況,無抗菌肽基因片斷的EJ細胞(對照組)致瘤率為70%,帶Cecropin基因片斷的EJ細胞致瘤率只有39%,PPM為50%,PM為65%,其抑制腫瘤的效果明顯。

5.抗菌肽的應用前景

目前,大部分植物抗菌肽是從植物種子中分離獲得的,它們可以保護植物組織和種子不受真菌病原菌的侵害,但是植物抗菌肽對大部分細菌無抑制活性。因此,依靠基因工程的方法用其它真核生物的抗菌肽基因來轉化農作物,培育抗病新品種是當前國內外研究的一個熱點。

動物抗菌肽和干擾素、補體一樣是機體非特異性天然防御系統的重要組成部分。機體受損傷或病原微生物入侵時,能迅速產生抗菌肽來殺傷入侵者,它對正常真核細胞幾乎沒有作用。另外,因為抗菌肽的合成速度非常快(假定核糖體上肽鍵合成速率不變,抗菌肽的產生比IgM要快100多倍),［27］而且小肽的擴散比大的蛋白質和免疫細胞更加迅速,作用更顯靈活,所以Boman曾指出,抗菌肽是機體的一種理想的一線防御物。與普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌譜”更廣,除了抗細菌外,有的抗菌肽還能作用于真菌、原蟲、有包膜的病毒及癌細胞(對癌細胞的選擇性作用可能與其細胞骨架的改變有關),同時能加速免疫和傷口愈合過程。這預示抗菌肽在治療及預防癌癥和抗病毒、抗感染等方面具有良好的應用前景。更為重要的是,由于抗生素的濫用導致菌株產生了抗性,人們需要尋找新的抗菌藥劑?？咕倪@種從生物體中獲得的物質恰巧具有獨特的抗菌機理,不是像一般的抗生素那樣通過阻斷生物大分子的生物合成來發揮作用,因而極有希望開發成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物。

隨著研究工作的進一步深入,可以預見,抗菌肽及其基因工程在醫藥、衛生、食品工業及農業等方面將會發揮更為重要的作用。另外,有些抗菌肽分子中含有D-氨基酸,這也為研究D-氨基酸如何在核糖體上合成多肽提供了一個理想的模式體系。

6.研究展望及存在問題

抗菌肽是哺乳動物防御系統的一個重要組成部分,具有熱穩定、水溶性好、廣譜殺菌甚至有的能殺真菌、原蟲等優點,而且許多抗菌肽在100℃加熱10min條件下仍能保持一定活力,且對較大的離子強度和較低或較高的pH都有較強的抗性,而對真核細胞幾乎無作用,僅作用于原核細胞和發生病變的真核細胞,并且與抗生素通過阻斷大分子生物合成的作用機制完全不同,病源菌不易對其產生耐藥性,由此顯示了它具有獨特的研究和應用價值。近20年來,人們對昆蟲抗菌肽已進行了比較系統的理論和應用研究,但有關畜禽抗菌肽基因工程應用研究方面的報道較少。從哺乳動物抗菌肽特有的性質,顯示了它具有以下幾個方面在畜牧生產上的研究和應用前景。研究展望及存在問題

6.1藥用前景隨著傳統抗生素的廣泛及長期的應用,許多病源菌對它們產生了耐藥性,而具有廣譜抗菌且有獨特的抗菌機制的抗菌肽顯然在這方面的應用研究中具明顯優勢。隨著對抗菌肽結構與活性的關系、抗菌肽作用機制及其基因表達調控機制認識的不斷深化,設計一種高效的、有利于人類健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。

6.2轉基因研究及應用仔豬腹瀉、奶牛炎及各種病毒性疾病如豬瘟、雞新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧業的發展。借鑒已成功的昆蟲抗菌肽轉基因工程,如轉基因蚊子、轉基因馬鈴薯、轉基因水稻等,把特異的抗菌肽基因轉入畜禽特定細胞讓其表達,從而產生抗病新品種,不失為一條發展畜牧生產的新思路,前景深遠。

6.3抗菌肽基因表達調控及抗菌肽添加劑研究研究表明,［28］抗生素添加劑的使用嚴重破壞了動物腸道的微生物平衡,并易在動物體內殘留,嚴重影響了畜產品的品質和人類的健康。用基因工程方法生產環保型抗菌肽添加劑,或者,通過日糧因素調控抗菌肽基因的表達而達到畜產品無抗素化值得進一步研究。

然而,由于抗菌肽分子小,分離提純存在一定的困難,故天然資源有限?；瘜W合成和基因工程法獲得抗菌肽是主要手段,但化學合成抗菌肽成本高,而通過基因工程在微生物中直接表達抗菌肽基因,則可能對宿主有害而不能獲取表達產物。所以,對抗菌肽的結構、構效關系及作用機理還需進一步研究。7.結束語

抗菌肽是生物體對外界病原物質侵染而產生的一系列免疫應答反應產物,它的出現為人們尋找理想的抗菌藥物提供新的領域,尤其是當今許多抗生素產生了耐藥性,因此抗菌肽具有巨大的應用潛力?；蚬こ碳夹g的發展,極大的促進了抗菌肽的研究和開發,通過抗菌肽基因的克隆與表達而大量生產成為可能。雖然抗菌肽目前還不能直接應用于養殖業,但抗菌肽獨特的作用機理不易產生耐藥性的特性將吸引科研工作的不斷深入,可以相信抗菌肽將在動物養殖和提高畜產品品質方面發揮重要作用。

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篇7

關鍵詞：高中生物;知識;鏈接

在教學中，依照章節的次序，讓學生學習、歸納生物學基本事實，讓生物學原理與概念有機結合，從中探尋知識的規律組成，發現當前生物應用技術與生物科學理論的建構模式，掌握生物學發展動向，幫助學生梳理各個知識點，強化理解能力，穩固而扎實地獲取知識。將高中生物知識的各個環節通過一定教學方法來完成鏈接，讓系統化、層次分明的知識網絡形成于學生的頭腦，提高學生的邏輯思維以及對知識按照先后順序進行統一的能力。

1.創建知識鏈接

1.1形成章節內的知識鏈。知識鏈是指將生物學核心概念、基本原理、基本事實及運動過程等用文字箭號的形式串聯起來，用來表現生命結構的特征及生命運動的特點，或人們利用生物學的原理來解決實際問題的過程。這種歸納方式簡單明了，脈絡清晰，是生物學教學中常用的一種手段。如在學習基因工程、動物細胞工程、胚胎工程等生物技術過程中，可引導學生嘗試形成以下有關的知識鏈，例如基因工程部分，基因獲取目的、基因構建的表達方式與載體、基因導入受體細胞、基因鑒定及檢測，最后進入轉基因部分;動物細胞核移植的知識鏈接創建，從動物體細胞過渡到MⅡ卵母細胞，分析細胞重組與胚胎、細胞代孕、動物的克隆技術等;胚胎移植部分，早期胚胎代孕母體子代;胚胎分割：早期胚胎二、四、八等份胚胎代孕母體子代;胚胎干細胞分離和培養：早期胚胎胚胎干細胞組織器官某器官缺陷的個體。用知識鏈形式歸納，可以將復雜的操作過程簡約化，有利于學生的理解和記憶。

1.2尋找知識聯系的“節點”。要建立起不同知識鏈之間的聯系，關鍵是尋找知識鏈之間的聯系的“節點”。所謂節點，就是指聯系兩條或幾條知識鏈之間的關鍵概念、過程或原理，通過節點，可以梳理幾條知識鏈之間的關系，就像交通要道的十字路口，方便地從一條知識鏈到達另一條知識鏈。上述的基因工程、細胞工程、胚胎工程中的幾條知識鏈之間如何進行鏈接？可以通過引導學生探究如下問題來尋找鏈接的“節點”：⑴利用基因工程技術獲得轉基因哺乳動物常用的受體細胞是什么？受體細胞怎樣對目的基因進行操作才能夠發育形成轉基因動物？⑵應用動物細胞核移植技術最終完成動物克隆時，完成重組的早期胚胎培養場所是怎樣的形式？繼續的發育場所是什么？⑶胚胎分割在什么時期進行操作的？分割后的早期胚胎如何處理才能得到遺傳性狀完全相同哺乳動物？⑷提取胚胎干細胞一般在什么時期？它有什么意義？通過探究可以發現，培育轉基因動物和克隆動物，受體細胞或重組細胞都是在體外培養成早期胚胎，然后再移植到代孕母體內發育的。而胚胎分割和胚胎干細胞其實都是在早期胚胎水平上的操作的。這樣就可以將“早期胚胎”作為一個節點，把幾條知識鏈聯系起來，達到鏈接的目的。

1.3鏈接不同的知識鏈。知識鏈接就是將不同的知識聯系起來，這種鏈接可以是章節內的，也可以是跨章節的。通過尋找知識聯系的節點，建立起不同知識鏈的溝通。有時幾條知識鏈之間的節點并不特別明顯，這就需要分析，仔細研究它們的關系，找出最關鍵的聯系節點。找到“早期胚胎”這樣一個關鍵的節點后，可以引導學生進行這樣的鏈接：⑴進行胚胎移植的早期胚胎可能有哪些來源？⑵早期胚胎有幾種去向？就可以從早期胚胎的來源和去向這兩個方面來聯系：哺乳動物早期胚胎可以通過正常的體內受精作用或體外受精收集到，也可通過基因工程或細胞工程獲得的改造后細胞在體外培養而成。早期胚胎移植到母體內，由代孕的母體生出子代個體，就是說，通過基因工程和核移植培養的早期胚胎，只有通過胚胎移植過程，才能發育成所期望的哺乳動物。胚胎分割和胚胎干細胞分離和培養都是在移植前對早期胚胎的處理，以獲得更多的遺傳性狀相同的子代，或定向分化成組織器官，后者用以對有缺陷的動物進行器官移植。如下圖所示。

2.知識鏈接的幾種類型

2.1直鏈式鏈接。幾條知識鏈通過關鍵的節點鏈接后，仍然為直鏈的鏈接方式。直鏈式鏈接結構簡單，知識梳理清晰，特別適宜進行一章或一節內的知識聯系，在一章或一節的復結中常使用。例如植物和動物的內在相關能量轉變過程為光能、電能以及ATP等物質的活躍，化學能在ATP等物質中的活躍，光合作用的暗反應以及大部分有機物含有的穩定化學能ATP中的活躍化學能（動植物的呼吸作用）;ATP中的活躍化學能機械能、光能、電能、化學能（動植物細胞中能量的利用）。通過鏈接完成生物體之間能量轉變的過程，例如光能、電能以及ATP等物質內含有的活躍化學能;大部分有機物內含有的穩定化學能、活躍于ATP物質中的化學能、機械能、光能、電能以及化學能等。

2.2放射式鏈接。若干條知識鏈之間不形成緊密的聯系，每條知識鏈只表現生命活動的某一方面，幾條知識鏈由一個關鍵的節點鏈接后，形成放射式鏈接結構，就可以說明完整的生命活動過程，這種形式特別適宜建立不同章節之間的聯系，在總復習課中經常使用。如血糖的調節過程，體溫調節過程，水和無機鹽調節過程，PH調節過程，免疫調節等幾條知識鏈，可以通過“內環境穩態”這一節點聯系起來，因為這些調節過程都是維持內環境穩定的重要方面，只有多種調節過程維持正常，才能表現內環境的穩定。如下圖所示。

2.3網絡式鏈接。不同的知識鏈，由關鍵的節點鏈接，各條知識鏈之間的關系錯綜復雜，不止在一個知識點處有關聯，于是就形成了復雜的網絡式結構，這種鏈接適宜跨模塊或跨章復習時的歸納總結。如上述基因工程、動物細胞的核移植、胚胎工程之間的知識聯系就是這種鏈接。

2.4體驗式鏈接。體驗式鏈接亦可稱為體驗式教學，它強調利用課堂體驗來提高學生對于學習的主動性，以興趣培養為前提，鞏固生物知識的鏈接基礎。體驗式鏈接的內涵在于，教師充分向學生展示日常生活中可以見到的生物學相關知識，理解生物學與日常生活之間的關聯，利用體驗式教學來為知識鏈接注入活力，創造輕松愉快的生物課堂。體驗式鏈接能夠有效利用到學生原有的生物知識結構，通過實驗和體驗來將知識結構橫向拓寬，為鏈接下一部分的知識打下基礎。另外，體驗式鏈接能夠為學生帶來一些反思，快速找到當前生物知識尚且存在的不足，通過對學生的引導，端正學習態度與學習的方式方法，創造一些可以利用到生物知識經驗的教學場景，進而提高生物課堂的整體性與關聯性，讓知識鏈接得以事半功倍。

篇8

[關鍵詞] 生物技術 畜牧獸醫 應用

[中圖分類號] S8-1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2014）01-0242-01

隨著DNA重組技術等生物技術的快速發展，生物技術產品被廣泛應用于飼料工業、畜禽疾病控制、動物生產等領域，并在其中發揮著巨大的作用，有效的提高了畜禽的生產能力、飼料的產量和質量，減少了畜禽疾病的發生率和死亡率，改善了環境污染。生物技術在畜牧獸醫領域中的應用主要有以下幾個方面。

一、生物技術在動物育種中的應用

動物育種中廣泛應用的生物技術主要有轉基因技術、動物克隆技術、DNA重組技術以及胚胎工程技術等等。運用現代生物技術進行分子育種可以有效的改善傳統育種方式中的培育周期長等問題，大大的加快了育種的進展，提高了育種的質量。比如，利用生物技術可以把特種功能的基因簇或者是單個基因插入某個生物品種的基因組中，并成功表達，再運用相關的生物技術進行診斷和檢測，選擇出能夠達到預期標準的小組，不僅可以有效的提高育種的準確性，加快育種的速度，還能提高畜牧品種的生產能力和經濟性狀。

二、生物技術在操縱動物生產中的應用

生物技術操縱動物生產主要表現在運用相關生物技術對動物原有的內在和環境系統進行目的性的干預，使動物機體所達到的新的代謝平衡向人類期望的方向移動。比如，通過生物技術人工合成的生長激素，可以達到和動物天然的生長激素相同的作用，可以有效的促進動物的生長，降低動物的采食量，并且對動物及人類健康都不會產生不良影響，有效的促進了畜牧業的發展。

三、生物技術在防治與診斷動物疫病中的應用

在防治動物疫病方面，運用生物技術培育的基因工程獸用疫苗與常規疫苗的生產相比生產周期更短，疫苗的種類更多，效果更強大，并且降低了由于殘毒和污染而造成的生物污染的機率。常見的有預防禽痘病毒的活病毒載體重組疫苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗等等。在畜禽疾病診斷方面，隨著生物技術發展而產生的限制酶分析法、免疫印跡法、核酸探針法以及聚合酶鏈反應法等多種分子生物學的診斷方法都是畜禽疾病有效的診斷方法。

四、總結

生物技術是一門神奇而復雜的綜合性技術，生物技術應用在畜牧獸醫領域中，不論是在動物育種、動物生產、動物疫病的防治與診斷，還是在新生物制品和制劑的研制上，都發揮著重要的作用，生物技術為畜牧獸醫領域的發展有著巨大的推動作用。

參考文獻

篇9

關鍵詞：雞柔嫩艾美耳球蟲；疫苗；基因重組苗

中圖分類號： S859.797 文獻標識碼： A 文章編號： 1674-0432（2013）-08-82-2

雞球蟲病是由屬于頂復門、孢子蟲綱、真球蟲目、艾美耳科、艾美耳屬的原蟲寄生于雞腸道引起的疾病，由于其造成雛雞大量死亡，耐過的雞只因為消化功能障礙，飼料轉化率下降，生長發育緩慢而出現生產性能下降問題，給養雞業造成巨大損失。感染雞的球蟲主要有柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella），堆型艾美耳球蟲（E.acervulina），早熟艾美耳球蟲（E.praecox），巨型艾美耳球蟲（E.maxima），布氏艾美耳球蟲（E.brunetti），毒害艾美耳球蟲（E.necatrix）以及和緩艾美耳球蟲（E.mitis）[1]。其中，柔嫩艾美耳球蟲蟲株是該屬球蟲中毒力最強、危害性最大的蟲種，并且與其他球蟲株之間幾乎無交叉反應，給養雞業帶來極大的危害，據Allen報道全世界每年因此病造成經濟損失超過80億[2]。

1 重組表達亞單位疫苗

基因重組表達亞單位疫苗是利用DNA重組技術，將編碼E.tenella保護性抗原基因導入受體細菌或者細胞，使其在受體中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈，然后提取保護性抗原肽鏈，加入佐劑即成?；蛑亟M表達亞單位疫苗的候選基因有5401、SO7、3-1E、 MZ5-7和表面抗原SAG5、SAG10、SAG13、SAG 14等。

H. D. Danforth[3]等于1989年開啟了對雞球蟲基因重組表達亞單位疫苗的篇章，他們把柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面抗原5401導入到大腸桿菌中與β-galactosidase 融合表達，添加弗氏完全佐劑配制疫苗，經該重組疫苗皮下免疫一次的雞在攻毒后的損害評分明顯低于對照組，增重效率則明顯高于對照組。Du Aifang [4]等，使用編碼艾美耳球蟲5401抗原轉入到致弱沙門氏菌中制備的重組疫苗，試驗表明最多有55%的保護力。

SO7是位于子孢子折光體上的一種抗原。M. S. Crane[5]等的研究發現重組表達的E. tenella SO7抗原免疫雞只，不但能保護受到同源株攻毒的雞，同樣也能保護受到E. acervulina， E. maxima 和 E. necatrix攻毒的雞。Christian Klotz[6]等， 用SO7抗原與兩種不同的真核表達載體構成的重組疫苗，做免疫保護性試驗，均能夠減少排卵量，具有部分保護力，而且對其他球蟲也有一定的交叉保護，說明SO7抗原可以作為候選疫苗。

麥博等[7]將E.tenella表面抗原SAG10做原核表達后將重組蛋白以lOOug/只肌肉注射免疫雛雞，攻蟲后觀察免疫效果，免疫組抗球蟲指數為152.13。說明重組表達的EtSAGl0可誘導雛雞產生一定的抗球蟲免疫保護。E.tenella表面抗原SAG13和SAG14[8]，SAG2和SAG7[9] SAG5[10]做原核表達，將可溶性蛋白免疫雛雞，攻毒后檢測其重組蛋白的免疫保護效果，結果表明，這些重組表達蛋白均有一定的抗球蟲保護力。

Millter[11]等于1989年用抗Etenella子抱子28KD的單抗Mabl209從cDNA文庫中篩選出GX3262基因，表達的融合蛋白分子量為115kDa，試驗表明用該重組抗原免疫幼齡肉雞對感染艾美耳球蟲卵囊產生明顯的部分保護作用。

B. M. Subramanian[12]等的研究發現一個來自于E. tenella 微線體的能激發宿主雞的體液和細胞免疫反應的抗原EtMIC1，重組表達的EtMIC1能提供受試雞部分的免疫保護。

Ralf.Hosse[13]等首次克隆表達出柔嫩艾美耳球蟲的89kDa親環蛋白 EtCTP89，在E.tenella整個生活史中表達，其從CsA到Cyps具有緊密聯系，研究表明親環蛋白A具有抗球蟲作用。Nishinaka S[14]等從母系的無胸苷激酶活性的R27H1和 R27H4與雞的B細胞系MuH1 和MuH4融合制備單克隆抗體，研究表明能產生IgG。Clarke Lorraine E等克隆EtHL6抗原，該抗原能在Eimeria tenella的子孢子和第二代裂殖子階段表達，結果表明具有一定的保護作用。

2 重組DNA疫苗

重組DNA疫苗是將一種或者幾種抗原基因重組到表達載體，直接或經包裝注入體內表達出相應抗原，誘導機體產生免疫應答。

X. Ding [15]等用E. tenella微線體抗原基因EtMIC-2構建的DNA疫苗載體進行卵內雞胚免疫，結果表明其能提高雛雞攻毒后10天和17天的抗體水平，同時排卵量下降，增重提高。

3-lE是E.tenella子抱子與裂殖生殖階段的表面抗原，氨基酸序列全長1086bp，含有一個由170個氨基酸組成的開放閱讀框架。Song [16]克隆3-lE基因構建 pMPI3-3-lE重組質粒 ，插入到pBK-CMV載體中 ，以不同的免疫劑量和免疫方式免疫1日齡雛雞 ，14日齡時功毒， 10d后，檢測機體的抗體，結果表明不管何種接種方式 ，均能檢測到最高的循環抗體水平。說明3-lE基因能夠促進機體免疫系統產生免疫保護作用。D. Ma [17]用共表達3-1E和IL-15的DNA疫苗載體免疫試驗雞的結果表明其免疫保護效果（用ACI評價）比僅表達3-1E抗原的DNA疫苗的保護效果更好。Geriletu [18]用共表達E.tenella抗原基因MZ5-7和IL-17的DNA疫苗載體免疫試驗雞，7天后雞脾細胞的IL-2和IFN-γ表達量上升，攻毒后免疫組的抗球蟲指數也明顯高于對照組，而且共表達IL-17的DNA疫苗比僅表達MZ5-7抗原的DNA疫苗的保護效果更好。徐守振[19]增出有3-l E抗原基因和雞IFN基因融合克隆到真核表達載體 proVAX中構建雙價融合表達質粒 proIE。將proIE于14、21日齡免疫AA肉雞，28日齡觀察免疫保護效果。結果顯示， proIE雙價融合DNA疫苗具有增強免疫保護作用，可顯著降低糞便中的卵囊排出量（P

TA4 是柔嫩艾美耳球蟲通過二硫鍵連接5kDa和17kDa兩條多膚形成的子孢子的一種表面糖蛋白。S. Q. Wu[20]的研究發現表達E.tenella抗原基因TA4的DNA疫苗pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4經肌肉免疫能提供試驗雞部分免疫保護效果，抗球蟲指數（ACI）達到160。Xu Qianming [21]用嵌合有艾美耳球蟲TA4和IL-2基因的聯合表達疫苗誘導雞體對球蟲病的免疫力，結果表明TA4基因是有效的疫苗表達抗原，該抗原和細胞因子聯合表達能增強DNA疫苗的免疫力，是一個不錯的方法。

λMZ5-7是在第二代裂殖子階段表達的一種分泌性蛋白（MZP）。秦睿玲[22]將λMZ5-7連接到pVAX載體構建重組質粒pVAX-Mzp5-7，用該重組質粒肌肉注射機體內表達，免疫試驗表明該質粒對雞柔嫩艾美球蟲的攻擊有較好的免疫保護作用。

L Yang [23]克隆廣東株Eimeria tenella的子孢子折光體抗原Etp28基因與AcMNPV-OCC（-））構建重組表達體GST-6xHis-Etp28免疫雞只，實驗表明具有部分保護作用，可以作為候選疫苗。Yang Guilian [24]，用重組雞痘病毒表達艾美耳球蟲菱形基因能夠誘導免疫反應，證明有部分保護作用。D.G..J. Breed[25]， 篩選出4段不同的基因片段用于免疫雞只，都能誘導出強烈的T細胞反應，其中有一段分子量是26到30kDa的基因片段，試驗表明能夠極大的減少盲腸病變。Alireza Talebi[26]，用編碼抗原的基因合成多肽疫苗用于預防雞只，分別用Eimeria acervulina 和Eimeria tenella 功毒，結果是能產生很高水平的抗體，細胞內反應具有部分交叉免疫保護作用。

3 展望

從80年代開始研究雞球蟲基因工程疫苗至今，取得了很大的成果。艾美耳球蟲重組疫苗研究表明以這些抗原基因制備的亞單位疫苗和DNA疫苗對雞球蟲攻毒具有一定的免疫保護作用，但所有這些研究中的重組疫苗都還達不理想的保護效果，離臨床應用還有較大距離。艾美爾球蟲的基因工程重組疫苗研究之所以至今未有突破性進展，我們分析主要有三方面的原因：其一，目前對艾美爾球蟲重組疫苗的研究大都是基于偶然發現的一些單個抗原基因進行的一些試驗性免疫效果研究，缺乏對艾美耳球蟲所有抗原的系統化研究基礎。其二，由于球蟲的生活史比較復雜，球蟲發育的每一階段都具有免疫原性，對球蟲感染誘發保護性免疫起關鍵作用的可能不只一種抗原，可能需要多種抗原的共同作用才能誘發保護性免疫反應。其三，對球蟲感染宿主的機制現在仍然不清楚，這也是制約柔嫩艾美耳球蟲疫苗研究的一大難題。隨著分子生物技術的不斷發展和對球蟲基因的研究不斷深入，最終能研究出高效的基因重組疫苗。

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篇10

小小桿菌　偏食何道

根癌農桿菌生活在土壤――特別是耕種過的田地里，因為經過耕種的土壤疏松，適宜根癌農桿菌生長。根癌農桿菌的身體為棒狀，有兩三個微米長，靠幾根鞭毛運動，鞭毛一般生在側邊。用顯微鏡放大到1000倍時，人們就能把它看得很清楚了。

根癌農桿菌雖小，也有細胞壁，按以前的生物兩界分類法，它當然屬于植物界，就是說，它曾被當作是一種低等植物。

在許多雙子葉植物靠近地面的根莖交界處，根癌農桿菌能誘發一種帽狀腫瘤，人們稱之為冠癭瘤病。這種病曾在法國、東歐和澳大利亞的葡萄等果樹上大面積發生，造成很大的危害。在其他地方，甚至城市園林綠化中，也有不少植物患上此病。

人們發現，根癌農桿菌所產生的冠癭瘤病，與豆科植物根部的固氮根瘤細菌所產生的根瘤相似；然而，事實上，兩者的作用方式并不一樣。

豆科植物的固氮根瘤菌會鉆到植物細胞內部，與植物細胞共生，根瘤細菌為豆科植物提供氮肥，植物細胞則供給根瘤細胞其他各種營養。

根癌農桿菌雖然也能誘發植物腫瘤，細菌卻并不侵入到植物細胞里面去。

這到底是怎么一回事呢?

原來，根癌農桿菌是一群特別偏食的家伙，最愛吃一類叫冠癭堿(氨基酸衍生物)的物質。對于根癌農桿菌來說，這種物質既是豐富的碳源，又含足夠的氮元素，能夠很好地滿足它們的生活所需。

可是，到哪里去找冠癭堿呢?一般情況下，正常生長的植物體內是沒有冠癭堿的。不過，這一點也難不倒根癌農桿菌。

農桿菌的細胞內除含通常的染色體外，還含有一種Ti質粒。質粒是許多原核生物細胞內具有的一類小型的環狀DNA，雖然它們對原核細胞本身并非是必需的，卻常常具有特殊的功能。農桿菌細胞內的Ti質粒上面就有一段能夠專門指導合成冠癭堿的基因。T是英文tumor(腫瘤)的縮寫，i是induce(誘發)的意思。Ti質粒就是誘發腫瘤的質粒。

可以說，Ti質粒就是農桿菌獲取美食的魔圈法寶。

設備簡陋　草船借箭

由于根癌農桿菌屬于原核生物，細胞內“設備”簡陋落后，缺乏葉綠體、線粒體等各種細胞器，甚至連像樣的細胞核都沒有，根本合成不了冠癭堿這種特殊的食物。

怎么辦呢?農桿菌并不發愁，因為它會“草船借箭”：通常，受傷的植物組織會產生酚類化合物。不遠處，一頭牛剛好蹭破一棵小樹的樹皮，還有害蟲咬破了一棵幼苗的表皮細胞。萬事俱備，正好東風吹來，一股一股的乙酰丁香酚的氣息飄來?！巴?，好香啊!一定是那里的植物細胞有隙可乘，讓我們快快行動起來吧!”農桿菌們興奮起來。

靠它們的鞭毛，沒幾個小時，根癌農桿菌們就在植物傷口的若干位點上附著了。附著好之后，它們立刻拿出內部的魔圈法寶――Ti質粒挨近一個個植物細胞。Ti質粒上的VirA，VirG基因首先活躍起來，接著激活了Vir區各個基因的表達，一些基因開始轉錄翻譯生成一些酶，這些酶幫助從質粒環上復制出單鏈的T-DNA，這里的T是Transfer(轉移)的意思，T-DNA鏈就是待轉移的DNA鏈；T-DNA鏈又與virE2蛋白結合形成T復合物；T復合物由細菌細胞中分泌出來進入植物細胞，接著又被攝入細胞核：奇妙的是，T-DNA一旦進入植物細胞核，就很容易地被整合進植物染色體基因組中去了；然后，借用植物細胞內的各種細胞器，包括內質網、高爾基體等等先進設施，植物細胞基因組上這段T-DNA基因開始表達產生冠癭堿，同時還生成許多植物激素。植物細胞在這些激素的作用下被追加速分裂生長，結果形成了腫瘤，即冠癭瘤。

由于每一個植物腫瘤細胞中也都含有指導冠癭堿合成的那段基因，于是合成了更多的冠癭堿。這時，根癌農桿菌可以在植物細胞外面守株待兔等著吃源源不斷的可口美餐了。

有趣的是，根癌農桿菌還有一個同屬兄弟，名叫發根農桿菌。它這兄弟也喜歡嗜食冠癭堿類物質，只是它們使用的方法不同。發根農桿菌不是在植物根莖部誘發腫瘤，而是在土壤深處的根部誘發毛狀根。

發根農桿菌細胞內的Ri質粒(Root Inducing plasmid)一樣能向植物細胞中轉移基因，誘發的植物毛狀根細胞內同樣能大量合成冠癭堿，滿足自己的需要。

基因載體　屢立奇功

在許多植物基因工程中，都需要利用基因載體來轉移目的基因?；蜉d體的種類很多，比如向大腸桿菌、酵母菌內轉移基因，人們一般利用噬菌體；向高等植物轉移基因，最好的載體就是農桿菌了，包括根癌農桿菌和發根農桿菌。

人們把農桿菌Ti質粒(或Ri質粒)上指導合成冠癭堿的那段基因替換成我們要轉移的目的基因，比如某種抗蟲基因，同時把誘導植物腫瘤(毛狀根)的基因去掉，這樣轉基因植物就能表現出我們要求的性狀，而不會產生冠癭瘤(或毛狀根)了。

過去，棉花遭受棉鈴蟲的危害，損失嚴重。蘇云金桿菌的體內有一種殺蟲蛋白基因Bt，其合成的殺蟲結晶蛋白會讓蠶食植物的害蟲得厭食癥而死。這是多好的殺蟲基因啊，要是能轉到農作物中就好了?？墒?，在過去，人們不能把它的殺蟲基因轉到植物細胞里面。后來，科學家想到了農桿菌。切掉“魔圈”上的冠癭堿合成酶基因和植物激素合成基因，換上蘇云金桿菌的殺蟲基因，就能讓農桿菌協助人類把殺蟲基因轉到棉花小苗中去了。等到棉花結鈴，棉鈴蛾飛來產下棉鈴蟲卵。新一代棉鈴蟲孵化出來后，開始吃含有殺蟲基因的棉花葉片和棉鈴，結果肚子疼起來了，然后滾落在地死掉了。

“鋤禾日當午，汗滴禾下土?！鞭r民伯伯種地，最辛苦的事情莫過于為莊稼除草了。要是能發明一種除草劑，噴灑到地里，既能清除雜草又不傷害莊稼，那該有多好啊。這不，科學家發現，一種土壤潮濕霉菌體內有抗草丁膦這類除草劑的基因bar?？茖W家就找來農桿菌，請它幫助把土壤潮濕霉菌的基因bar轉到煙草體內。農桿菌也很快地把抗除草劑的基因轉到了煙草體內。

此外，人們在一種突變的鼠傷寒沙門菌體內發現了抗另一類除草劑草甘膦的基因aroA，農桿菌也可以幫助人類把基因轉移到作物中去。

自從種植了含有抗除草劑基因的莊稼，農民再也不用辛苦地除草了。