免疫組織化學技術范文
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篇1
[關鍵詞]免疫組織化學染色； 質量管理； 標準化； 文獻綜述
[中圖分類號]R818.023[文獻標識碼]A [文章編號] 1005-0515（2010）-12-030-01
免疫組織化學染色技術的出現和發展給傳統病理學帶來了一場革命，使純形態學觀察的病理學發展成為形態與免疫信號相結合的現代病理學，免疫組織化學染色在病理診斷中的作用已得到廣泛的認同，具有特異性高、敏感性高、程序相對一致等特點，已成為病理診斷中不可缺少的重要輔助技術。免疫組織化學染色的方法與步驟復雜繁瑣，在應用中還存在不少問題，直接或間接地影響了最終的病理診斷，而且目前還沒有很好的標準化方案。縱觀免疫組織化學染色的全過程，重視染色應用中的環節問題，充分發揮病理診斷醫生和技術人員不同的質量保障作用，才能有效地利用好免疫組織化學染色這一有力工具。
1 診斷醫生涉及的環節問題
1.1 抗體配備的選擇：用于病理診斷的抗體種類很多，擁有抗體種類的多少與實驗輔助診斷水平有一定相關性。診斷醫生在決定科室內實驗抗體的選擇配備時，要不斷學習相關知識并根據科室實際情況選擇確定適用的有效抗體種類和數量。
1.2 抗體應用的選擇：每一種抗體的特性、適用范圍、可能產生的交叉反應等都不相同。決定抗體的實驗應用，是診斷醫生在形態學診斷的基礎上，根據鑒別診斷的需要選擇提出的，診斷醫生應不斷學習掌握相關知識，達到正確選擇適用的實驗抗體，而且應選擇聯合抗體配套使用，避免得到片面的結果，造成錯誤的解釋和診斷。
1.3 檢測片的選擇：很多病例的組織切片不止一張，不同切片中的組織成分常常不完全一樣。正確選擇檢測片是獲得正確每一組織化學染色結果的前提，應由診斷醫生正確選擇用于免疫組織化學染色的檢測片，避免由技術人員選擇可能出現的差錯。
1.4 陽性對照的選擇：每一組織化學染色過程比較復雜、影響因素也多，只有把握住陽性對照和陰性對照，所有的染色結果才容易判斷。陽性對照是由診斷醫生根據組織的不同情況設定的，診斷醫生應不斷加強相關知識的學習，正確運用陽性對照的表達。
2 技術人員涉及的環節問題
2.1 檢測片質量：因機械性損傷、電烙性損傷、固定工作人為差錯等原因導致的組織細胞外部或內部結構損傷及組織塊處理不良等都會引起組織化學染色效果不好。尤其組織固定，其目的在于良好地保持組織和細胞的生前結構及位置，以保證化學成分和各種酶類（抗原）在組織中的定位研究，但當前組織固定不良仍是技術中的主要問題，有關免疫組織化學技術、免疫組織化學質量控制、免疫組織化學標準化的文章和書籍，都對其有所闡述。諸如組織固定不及時、組織人為的變干導致的抗原損失，固定液種類和濃度不恰當使用造成的組織固定不良，固定時間、處理工藝掌握的差異影響的組織固定效果，等等，都會造成免疫組織化學染色效果不好。
2.2 抗原修復質量：抗原修復技術的應用提供了免疫組織化學標準化的基礎，但目前國內技術的最突出和最頑固的問題還是抗原修復質量問題，主要有修復溫度、時間掌握不利，修復液質量存在問題等。專業內普遍認為，甲醛等固定液造成組織抗原失活是影響免疫組織化學染色應用的重要原因，挽救因甲醛固定而失活的抗原是克服途徑之一，抗原修復是解決問題的焦點，目前最需要改進的方面就是要進行充分的抗原修復。
3 總結
縱觀免疫組織化學染色應用的全過程，為使免疫組織化學染色能真正地有效地為病理診斷服務，診斷醫生和技術人員應建立互相尊重、團結互助、共同提高、密切配合的和諧關系，共同努力爭取獲得合格的準確的免疫組織化學染色結果。病理診斷在臨床治療工作和醫院質量中舉足輕重，加強病理診斷工作的質量管理相當重要，科學的管理和規范化操作，是解決質量問題的關鍵。
為了促進免疫組織化學實驗的標準化，檢測免疫組織化學染色結果的可靠性，每次染色都應該進行有效的質量控制，保證室內質控、保證免疫組織化學染色的質量是全科室人員的責任。病理科主任應基于相當過硬的免疫組織化學診斷知識和豐富的免疫組織化學技術經驗，有責任指導監督科室內免疫組織化學質控工作，加強人員繼續教育工作，開展免疫組織化學相關知識的培訓提高工作。
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篇2
[關鍵詞] 胃原發性腫瘤；神經內分泌腫瘤；臨床病理分析
[中圖分類號] R36 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）07（c）-0106-02
神經內分泌腫瘤（neuroendocrine tumor，NET）是一組起源于肽能神經元和神經內分泌細胞的異質性腫瘤，可發生于全身許多器官和組織，其中以胃腸胰NET最常見，Yao等[1]研究發現NET的發病率近年來有上升的趨勢。本研究對發生于胃的18例NET患者進行分析，探討胃神經內分泌腫瘤（gastric neuroendocrine tumor，GNET）的病理特征及鑒別診斷方法，旨在提高對該病的認識。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集云浮市新興縣人民醫院病理科2005年7月～2012年12月18例胃原發性NET病例資料，包括原始取材記錄、HE切片、免疫組織化學技術染色切片和原病理診斷資料，其中，后期腫塊切除手術病理資料6例。所有病例資料中，男8例，女10例，中位年齡55歲，隨訪時間6個月～6年。
1.2 方法
所有標本經4%的甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋切片，HE染色和免疫組織化學技術染色，免疫組織化學技術采用PV-7000二步法，DAB顯色，突觸素（synaptophysin，Syn）、嗜鉻粒素A（chromaffin granule A，CgA）和Ki-67等試劑均購自北京中杉金橋生物技術公司。Syn、CgA陽性細胞胞質呈黃色顆粒狀，Ki-67為細胞核陽性表達，設陽性和陰性對照，光學顯微鏡下觀察組織學和免疫組織化學染色結果。通過門診復診、電話及郵件等方式隨訪。
1.3 分類標準
根據2010年WHO新的分類方法將胃腸NET分為3類：①NET，根據核分裂象與Ki-67指數分為NET 1級和NET 2級；②神經內分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC），根據細胞形態大小分為大細胞NEC和小細胞NEC；③混合性腺神經內分泌癌（mixed adenoneuroendocrine carcinoma，MANEC），要求每種腫瘤成分不少于30%[2]。
2 結果
2.1 臨床特點
患者臨床癥狀相似，主要為上腹部不適、隱痛，部分伴有黑便。發生部位：賁門1例，胃底6例、胃體6例，胃竇幽門部5例。腫瘤大小：手術切除病理資料6例中，腫瘤直徑為1.0～11.0 cm。腫瘤巨檢：隆起型11例、局限潰瘍型3例、浸潤型4例。
2.2 光學顯微鏡觀察結果
本研究中NET 14例，其中，男性5例，女性9例；鏡下腫瘤細胞較小，呈多邊形、卵圓形，胞質中等量，核圓較深染，染色質分面均勻，無明顯核仁，細胞排列可呈實心巢狀、結節狀、菊形團狀等，核分裂象少見，無壞死。NEC 3例，其中，男性2例，女性1例；小細胞NEC 2例，鏡下腫瘤細胞小或中等大，像淋巴細胞，大小約為成熟淋巴細胞的2倍，胞質少，彌漫性或成巢狀生長，核染色質均質細膩，核分裂象常見，灶狀壞死，胃鏡鉗取檢標本常被擠壓變形；大細胞NEC 1例，腫瘤由大細胞組成，胞質豐富，核空泡明顯，核仁突出，可見局部壞死。MANEC 1例，男性，鏡下見神經內分泌成分為小細胞NEC，腺癌成分為管狀腺癌，每種成分超過30%。
2.3 免疫組織化學技術染色結果
18例胃原發性NET中Syn和CgA均呈陽性表達，低級別NET呈彌漫性陽性表達，高級別NET陽性表達相對較弱，Ki-67在小細胞NEC中高表達（>60%+）。
3 討論
NET是一類起源于神經內分泌細胞的腫瘤，包含了由高分化到低分化的腫瘤譜系[3]。近年來，GNET的發病率逐年升高，占整個消化道NET的11%～41%。馮強等[4]報道，NET患者在女性中居多，而男性NEC發病率更高，本組NET和NEC患者中男、女比例分別為1∶1.8和2∶1，與報道相似。
GNET作為一個譜系，其發生發展是一個復雜的過程，組織學上由高到低，生物學行為上由傾向于良性到惡性，在同一腫瘤中其內分泌細胞會出現不同分化。多數低級別NET生長非常緩慢，如果發生轉移，通常局限于局部淋巴結和肝臟中，出現轉移并不影響長期生存。NET 2級腫瘤可能是一組多相性的腫瘤，這樣可以解釋其在不同的研究中具有不同的預后[5]。而高級別NET（包括NEC和MANEC）預后普遍較差，淋巴結轉移率高，脈管內癌栓發生率高，即便進行規范的根治及淋巴結清掃，術后總體生存期仍然較短。GNET的預后與諸多因素有關，因此，2010年WHO分類中，病理專家推薦病理報告中必須包括標本類型、腫瘤部位、大小和數目、浸潤深度和范圍、脈管和神經受累及情況、核分裂象數和（或）Ki-67陽性指數、神經內分泌標志物（Syn與CgA）、切緣情況、淋巴結轉移情況等，以供腫瘤分期與預后參考。本組14例低級別NET患者隨訪6個月～6年均存活，而4例高級別NET患者中，3例術后2年內死亡，1例術后5個月見肺轉移灶。以往的病理報告中，未要求對核分裂象數和Ki-67陽性指數作評估，本組實驗證實，兩者評估值越高，預后越差。
胃鏡檢查是發現GNET的重要手段，足夠量的活檢取材有助于提高確診率[6]。部分大細胞NEC鏡下特點與低分化腺癌難以區分，易被誤診為分化差的胃腺癌；胃鏡鉗取樣標本容易擠壓變形，導致部分小細胞ENC易與淋巴瘤相混淆。本組有1例大細胞NEC，最初診斷為低分化腺癌，1例小細胞ENC最初診斷為非霍奇金淋巴瘤，經免疫組織化學技術Syn和CgA染色陽性后確診為NEC。因此，免疫組織化學技術在具有腺樣結構的大細胞NEC和小細胞為NEC的鑒別診斷中作用巨大，對指導治療與預后判斷有重要意義，是目前明確診斷不可缺少的輔助檢查方法。
綜上所述，胃原發型NET在臨床表現方面較其他常見胃腫瘤無特異性，診斷與鑒別診斷主要依靠病理形態和免疫組織化學技術，正確的病理分型對治療和預后評估均有指導意義。
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篇3
【關鍵詞】胃癌 DEK蛋白：免疫組織化學：組織芯片
1材料與方法
1.1實驗材料 胃癌組織芯片
人胃癌組織芯片購置于上海芯超生物科技有限公司，組織芯片編號為200點的0D-CT-Dgstm01-002（90例胃癌，8例正常組織，12例其他器官對照組織，共110例）和62點的OD-CT-Dgsm03-003（31例胃癌和31例癌旁組織）。
1.2主要試劑
1.2.1 PBS緩沖液（PH：7.2-7.4）：購于美國CAMBREX公司；
1.2.2 枸櫞酸緩沖液（PH：6.0）：購于北京中山生物技術有限公司；
12.3 單克隆抗體：DEK抗體為美國US bio生物公司產品；
1.2.4 ABC免疫組織化驗試劑盒：購于北京華美生物工程公司。
1.3 實驗方法：
1.3.1免疫組織化學染色方法檢測DEK蛋白在胃癌中的表達
免疫組織化學染色方法根據ABC試劑盒說明書步驟進行。
1.3.2免疫組織化學染色結果判定
DEK蛋白以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性。蛋白表達采用雙評分半定量法進行評分。
1.4 統計學處理
應用SPSS13.0統計軟件處理分析，免疫組織化學染色結果分析采用卡方檢驗，P
2結果
2.1 DEK蛋白在胃癌中的表達見表1
2.2 DEK蛋白在胃癌不同組織學類型中的表達見表2
2.3 DEK蛋白的過表達與胃癌病理學行為的相關性見表3
3 討論
胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率局世界癌癥的第二位，在我國胃癌的死亡率局各種惡性腫瘤的首位。目前發現參與胃癌的發生發展過程的癌基因有C-met、ras、bcl-2、c-myc、survivin、Ki-67、CDK4和MMPs基因等。淋巴結轉移是胃癌侵襲轉移的重要方式，在胃癌的早期即可出現。有無淋巴結轉移對胃癌的治療方案產生重要影響。因此，早期發現淋巴結轉移并及時進行治療是改善胃癌預后、提高生存率的關鍵。
DEK蛋白廣泛存在于有機體的大多數細胞中，是一種豐富的細胞白，存在于大多數生物體中和一些單核細胞有集體中（小木軍除外）。研究發現DEK蛋白與自身免疫疾病的發生有密切相關，同時在許多惡性腫瘤比如膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、小細胞肺癌和肝癌中，DEK蛋白均有過表達。人類DEK蛋白是在急性粒細胞白血病（AML）亞型中作為一種融合蛋白，這種AML亞型的特征是有特殊的染色體異位（6；9）（p23；q34）。它廣泛存在于有機體的大多數細胞中（酵母菌除外）。人類的DEK蛋白由375個氨基酸組成。DEK蛋白定位于細胞核，主要分布與細胞核的常染色質，DEK的表達水平與細胞的生理狀態有密切相關，細胞增殖狀態時DEK表達水平升高。而靜止或終末分化狀態時細胞內的DEK表達水平降低。
我們利用胃癌組織芯片，通過免疫組化方法研究DEK蛋白在胃癌中的表達及病理學行為相關性。結果表明，DEK蛋白在胃癌中的陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組織，兩組間有非常顯著的統計學差異 （p
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篇4
【關鍵詞】cd44v5 胃癌 免疫組織化學 淋巴結轉移
在我國，胃癌(gastric carcinoma, gc)死亡率居消化系統各類癌癥死亡的首位，嚴重危害人類健康。胃癌浸潤和轉移是影響患者預后的主要因素，臨床和病理資料顯示，有60%以上的患者在確診時已發生腫瘤細胞的擴散和轉移[1]。淋巴結轉移是胃癌轉移的主要方式，是影響胃癌預后的獨立因素，評估淋巴結的轉移情況對決定術式、判斷預后具有重要意義[2]。目前發現腫瘤細胞表達多種 cd44的剪接變異體(cd44v)，其表達與腫瘤細胞的侵襲性、轉移性有關。在本研究采用免疫組織化學法對胃癌患者cd44v5表達進行研究，探討cd44v5表達與胃癌淋巴結轉移的關系。
1 材料和方法
1.1材料 濰坊醫學院附屬醫院2006年8月-2008年7月期間，經手術病理證實的48例胃癌患者的臨床資料、病理結果及標本蠟塊。其中男性30例，女性18例，年齡≥60歲38例，<60歲10例，有淋巴結轉移39例，無淋巴結轉移9例。分化好(包括高、中分化腺癌)16例，分化差(包括低分化腺癌、印戒細胞癌、粘液腺癌、類癌)32例。cd44v5單克隆抗體(兔抗人)、即用型sabc免疫組化檢測試劑盒、dab顯色試劑盒均購于美國mscn life生物技術有限公司。
1.2方法 采用免疫組織化學技術sabc法（抗體濃度1:80）對48例胃癌標本cd44v5的表達進行檢測。cd44v5免疫組化結果的判定，根據文獻報道，cd44v5在胞漿和胞膜都有表達，以膜上有cd44v5線樣表達作為陽性表達，連續計數10個高倍視野，根據有陽性表達的細胞數占細胞總數的百分比將cd44v5的表達分為以下四組：(1)陰性組：陽性細胞數百分比<5%；(2)弱陽性組：陽性細胞數百分比在6-35%之間； (3)陽性組：陽性細胞數百分比在36-70%之間；(4)強陽性組：陽性細胞數百分比>70%[3]。數據統計時將陰性和弱陽性組之和作為陰性組，陽性和強陽性組之和作為陽性組。將檢測結果與臨床資料對照分析，采用spss統計軟件處理，以α=0.05(雙側)作為顯著性檢驗水準。
2 結果
48例病例中cd44v5表達陽性28例(58.3%) (圖1，2)，表達陰性20例(41.7%) (見圖3)。cd44v5蛋白的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小及發生部位均無顯著關系(p>0.05)，與有無淋巴結轉移有關(p<0.05)，即發生淋巴結轉移的胃癌組織中，癌細胞中的cd44v5陽性表達率(24/39, 61.5%)明顯高于未發生淋巴結轉移的胃癌組織(4/9, 44.4%)。
3 討論
侵襲和轉移是惡性腫瘤標志性生物學行為。腫瘤浸潤轉移是腫瘤細胞與宿主間復雜、多步驟相互作用的結果，也是胃癌治療失敗和死亡的主要原因。liotta[4]首先提出浸潤轉移的三步學說：即粘附、降解和轉移。其中粘附是指腫瘤細胞通過自身細胞膜表面的粘附受體與細胞外基質成分間的相互作用。近年來研究發現,腫瘤細胞都是首先破壞細胞上的粘附分子而發生轉移的。
cd44v5是cd44的一個變異體，屬細胞表面黏附分子家族。cd44是一種在淋巴細胞和上皮細胞表面上發現的、高度糖基化的跨膜糖蛋白[5]。是一類多結構、多功能的細胞表面黏附分子，廣泛存在于細胞與細胞間和細胞與細胞外基質間。其基因組結構包括20個外顯子。前面5個和最后5個外顯子是恒定的，中間的10個外顯子是可變的，形成可變區。它可以通過 10個可變外顯子的選擇性剪接及糖基化產生多種變異體。目前發現腫瘤細胞表達多種cd44的剪接變異體，其表達與腫瘤細胞的侵襲性、轉移性有關。cd44是多功能的受體，介導細胞與細胞間、細胞與基質間的交互作用、細胞移動、淋巴結歸巢、遷移細胞的生長因子的表達、傳遞生長信號等。cd44還參與降解ha，傳遞信號調節造血和凋亡。許多癌細胞及其轉移灶都有高水平表達。cd44特別是它的變異體常用來診斷或作為判斷人類惡性疾病的指標[6]。cd44v表達與惡性腫瘤的浸潤轉移有關的機理可能是：cd44分子的氨基酸末端細胞外區域能與細胞外間質及基底膜的透明質酸結合，從而調節細胞運動及形態，cd44v與透明質酸結合而“錨”定在宿主細胞外間質及基底膜上，同時cd44v陽性細胞更易與后小靜脈中的高柱狀內皮細胞結合，使腫瘤細胞更易進入淋巴系統和循環系統。
cd44不同變異型在不同的組織中的表達的報道各不相同。有學者報道cd44可以存在于正常組織中[7]，另一些人則認為cd44只在惡性組織中表達[8]。普遍認為，cd44與胃癌的轉移、進展、預后有關。王書奎[9]等采用流式細胞術對39例胃癌患者的癌灶、癌旁組織、淋巴結轉移灶和外周血的cd44v5表達率進行檢測和對比，結果胃癌患者不同組織的cd44v5陽性細胞檢出率顯著高于對照組，胃癌患者的各種組織中，伴腫瘤轉移患者的cd44v5細胞檢出率均顯著高于未轉移者。muller[10]用免疫組化方法檢測胃癌中的cd44v5，cd44v5的表達與胃癌病理分級、淋巴結累及、血液和淋巴浸潤有關。cd44v5陽性病人的總體生存率明顯低于陰性病人。
目前研究表明cd44v5與胃癌的一些生物學行為，尤其是侵襲和轉移有一定的關系，但是關于其在胃癌中的作用尚有不少分歧。ham等認為cd44v5的表達與胃癌的淋巴結轉移有關。muller等研究結果提示cd44v5在有淋巴結轉移的胃癌中的表達率與無淋巴結轉移的胃癌患者的差別無統計學意義。本研究中，淋巴結轉移組陽性率61.5%(24/39)高于無淋巴結轉移組44.4% (4/9)，與ham等認為cd44v5的表達與胃癌的淋巴結轉移有關的論點一致。在胃癌組織中，cd44v5表達與胃癌淋巴結轉移有關，因此我們認為cd44v5可以作為判斷胃癌惡性程度和預后的參考指標。
圖1 病理證實為透明細胞癌，cd44v5免疫組織化學染色（×400）示成片的瘤細胞胞漿、胞膜被染成棕黃色。按shimizu方法，陽性細胞數百分比>70%，劃為強陽性組。
圖1
圖2 病理證實為腺癌，cd44v5免疫組織化學染色（×400）示大部分瘤細胞胞漿、胞膜被染成棕黃色。按shimizu方法，陽性細胞數百分比在36-70%之間，劃為陽性組。
圖2
圖3 病理證實為腺癌，cd44v5免疫組織化學染色（×400）未見陽性細胞，劃為陰性組。
圖3
參 考 文 獻
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篇5
關鍵詞： 輸尿管梗阻； 纖維化； 姜黃素； 免疫組織化學； 大鼠，Spragua-Dawley； 腎間質
腎間質纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病進行性發展的共同最終通路，延緩腎間質纖維化的發展，可降低終末期腎病(ESRD)的發生率［1］。姜黃素是姜黃中提取的一種植物多酚，也是姜黃發揮藥理作用最重要的活性成分。近年來的研究不僅證明了姜黃的傳統作用，而且還揭示出一些新的藥理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗人類免疫缺陷病毒、保護肝臟和腎臟、抗纖維化以及防癌抗癌等作用，而且無明顯的毒副作用［2］。2007年5~8月研究了姜黃素抑制腎間質纖維化的作用機制，其中重在研究姜黃素對在單側輸尿管梗阻（UUO）模型大鼠中腎間質中轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的影響，希望在臨床上研制出有效藥物。
1 材料與方法
1.1 材料
雄性、無特定病原體動物級（specific pathogen free, SPF）、Sprague-Dawley大鼠[同濟醫學院動物中心提供，生產許可證：SCXK（鄂）2004-0028]30只，7 w齡，體重(180.2±8.35)g。動物房飼養環境為每籠6只，每24 h換1次墊料，喂以正常飲食，自由進水，溫度為（24±2）℃，相對濕度為（45±3）%。姜黃素純度為＞95%（美國Sigma公司）；兔抗大鼠TGF-β1、CTGF 多克隆抗體及SP免疫試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 造模 適應性飼養1周后，按照完全隨機設計方法，以體重由輕到重的順序編號用隨機排列表法分為假手術組、模型組、姜黃素組各10只。假手術組和模型組每天給予蒸餾水2 ml灌胃，姜黃素組將姜黃素粉末（200 mg·kg-1·d-1）混懸于2 ml蒸餾水中灌胃，術前1 d開始給藥。造模方法：模型組和姜黃素組行右側輸尿管結扎術，質量濃度為20 g/L戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，行正中豎切口打開腹腔，分離右側輸尿管并行雙結扎，假手術組只分離但不結扎。于術后第14天處死所有大鼠，處死前下腔靜脈取血3 ml做血生物化學檢驗并行腎原位灌流去除血細胞。取右側腎臟，縱切為兩部分，一部分用體積分數為4%的多聚甲醛溶液浸泡24 h做病理及免疫組織化學檢測，另一部分速凍于-70 ℃冰箱。
1.2.2 BUN、Scr檢測 采用自動生化分析儀(Beckman CX3 Delta)進行BUN、Scr的檢測。
1.2.3 免疫組織化學檢查 SP法檢測腎組織中的TGF-β1、CTGF表達，按SP試劑盒說明書進行。每張切片不含腎小球的腎小管間質區域，隨機選取8個高倍鏡視野（400倍），用免疫組織化學分析軟件系統HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統（同濟醫學院清屏影像公司）對所選視野內的棕黃色陽性信號進行圖像分析，計算各組大鼠腎組織TGF-β1、CTGF的平均陽性表達率，即棕黃色陽性信號占整個視野的百分比。
1.2.4 腎組織病理檢查 右側腎組織行Masson染色，光鏡觀察腎間質纖維化情況。間質纖維化定量分析也借助HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統，取Masson染色切片，每張切片觀察8個不含腎小球，互不重疊的間質高倍鏡視野（400倍），計算每張切片腎間質綠染面積占整個視野的百分比。
1.3 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件處理數據，計量數據采用(x±s)表示，組間比較用單因素方差分析和兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 血生化檢查
模型組和假手術組比較BUN、Scr都顯著升高（P＜0.01），姜黃素組和模型組比較，BUN、Scr都顯著降低（P＜0.01）。見表1。
2. 2 免疫組化TGFβ1、CTGF的表達
模型組與假手術組比較，TGFβ1、CTGF的表達都顯著上調（P＜0.01），而姜黃素組與模型組比較都顯著抑制了其表達（P＜0.01）。見表1、圖1和圖2。
2.3 腎組織病理改變
模型組中腎間質增寬，可見間質細胞增多，膠原成分增加，出現明顯的纖維化。模型組與假手術組比較，P＜0.01；姜黃素組與模型組比較，腎間質的膠原成分顯著減少（P＜0.05）。見表1和圖3。表1 各組BUN、Scr、TGF-β1、CTGF及Masson染色面積比的改變情況(1)與假手術組比較P＜0.01；(2)與模型組比較P＜0.01，(3)P＜0.05
篇6
【關鍵詞】 喉鱗癌;claudin3;ecadherin;免疫組織化學
【摘要】 目的 檢測claudin3及上皮型黏附素(ecad)在喉鱗癌中的表達，探討二者在喉鱗癌發生發展及轉移中的作用。方法 應用免疫組織化學法檢測98例喉鱗癌組織及30例正常喉黏膜組織中claudin3、ecad蛋白的表達情況，并將檢測結果與臨床病理特征進行綜合分析。結果 claudin3蛋白陽性表達主要定位于喉鱗癌癌旁正常黏膜細胞質和細胞膜，ecad蛋白陽性表達主要定位于喉鱗癌癌旁正常黏膜細胞膜，claudin3、ecad蛋白在喉鱗癌中表達的陽性率明顯低于正常黏膜。喉鱗癌中claudin3和ecad蛋白的表達與腫物大小、分化程度、有無甲狀軟骨累及和淋巴結轉移密切相關。結論 claudin3和ecad在喉鱗癌組織中表達下調，二者可能與喉鱗癌的發生發展有關，聯合檢測claudin3和ecad可能與喉鱗癌的預后密切相關。
【關鍵詞】 喉鱗癌;claudin3;ecadherin;免疫組織化學
喉鱗癌的發生發展是涉及多個蛋白水平的變化，而細胞間的黏附力丟失常導致細胞連接的破壞〔1〕。claudin3是緊密連接的主要跨膜蛋白，此蛋白在細胞間傳輸轉運中起重要接頭作用，是細胞黏附功能的基礎，研究表明claudin3在眾多腫瘤組織中異常表達〔2〕。ecad是鈣依賴的黏附素家族的一個經典成員。本文應用免疫組織化學方法檢測喉鱗癌組織中claudin3和ecad蛋白的表達情況，并分析其與臨床病理特征的相互關系，以深入探討二者在喉鱗癌發生發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
收集2005年8月至2008年8月本院病理科喉鱗癌切除標本作為實驗組，共98例，年齡為31～79(平均51.3)歲。其中男76例，女22例，有淋巴結轉移的35例，無淋巴結轉移的63例，術前均未進行放化療，同時選取30例癌旁正常黏膜組織為對照組。
1.2 試劑
實驗用的兔抗人claudin3多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，鼠抗人ecad單克隆抗體，sp和dab顯色試劑盒均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。
1.3 免疫組織化學方法檢測二種蛋白的表達
claudin3和ecad蛋白的表達應用免疫組織化學sp法進行。主要步驟：①將5 μm切片脫蠟水化后，用pbs沖洗3次，每次3 min。②用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復。③每張切片加1滴過氧化物阻斷溶液(試劑a)，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min。④pbs沖洗3次，每次3 min。⑤甩去pbs液，每張切片加1滴非免疫性動物血清(試劑b)，室溫下孵育10 min。⑥甩去血清，每張切片加1滴第一抗體，室溫下孵育60 min或4℃過夜。⑦pbs沖洗3次，每次3 min。⑧甩去pbs液，每張切片加1滴生物素標記的第二抗體(試劑c)，室溫下孵育10 min。⑨pbs沖洗3次，每次3 min。⑩甩去pbs液，每張切片加1滴鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液(試劑d)，室溫下孵育10 min。pbs沖洗3次，每次3 min。甩去pbs液，每張切片加2滴新鮮配制的dab溶液，顯微鏡下觀察3～10 min，陽性顯色為棕色。自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，pbs沖洗返藍。切片經梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。
1.4 結果判定標準
claudin3蛋白陽性染色位于細胞膜和細胞質，光鏡下以細胞膜與細胞質同時出現棕黃色著色為陽性細胞，細胞無著色或者單純細胞質著色、細胞膜著色為陰性細胞。ecad蛋白陽性染色位于細胞膜，呈棕黃色為陽性細胞，細胞無著色或者淡黃色為陰性細胞。合并計算高倍鏡下(×400)隨機選擇的5個視野中陽性細胞占全部計數腫瘤細胞的百分率，平均每個視野細胞質(膜)呈陽性反應的細胞數≥10%為陽性，無明顯陽性反應或陽性反應的細胞數<10%為陰性。
1.5 統計學分析
采用sas6.12軟件進行χ2檢驗。
2 結 果
2.1 claudin3和ecad在喉癌與正常黏膜中的表達
claudin3和ecad在喉鱗癌中表達的陽性率明顯低于正常黏膜(p<0.000 1)。見表1，圖1。表1 claudin3和ecad在喉癌與正常黏膜中的陽性表達
2.2 claudin3和ecad的表達與喉鱗癌臨床病理特征的關系
喉鱗癌claudin3和ecad蛋白的表達與腫物大小、分化程度、有無甲狀軟骨累及和淋巴結轉移情況密切相關，而與患者的年齡及性別無明顯相關。見表2。圖1 ecad和claudin3在喉癌組織和正常黏膜組織中的表達(×400)表2 claudin3和ecad的陽性表達與喉鱗癌臨床病理特征的關系
3 討 論
claudins是一類跨膜蛋白，是從雞肝中得到的一種緊密連接的片段，迄今在人體內發現至少有24種不同蛋白，分子量大約為20～27 kd之間。近年有研究顯示，多種上皮性惡性腫瘤claudins有異常表達，并且與這些腫瘤發生和發展有密切關系〔1〕。claudin3是其家族的重要成員，不僅具有調節細胞間物質流動和維持上皮細胞極性的功能，而且還參與細胞增殖分化、基因轉錄、腫瘤抑制等過程。但我們發現claudin3在不同腫瘤中的表達并不完全相同。soini等〔3〕通過免疫組化研究表明claudin3在腎癌、膀胱癌中的表達下調。long等〔4〕利用northen印跡發現在人類前列腺上皮中，claudin3基因轉錄的mrna量較周圍正常組織明顯增高，同時用免疫組化發現claudin3蛋白在骨轉移灶中的表達也是增高的。resnick〔5〕等發現claudin3在腸型胃癌中是高表達的。但是claudin3在喉鱗癌中的表達未見報道。黏附素是一組ca2+依賴跨膜蛋白，包括至少9個基因家族，其中以ecad最為重要，是鈣依賴的黏附素家族的一個經典成員。近年來，有關緊密連接蛋白及黏附分子功能的研究日趨增多，并證實了其在腫瘤發生發展中的重要作用〔6〕。當腫瘤組織中ecad發生結構功能異常，如轉錄受抑、基因突變、啟動子區域甲基化、β連接蛋白磷酸化時，其細胞黏附功能發生障礙，不僅可使細胞分化降低，而且可致腫瘤細胞侵襲性生長，并易脫離原發部位，向深部浸潤而發生局部或遠處轉移。本實驗通過免疫組織化學方法檢測claudin3和ecad在喉鱗癌中的表達，發現claudin3、ecad的陽性表達率比對照組明顯降低，且都與喉癌的分化程度、腫物大小、是否累及甲狀軟骨及有無淋巴結轉移密切相關。這些結果既提示claudin3和ecad在喉癌發生發展中可能起相當重要的作用，又由于分化程度、腫物大小、是否累及甲狀軟骨及有無淋巴結轉移是與喉鱗癌患者預后密切相關的因素，因此提示二者低表達可能與患者的預后不良密切相關。claudin3促進腫瘤生長可能有：①引起緊密連接屏障的破壞，導致營養素、生長因子和其他活性分子向腫瘤內部轉運，促使腫瘤處于生長狀態。②claudin3下調的腫瘤細胞不能進入細胞程度性死亡過程，促進腫瘤的發生和發展〔7〕。而claudin3與ecad可能共同參與特定細胞連接與黏附信號的傳遞，影響細胞遷移，進而促進腫瘤的發生發展。
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篇7
【關鍵詞】 眼瞼; 基底細胞癌; Survivin; 統計分析
眼瞼基底細胞癌(basalcell carcinoma，BCC)是最常見的眼瞼惡性腫瘤，約占眼瞼惡性上皮性腫瘤的85%～95%[1]。研究顯示多種癌基因的異常表達在眼瞼BCC的發生發展過程中有重要作用，研究癌相關基因抗原在BCC發生、發展及轉移機制中的作用，對于揭示BCC的生物學行為及探索有效的防治方法有重要意義。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 標本來源 收集武漢市中心醫院和武漢大學中南醫院病理科 2002 ～ 2009 年手術切除及活檢的眼瞼基底細胞癌( basalcell carcinoma，BCC)標本共20例，另取癌周圍正常組織5例作對照。所有標本均經10%甲醛固定， 常規HE染色，光鏡觀察，病理檢查確診。
1.1.2 主要試劑 即用型鼠抗人Survivin單克隆抗體(北京中山生物技術有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒(福州邁新生物有限公司);DAB顯色試盒及多聚賴氨酸(北京中山生物技術有限公司)。
1.1.3 主要儀器 YWY781型醫用微波儀，250W，50Hz，浙江臨安電子器材廠生產;家用高壓鍋。
1.2 方法
1.2.1 常規HE染色 取材、固定、脫水、透明、切片和HE染色。
1.2.2 免疫組織化學SP法檢測Survivin抗原 主要步驟： ① 4μm組織切片常規脫蠟至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修復(檸檬酸緩沖液微波抗原修復法)，室溫自然冷卻后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內源性過氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;④正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景;⑤ 甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;⑥ 滴加生物素標記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS(Pp 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復合物37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應時間(約3～5 min)，自來水沖洗終止反應; ⑨ 蘇木素復染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍;⑩ 梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢;用PBS代替一抗作為陰性對照。
1.3 免疫組織化學結果判斷
Survivin抗原以細胞漿或胞核出現棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照除細胞核染成藍色外，細胞漿或胞核內無棕黃色反應物。
采用HPIAS2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(同濟千屏影像公司)對細胞漿或胞核的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積×100%)。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。
1.4 統計學處理
數據以均數±標準差表示，用SPSS11. 5 軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q) 檢驗，檢驗水準α為0.05。
2 結果
2.1 HE染色
瘤體由基底樣細胞組成，細胞核大，呈圓形或橢圓形，胞漿為嗜堿性，可見少量核分裂相。瘤體周邊細胞呈柵欄狀排列。腫瘤周圍結締組織增生，有較多纖維母細胞，產生膠原纖維包繞在瘤體周圍。
2.2 Survivin的表達
基底細胞癌組織中可見癌細胞胞漿內棕黃色顆粒較多，Survivin表達呈陽性;癌旁組織的細胞胞漿內可見極少量的棕黃色顆粒，Survivin表達呈陰性。圖像分析結果顯示：眼瞼基底細胞癌Survivin表達的平均光密度為0.3853±0.0254，癌旁組織Survivin表達的平均光密度為0.0246± 0.0029; 眼瞼基底細胞癌Survivin表達的陽性面積率為0.3520±0.0263;癌旁組織中Survivin表達的陽性面積率為0.0305±0.0021。經單因素方差分析，組間有顯著性差異(P
3 討論
基底細胞癌是眼瞼最常見惡性腫瘤，常發生于長期暴露于陽光下的中年以上的人群，男性略多，好發于下瞼及內眥，病變位置表淺， BCC 是生長緩慢的腫瘤，病程一般較長， 最長可達20年。BCC一般只局部侵襲， 很少轉移， 但若不及時治療， 腫瘤可侵及眼輪匝肌、瞼板和眶骨， 并可經眼眶向顱內侵犯。近年來隨著人口的高齡化， BCC有逐漸增多的趨勢[2，3]。
人Survivin基因位于17號染色體端粒部位，基因總長度14. 7KB，包含4個外顯子和3個內含子。Survivin作為IAP家族中最小的1個新成員，結構獨特。它只含有1個B IR結構，該結構被認為是Survivin發揮抗凋亡作用的部位[5～7]。目前普遍接受的觀點是， Survivin作用于各個凋亡途徑的匯集點: 直接抑制終末效應蛋白caspase9、caspase3和caspase7。最新發現Smac分子是與細胞色素C同時從線粒體釋放出來的具有拮抗IAP 作用的蛋白小分子， 它是通過其NH2 末端與IAP分子結合而抑制后者的功能。受Smac分子作用的啟發，大量的工作致力于發現能與IAP結合的非肽類小分子化學物質，這些小分子能夠通過模擬Smac分子的作用而誘導腫瘤細胞凋亡[8～10]。
Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關[11]。現已發現，Survivin在所有常見惡性腫瘤中表達，如乳腺癌、胃癌、腎癌、黑色素癌、腸癌、神經母細胞癌和卵巢癌等，而在正常組中無表達。它的這一特性，使得靶向Survivin的免疫治療和基因治療能夠促進腫瘤細胞的凋亡，抑制其增殖，正常組織卻能不受損傷和影響。Survivin可以作為抗腫瘤免疫治療的一個廣泛適用的靶基因[12～15]。
實驗采用免疫組織化學方法觀察了Survivin在眼瞼基底細胞癌組織和癌旁組織中的表達，實驗表明眼瞼基底細胞癌與癌旁組織之間，Survivin的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異(P
目前，關于Survivin在腫瘤中的研究已經取得了一定的進展，但是還有不少方面需要更深入地進一步研究。如Survivin與腫瘤發生發展及其臨床預后的相關性，Survivin在細胞漿和細胞核中的表達受到何種調節，Survivin的各種異構體之間的關系及作用，以及Survivin在腫瘤靶向治療中的作用等都需要我們去探究。
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篇8
【關鍵詞】 IgA腎病；腎組織；抗原
IgA腎病也稱為Berger病， 是指患者腎小球系膜區域內有IgA或IgA沉積， 可伴隨腎小球系膜區域有其他免疫球蛋白沉積的原發性腎小球病變。該病是終末期腎病的重要誘導因素[1]， 其發病機制尚不明確， 目前認為由免疫、遺傳和環境因素共同引發IgA腎病[2]。已有調查表明， IgA腎病患者35%～40%伴隨有上呼吸道感染癥狀， 而人巨細胞病毒（HCMV）和腺病毒（ADV）等和上呼吸道感染之間有密切關聯。同時， IgA腎病患者乙型肝炎病毒（HBV）感染率明顯比健康人群高。為對HCMV、AdV、HBV抗原在IgA腎病患者腎組織中的表達和其意義進行探討， 作者選取34例IgA腎病患者， 利用免疫組織化學技術對腎組織中HCMV、AdV、HBV抗原進行檢測， 現將相關情況報告如下。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 選取本院于2011年7月～2013年8月診治IgA腎病患者34例， 所有患者均臨床癥狀、輔助檢查結果均與WHO 1999年制定的IgA腎病診斷標準相符， 其中男20例， 女14例， 患者年齡為31～58歲， 平均為（42.3±2.5）歲；病程為1～5周， 平均（2.6±1.1）周；所有患者均有不同程度水腫、高血壓， 24 h尿蛋白定量1～3 g， Lee氏分級為Ⅰ～Ⅳ級。
1. 2 方法 取IgA腎病患者腎活檢組織， 利用免疫組織化學技術檢測腎組織中HCMV、AdV、HBV抗原表達情況。在檢測中所用鏈霉親和素-生物素復合物（sABC）試劑盒、DAB顯色試劑盒、鼠抗人HBsAb多克隆抗體與鼠抗人HCMV抗原單克隆抗體均由北京中杉金橋生物技術公司提供。鼠抗人AdV抗原單克隆抗體均由Neomarkers公司提供。利用sABC法進行檢測， 操作步驟為：載玻片徹底清洗組織包埋切片撈取組織脫蠟抗原修復封閉血清一抗二抗將sABC加入加入顯色劑復染脫水封片。
2 結果
2. 1 IgA腎病患者腎組織中HCMV與AdV的表達 腎組織中HCMV主要表達部位是腎小管與腎小球， 且隨著腎小球與腎小管間質破壞程度越嚴重， HCMV表達越高；AdV主要表達部位是腎小管上皮細胞， 部分在腎小球中表達， 少部分在腎間質中表達。
2. 2 IgA腎病患者腎組織中HBsAg的表達 在IgA腎病患者腎組織中， HBsAg主要表達部位為腎小管上皮細胞， 部分可在腎小球與腎間質中表達。HBsAg表達和腎小球與腎小管間質破壞程度間無相關性。
3 討論
IgA腎病是臨床常見腎小球病變， 在普通人群中發病率高于1%， 預后較差， 每10年內約有20%患者進至終末期腎病階段。IgA腎病發病隱匿， 病程較長， 主要有反復發作的鏡下血尿或肉眼血尿， 可伴隨不同蛋白尿、高血壓或腎功能不全癥狀。患者通常是在行常規尿檢時才發現， 其診斷、觀察病理損傷情況、評估病情進展等均需利用腎組織活檢實現[3]。
IgA腎病患者通常會伴隨上呼吸道感染癥狀， 其中最常見的為扁桃體炎， 而在 IgA腎病患者中可發現扁桃體免疫學異常。當通過手術將扁桃體切除后， IgA腎病臨床癥狀可得到明顯緩解， 部分患者IgA腎病主要癥狀甚至會完全消失， IgA腎病得到有效抑制， 轉變成腎功能不全， 由此可見IgA腎病起病、發展均和扁桃體免疫異常有重要關聯。而HCMV與ADV是上呼吸道感染常見病因， 特別是和扁桃體發炎之間有密切聯系， 由此可推斷， HCMV與ADV和IgA腎病起病有一定關系。國內外多數專家認為， HBV感染和和IgA腎病發病與進展有密切聯系， HBV抗原引發IgA腎病的機制為：當患者感染HBV抗原后， 血液循環與體內血清中的抗體會構成免疫復合體， 在病程遷延下， HBsAg復合體數量會明顯增加。同時， 血液中持續存在HBV會對肝細胞造成損傷， 導致肝細胞對免疫復合體清除的能力減弱， 致使腎臟中有大量免疫復合體沉積， 最終引發IgA腎病。本次研究通過免疫組織化學技術對HCMV、AdV、HBV抗原和IgA腎病間的關系進行探討， 結果表明， 在IgA腎病腎組織中， HCMV主要在腎小管、腎小球中表達， 且表達陽性率可達90%甚至更高， 同時， 在腎間質中存在大量炎細胞浸潤細胞；隨著患者腎小球與腎小管間質破壞程度越嚴重， 其HCMV表達程度越高。AdV主要表達部位是腎小管上皮細胞內， 部分在腎小球中表達， 少部分在腎間質中表達；在腎遠曲小管內， AdV表達率可達95%， 同時在腎間質中有炎細胞浸潤現象。HBsAg主要在腎小管上皮細胞， 部分可在腎小球與腎間質中表達。
綜上所述， 腎組織中HCMV、AdV、HBV抗原的表達和IgA腎病的發病及發展相關， 可作為IgA腎病診斷與觀察病情進展的重要指標。同時， 在日常生活中加強HCMV、AdV、HBV感染的預防， 以促使IgA腎病發生率大幅降低；在IgA腎病治療中， 應將抗HCMV、抗AdV與抗HBV和IgA腎病治療有機結合起來， 對這一疾病發展予以有效控制。
參考文獻
[1] 張建周. IgA腎病采用糖皮質激素治療臨床效果觀察.中國現代藥物應用， 2013， 7（8）：78-79.
篇9
【關鍵詞】 骨肉瘤; Fascin基因; 免疫組織化學; 圖像分析; 統計分析
骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生長相應發病高峰期最常見的原發性惡性腫瘤。其發生率約為0.1/10萬， 其惡性度高，進展快，預后差，且以青少年好發。多發于10～20歲的青少年的長骨， 尤以股骨下段和脛骨上段多見[1]。占骨惡性腫瘤的20%左右，肺轉移是其主要死亡原因，80%的病例在確診時已有肺部微小轉移灶。骨肉瘤早期臨床癥狀無特異性，且病情進展較快，大多數病例就診時已經進入臨床ⅡB期[2～4]。Fascin基因屬于fascins家族，其蛋白質編碼產物是一種結構獨特、進化保守的肌動蛋白( actin)交聯蛋白，位于細胞膜皺褶、微棘及應力纖維，在各種轉化細胞中促使細胞膜突起并增加細胞運動性。近年來的研究發現， fascin在許多惡性腫瘤組織細胞中表達上調，在惡性腫瘤的進展中起重要作用[5～7]。研究通過應用免疫組織化學方法和圖像分析技術檢測骨肉瘤及良性骨軟骨瘤組織中fascin基因的表達水平，并進行了統計學分析，探討Fascin基因在骨肉瘤發生、發展過程中的作用機制，為臨床上防治骨肉瘤提供理論依據。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 材料來源及分組 收集武漢市四大三級甲醫院病理科2000～2008年骨肉瘤存檔蠟塊20例及良性骨軟骨瘤存檔蠟塊5例。所有切片經病理學專家診斷為骨肉瘤及良性骨軟骨瘤。
1.1.2 材料 采用免疫組織化學SP法檢測Fascin基因在骨肉瘤與良性骨軟骨瘤組織中的表達。
1.2 主要試劑和儀器
1.2.1 主要試劑
①Fascin兔抗人多克隆抗體(北京中山生物技術有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒(福州邁新公司);③DAB顯色試盒及多聚賴氨酸(北京中山生物技術有限公司)。
1.2.2 主要儀器 ① YWY781型醫用微波儀，250 W，50 Hz (浙江臨安電子器材廠生產);② 家用高壓鍋;③ 電熱恒溫干燥箱 (湖北黃石醫療器械廠生產);④ 顯微鏡成像系統 (Olympus公司)。
1.3 方法
蠟塊切片厚5μm，貼片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上，置于烤箱烤干待用。免疫組織化學SP法檢測Fascin基因相關抗原 具體步驟：① 4μm組織切片常規脫蠟至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修復(檸檬酸緩沖液微波抗原修復法)，室溫自然冷卻后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內源性過氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;
④ 正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景;⑤ 甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;
⑥ 滴加生物素標記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物復合物37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應時間(約3～5 min)，自來水沖洗終止反應;
⑨ 蘇木素復染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍;⑩ 梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢;用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為陽性對照組。
1.4 免疫組織化學結果判斷
Fascin陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細胞核和胞質內。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(同濟千屏影像公司)對Fascin基因的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400) ，測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積×100%)。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。
1.5 統計學處理
數據以均數±標準差表示，用SPSS11. 5 軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q) 檢驗，檢驗水準α為0.05。
2 結果
Fascin基因的表達：在骨肉瘤組中可見密集分布的棕黃色顆粒，Fascin基因表達呈陽性;在良性骨軟骨瘤組中可見少量的棕黃色顆粒，Fascin基因表達弱陽性或陰性。圖像分析結果顯示: 骨肉瘤組Fascin基因表達的平均光密度為0.2659±0.009， 良性骨軟骨瘤組Fascin基因表達的平均光密度為0.0886±0.0043; 骨肉瘤組Fascin基因表達的陽性面積率為0.2994±0.0080， 良性骨軟骨瘤組Fascin基因表達的陽性面積率為0.0987±0.0056，經單因素分析骨肉瘤組與良性骨軟骨瘤組比較，差異有顯著性(P
3 討論
原發性惡性骨腫瘤是罕見的，只占所有新癌癥病例的0.2%。這些罕見腫瘤的治療是復雜的，對骨外科來說是一項重大的挑戰。骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生長相應發病高峰期最常見的原發性骨腫瘤。近年來強度新佐劑和佐劑化療的使用使得這種疾病患者得以存活。無復發存活率已經從沒有進行化療的不足20%提高到了使用手術和多化療相結合治療的55%～70%[8～10]。完全手術切除和術前化療良好的組織學反應是患者疾病定位最重要的預后指標。患者術前化療反應良好(>90%壞死)5年存活率為75%～80%，與此相比那些化療反應差的(
人類Fascin基因是由Bryan等[13]20 世70 年代從海膽母細胞中發現的，其蛋白質編碼產物是一種分子量為55 kDa 的細胞骨架蛋白[14～15]，Fascin蛋白N端11～50之間的氨基酸殘基高度保守，其中第39位的絲氨酸為蛋白激酶C的磷酸化位點，該位點的磷酸化可調節Fascin蛋白與F肌動蛋白的結合活性以及細胞膜表面絲狀偽足和微棘的形成，提示Fascin蛋白可能在細胞遷移、細胞黏附以及細胞間信息交流等過程中發揮作用[16，17]。研究發現， 在正常上皮細胞中Fascin表達較低或缺失， 然而在胃癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤中Fascin1 表達上調[18～20]。
本實驗結果顯示，Fascin基因在骨肉瘤的表達明顯高于對照組(P
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篇10
【關鍵詞】 子宮頸腺癌 子宮內膜腺癌 p16 鑒別診斷
【Abstract】 Objective:TObjectives Observation of p16 protein in cervical adenocarcinoma and endometrial cancer in the differential diagnosis of significance. Also part of the guideline on early cases whether the fertility preservation. Methods SP with Immunohistochemistry assay for the detection of cervical adenocarcinoma and 40 examples of 73 cases of endometrial carcinoma p16， p53， ER and PR of the expression. Results (1) the p16 in 40 examples of cervical adenocarcinoma in 37 cases (92.5%) is diffuse and positive， in 73 cases of endometrial carcinoma in 28 patients (38.4%) is of positive. (2) in cervical adenocarcinoma in p53， ER， PR positive expression of various 20.0% and 5.0% and 7.5%， while in endometrial cancer in p53 38.4% overexpression， Hormone receptor ER， PR in endometrial cancer respectively 78.1% and 71.2% expression. In cervical adenocarcinoma p16 protein in the diffuse nuclear and cytoplasmic-positive， and histological forms resemble endometrial carcinoma irregular of positive， and the overall strength is low . In cervical adenocarcinoma p16 protein displayed prevalent， the strength of expression in to， and histological forms resemble endometrial carcinoma is the weaker of positive. P16 protein p53 protein detection at the joint， hormone receptor ER， PR will not only identify cervical adenocarcinoma and endometrial cancer， can also be used for uterine serous carcinoma and endometrial cancer diagnosis. Conlusions Consultation on biopsy or scraping of uterine cancer samples， selection of p16 protein detection can be used as an auxiliary immunocytochemistry to identification of cervical adenocarcinoma and endometrial cancer.
【Key words】Carcinoma of cervix uterus Endometvial cancer P16 Protein Distinguishing
前言:子宮癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，由于許多子宮頸腺癌可以表現為宮內膜樣分化，子宮內
膜腺癌也可以呈現漿液性、粘液性、腺鱗癌樣改變，兩者有時在組織形態上具有相似之處，在活檢和診刮標本中來決定子宮腺癌組織來源是比較困難的。尤其腫瘤原發灶在子宮下段和宮頸時，在缺乏明顯的癌前期病變的情況下，即使子宮全切除術后標本，僅靠組織學將二者區別開來是比較困難的。由于兩者臨床手術方式不同，尤其對于需要保留生育功能的早期病例，鑒別診斷尤為重要。早期國內外文獻報道免疫組織化學雌激素受體（ER），孕激素受體（PR）在宮內膜腺癌中表達，而在宮頸內膜腺癌中不表達，可據此來鑒別子宮內膜腺癌和宮頸內膜腺癌。近期研究表明根據表達模式不同，p16可以作為一個輔免疫組織化學標記來鑒別子宮頸腺癌和子宮內膜腺癌。本文通過對40例子宮頸內膜腺癌及73例子宮內膜腺癌中p16、p53、ER、PR表達的檢測，也證實p16是鑒別二者有效的方法。
1.材料和方法
1.1材料：收集2000年1月-2010年1月中南大學湘雅二醫院病理科和張家界市人民醫院病理科已確診子宮頸腺癌40例標本，其中年齡最大者為54歲，最小者為35歲，平均年齡42歲。1例為子宮頸內膜活檢標本，4例為子宮頸LEEP術，3例為錐切標本，其余均為子宮全切標本。并取相同年月子宮內膜腺癌73例，其中年齡最大者為78歲，最小者為43歲，平均年齡55.7歲。8例為宮內膜活檢標本，其余均為子宮廣泛及次廣泛切除標本。
1.2方法：全部標本經10%甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，5um切片，HE染色和免疫組織化學法SP法染色。檢測p16蛋白、p53蛋白、ER、PR的表達。試劑均購自福州邁新生物技術
有限公司。染色步驟參照試劑說明書進行。AEC-H2O2顯色，蘇木精對比染色。
1.3結果判斷標準： p16蛋白陽性定位于胞核或胞質，p53蛋白、ER、PR陽性定位于胞核。陽性著色呈棕紅色顆粒。根據陽性細胞在組織中所占面積分為4個等級：≤5%為（-）、5-10%為弱（+）或可疑（+）、10-30%為陽性，≥30%為強陽性。統計學處理時將陰性組、弱陽性組及可疑陽性組合并為陰性病例組，陽性及強陽性合并為陽性病例組。
1.4統計學處理：采用X2檢驗方法和相關分析，以P
2 結果
2.1免疫組織化學：（1）p16蛋白表達：在40例子宮頸腺癌中37例表達彌漫、中到強度陽性（見圖一），其中微偏性腺癌均表達陰性；73例子宮內膜癌中35例呈陽性，其中28例灶性陽性且總體強度較弱（見圖二），2例弱陽性， 5例可疑陽性。（2）p53蛋白表達：在40例子宮頸腺癌8例陽性。73例子宮內膜腺癌中28例陽性，其中19例灶性呈陽性，3例弱陽性，6例可疑陽性。（3）PR表達：在40例子宮頸腺癌中3例陽性。73例子宮內膜腺癌中52例呈陽性。（4）ER表達：在40例子宮頸腺癌中2例陽性。73例子宮內膜腺癌中57例呈陽性。
表1 p16、p53、ER、PR在宮頸不同類型腺癌中表達：
類別
n p16 n(%)
p53 n(%)
PR n(%) ER n(%)
子宮內膜樣腺癌 6 6（100.0） 0（0.0） 2（33.3） 2(33.3）
腺鱗癌
4 4（100.0） 0（0.0） 0（0.0）
0（0.0）
漿液性腺癌 6 6（100.0） 5（83.3） 0（0.0）
0（0.0）
粘液性腺癌 21 21（100.0） 1（0.0） 0（0.0）
0（0.0）
p53、ER、PR在不同子宮內膜腺癌中表達：
類別
n p16 n（%） p53 n（%） PR n（%） ERn（%）
子宮內膜樣腺癌 47 23（48.9）
15(31.9) 38(80.9) 42(89.4)
腺鱗癌
14
7(50.0)
8(57.1) 10(71.4) 11(78.6)
漿液性腺癌 7
4(57.1)
5(71.4)
2(28.6)
2(28.6)
透明細胞癌 2
0(0.0)
0(0.0)
1(50.0)
0(0.0)
微偏性腺癌 1
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(100.0)
非典型增生癌變 2
1(100.0)
0(0.0) 1(100.0) 1(100.0)
2.2 統計學處理 經統計學分析，p16蛋白在子宮頸腺癌陽性率明顯高于子宮內膜腺癌，差異有極顯著性（X2=30.17，P
2.3 結論 在子宮頸腺癌中p16蛋白呈彌漫性細胞核和細胞質陽性，而組織學形態與其相似的宮內膜腺癌中呈不規則灶性陽性，而且總體強度較弱。根據上述p16蛋白表達結果顯示， p16可用于子宮頸腺癌和子宮內膜腺癌的鑒別診斷。當子宮頸腺癌和內膜的漿液性腺癌均表達p16陽性且激素受體陰性表達，此時漿液性腺癌與子宮頸腺癌鑒別要借助p53的表達。
3 討論
子宮內膜腺癌和宮頸腺癌是婦科最常見的惡性腫瘤，發病率高。近年來，宮頸腺癌有逐漸增加趨勢，且趨于年輕化。原發于子宮頸具有子宮內膜樣分化的腺癌和子宮內膜的子宮內膜樣腺癌，還有子宮頸和子宮內膜的粘液腺癌，在形態上有很大的重疊，然而在臨床病理診斷工作中，我們常常不易區分子宮體下段腺癌和宮頸腺癌，特別是宮頸的子宮內膜樣腺癌，其組織學形態和一般概念上的子宮內膜腺癌相同，尤其在診刮診斷時，雖然內膜樣分化或粘液分化等形態特征可能有所提示，宮頸的腫瘤易于向宮旁及陰道上段浸潤，這種典型的浸潤方式也有利于確認腺癌原發于宮頸，但是如果宮體（特別是子宮下段）和宮頸同時被累及，沒有明顯的癌前病變，子宮腺癌的原發部位就很難確定。宮頸腺癌無明顯的宮頸間質浸潤，卻直接累及子宮內膜，甚至侵入宮體肌層，這種宮頸腺癌的浸潤方式在以前的研究中很少報道過，所以當宮頸的腺癌主要累及內膜和宮體肌層時，常常被認為是原發于內膜的腺癌累及宮頸，尤其當宮頸腺癌累及內膜無法與不典型復雜性增生過長的內膜區分時，這種錯誤更易發生。對于活檢和診刮標本，在手術前確定其原發部位是非常必要的，因二者手術方式不同，尤其對于尚未生育的婦女是否保留子宮，尤為重要。以前實驗證明激素受體ER、PR在大多數宮內膜腺癌中的表達，在大多數宮頸腺癌中為陰性。雖然單獨使用激素受體可以區別一些腺癌，但少數情況下HPV陽性的宮頸腺癌激素受體也陽性（一般ER強于PR），而子宮內膜樣內膜腺癌也可不表達激素受體[1]。在近期較多研究表明[2-4]鑒別二者時，人類狀瘤病毒（HPV）DNA的檢測較ER、PR有更高的敏感性和特異性，因為高危型HPV對宮頸癌的發病起作用，對內膜癌的發病不起作用。由于原位雜交不能在各個病理科實驗室普及，所以需要一個和HPV密切相關的免疫組織化學標記來代替，在一系列的研究中顯示出p16不僅比激素受體的表達更為穩定，而且可以作為檢測高危型HPV相關性腺癌的方法。這是由于基因p16作為一種腫瘤抑制基因，定位于人類染色體9p21[5，6]，p16蛋白是細胞周期調節蛋白之一，其作用是競爭抑制細胞素D1與CDK4結合，并特異性地抑制CDK4的活性，使抑癌基因PRb的蛋白處于非磷酸化的活性狀態，從而阻止細胞由G1期進入S 期，抑制細胞繁殖，而高危型HPV病毒蛋白可與PRb結合并使其失活，導致p16蛋白的過度表達[4，7]。所以當激素受體的表達不典型時（宮頸癌ER PR，內膜癌ER+PR+），組合中加入p16就顯示出重要的意義。p16蛋白在宮頸腺癌中表達的情況各個學者研究結果不盡相同。一些研究表明，在幾乎所有的原位和浸潤性宮頸腺癌中p16蛋白都有彌漫強陽性表達，而其他研究則顯示較低的陽性率[8]。還有學者報道p16蛋白表達于73%~86%的子宮內膜腺癌[9，10]。在本組研究結果中顯示出40例子宮頸腺癌除3例微偏性腺癌外，其余均表達彌漫中度至強度陽性，癌細胞陽性率達90%以上。微偏性腺癌不表達，這可能與其形態學及組織結構酷似正常宮頸內膜腺體有關。據李勝水等[11]用免疫組織化學p16、p53、HPV16/18檢測10例子宮頸微偏性腺癌，證實了p16、HPV16/18均無表達，而P53則有85%表達。本組研究結果同時也顯示了73例子宮內膜腺癌中28例p16呈灶性陽性且陽性程度普遍較弱。
總之，許多研究發現在HPV相關性的宮頸腺癌中，p16顯示彌漫的、中到強度的表達，而組織學形態與其相似的宮內膜腺癌則顯示弱的灶性陽性， p16蛋白表達較原位雜交更敏感快捷，因為所有宮頸腺癌都確切彌漫表達p16，而有些原位雜交卻無法檢測到宮頸腺癌的HPV的DNA，因此p16可以作為一個輔的免疫組織化學標記來鑒別子宮頸腺癌和子宮內膜腺癌。
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