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【關鍵詞】心肌/細胞學Isolation,labellingandautotransplantationofleftauriclemyocytesinadultrabbit【Abstract】AIM:Todevelopareliablemethodforisolationandfluorescentlabelingofadultrabbitleftauriclemyocytesandtoinvestigatethesurvivalofgraftedautologousleftauriclemyocytes.METHODS:TwentyadultNewZealandrabbitswererandomlyassignedtotransplantgroupandcontrolgroup(n=10).TheleftauricleofrabbitwasligatedandharvestedandtheauricularcellswereisolatedandlabeledwithDAPIexvivo.Eitheracellsuspension(transplantgroup)orculturemedium(controlgroup)wasinjectedintothenormalleftventricularanteriorwall.Therabbitsweresacrificedafter4weeksandspecimenswereharvestedandobservedbyhistologicmethods.RESULTS:Mostoftheisolatedcellswereobservedrodshaped.Themorphologicfeatureofthesecellscorrespondedtothatofauriclecardiomyocytesandthecellactivitywasgood.The“cellisland”couldbefoundinmyocardialinfarction(MI)areaoftransplantgroup,andthenucleiwithbluefluorescencecouldbefoundintransplantgroup,butnotincontrolgroup,whichconfirmedthesurvivalofimplantedcellsandthereliabilityofDAPIlabeling.Vasculardensityintransplantgroupwasbetterthanthatincontrolgroup(P=0.02).CONCLUSION:EnzymedigestionandDAPIlabelingarereliablemethodsfortheisolationandlabelingofleftauriclemyocytesinadultrabbits.IsolatedandDAPIlabeledauriclemyocytescansurviveafterautograftedintonormalventricularanteriorwallandmayimproveperipheralvascularproliferation.【Keywords】myocardium/cytology;isolation;label;transplantation,autologous【摘要】目的：建立可靠的成年兔心耳心肌細胞的急性分離和熒光標記的方法，觀察心耳肌細胞移植到自體左室前壁的存活狀況.方法：成年新西蘭白兔20只，隨機分為移植組和對照組（n=10）.結扎并剪取自體左心耳組織，急性消化分離為單細胞，經DAPI標記后分別將細胞懸液和培養基注射到移植組和對照組自體正常左室前壁內.4wk后處死兔子，取移植區組織進行組織學觀察.結果：急性分離的細胞中絕大部分為桿狀，形態結構符合心耳肌細胞的特征，且細胞活性好.移植組梗死區內可以觀察到“細胞島”狀結構，行熒光檢測可見藍色熒光的細胞核，而對照組梗死區內無細胞結構，證明移植的心耳肌細胞在移植區存活以及DAPI標記的可靠性.與對照組相比,移植區血管密度增高（P=0.027）.結論：酶消化法和DAPI熒光標記是一套可靠的心耳肌細胞急性分離和標記方法；急性分離的心耳肌細胞移植到自體左室前壁后可以存活，并能夠促進周圍血管生長.【關鍵詞】心肌/細胞學；分離；標記；移植，自體0引言目前正在研究的心肌細胞移植技術是通過向已梗死的心肌組織內移入新的細胞，以改善心臟功能［1］.本文旨在建立一套可靠的成年兔心耳肌細胞的分離標記方法，并對其移植到自體心肌組織進行研究,為進一步應用心耳肌細胞移植治療缺血性心臟病提供實驗基礎.1材料和方法1.1材料成年健康新西蘭白兔20只,雌雄不限,體質量2.0~2.5kg,購自第四軍醫大學實驗動物中心.將實驗動物隨機分為移植組和對照組（n=10）.小牛血清(Gibco),DMEM高糖培養基(Gibco公司),胰蛋白酶(Gibco公司),膠原酶Ⅱ型（Sigma公司）,4,6二脒基2苯茚二酮(Sigma公司).1.2方法1.2.1自體左心耳心肌組織的取材取成年兔經耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30mg/kg），左側胸骨旁切口，切斷第4肋骨進胸，向上推開胸腺，剪開心包，顯露并牽引左心耳，用4號絲線結扎左心耳基底部后，剪取左心耳并立即置于預冷（4℃）的普通臺式液中.用鹽水紗布覆蓋傷口.1.2.2左心耳心肌細胞的消化分離參照文獻［2］，在無鈣臺式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,MgCl21,酶糖10,HEPES5,pH7.4)中洗去血凝塊，用眼科剪將心耳組織剪碎，移入含有1.25g/L胰酶、0.25g/L膠原酶的無鈣臺式液中，37℃消化10min.輕柔吹打，自然沉淀后棄上清.再加入酶消化10min，輕柔吹打后，吸取上清，移入等體積含100mL/L新生牛血清的DMEM培養液中.重復消化剩余組織2～3次，直至基本不可見有形組織.將收集的細胞懸液1000r/min,離心5min,棄上清，調整細胞密度為2×109/L.1.2.3分離細胞的活性鑒定參考文獻［3］將40g/L的臺盼藍溶液與細胞懸液按照1：9混勻，進行染色,3min后用紅細胞計數板分別計數活細胞和死細胞,計算活細胞率［3］.1.2.4分離細胞的標記參照文獻［4］加入0.2g/L的4,6脒基2茚二酮(DAPI)于孵箱內（37℃）熒光標記細胞2h,使用錫箔包裹.用普通臺式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,CaCl21.8,MgCl21,glucose10,HEPES5,pH7.4)漂洗以去除未結合的DAPI.離心后收集細胞，加入無血清DMEM培養液制成細胞密度為2×109/L的細胞懸液,以備細胞移植.1.2.5分離細胞的觀察心肌細胞移植術前,動態觀察分離的心肌細胞,熒光顯微鏡觀察用DAPI標記好的心肌細胞.1.2.6心肌細胞移植在左室前壁縫50滌綸線以作標記，移植組將心肌細胞懸液經特制的微量注射器注入左室前壁縫線標記上方0.5cm處，對照組以相同量的DMEM培養液注射.逐層關胸,傷口局部應用抗生素,手術中未發生氣胸及惡性心律失常.1.2.7結果觀察4wk后用過量麻醉劑處死動物,取左室前壁縫線標記點上方心肌組織，40g/L甲醛固定48h,行常規HE染色，使用熒光顯微鏡觀察并拍照.觀察移植區內組織結構及血管密度.同時,對移植部位石蠟切片(移植組及對照組動物取樣2個/只,共取樣本40個)，用第Ⅷ因子免疫組織化學染色移植區內血管,光學顯微鏡200倍視野下血管計數,統計移植區血管密度.統計學處理：結果以x±s表示，采用SPSS11.5軟件進行數據處理,組間比較用t檢驗.2結果2.1分離細胞的形態學觀察及細胞活性對用酶消化法分離獲得的成年兔左心耳心肌細胞進行形態學觀察,倒置顯微鏡下可見細胞大部分呈桿狀，邊緣清楚，胞質豐富(Fig1),DAPI標記2h后可見細胞核大,多為單核或多核.經臺盼藍染色,死細胞染成淡藍色,活細胞拒染，計算活細胞率為95%.2.2移植細胞在移植部位的存活情況細胞移植后4wk，對移植部位心肌組織切片進行HE染色后觀察，光鏡下可見移植部位心肌組織內心肌纖維排列整齊，方向基本一致，在移植細胞周圍沒有觀察到淋巴細胞浸潤.在相差熒光顯微鏡下可以觀察到移植組標本中帶有藍色熒光的細胞核，證實移植的心耳肌細胞在移植部位存活.2.3血管增生對移植部位石蠟切片，用第Ⅷ因子行免疫組織化學染色,光學顯微鏡200倍視野下觀察血管計數,移植區血管密度(6.7±2.1)，高于對照組(3.6±1.2,P=0.027)，提示將自體心耳肌細胞移植到左室前壁后可以促進周圍血管增生.3討論本實驗中,我們選用左心耳作為細胞來源，取材簡便，取材后對心功能影響不明顯.考慮到成年心肌細胞不能繼續分裂，故未進行體外培養，而是選擇分離標記后進行細胞移植.在酶消化的過程中，除了按預定的時間進行消化外，還應根[1][2]據肉眼觀察心耳肌組織碎塊的絮狀變化的程度，來決定中止酶消化的時機.無鈣環境和酶消化時間過長將會損害細胞膜，并導致“鈣反常”，使細胞功能受損.我們將分離的兔自體心耳肌細胞移植到正常左室前壁后,4wk后熒光檢測可以發現心肌標本中帶藍色熒光的細胞核,說明移植的心肌細胞在梗死區內存活，同時可以觀察到有血管形成，提示移植的心耳肌細胞可能分泌一些細胞因子如血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)［5,6］等，促進移植區內血管的增生，以適應性加強局部血液供應.我們在移植細胞周圍沒有觀察到大量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，說明自體心肌細胞移植不會產生免疫排斥相關的炎性反應.通過本實驗對自體心肌細胞移植的可行性研究，為下一步研究自體心肌細胞移植到梗死區心肌以治療缺血性心肌病提供了實驗基礎.【參考文獻】［1］LiRK,YauTM,SakaiT,etal.Celltherapytorepairbrokenhearts［J］.CanJCardiol,1998;14:735-744.［2］LiRK,MickleDAG,WeiselRD,etal.Humanpediatricandadultventricularmyocytesinculture:Assessmentofphenotypicchangeswithpassaging［J］.CardiovascRes,1996;32:362-373.［3］司徒鎮強，吳軍正.細胞培養［M］.西安：世界圖書出版公司1996:181.［4］DorfmanJ,DuongM,ZibaitisA,etal.Myocardialtissueengineeringwithautologousmyoblastimplantation［J］.JThoracCardiovascSurg,1998;116:744-751.［5］LiRK,JiaZQ,WeiselRD,etal.Cardiomyocytetransplantationimprovesheartfunction［J］.AnnThoracSurg,1996;62:654-661.［6］RedaelliG,MalhotraA,LiBS,etal.Effectsofconstitutiveoverexpressionofinsulin2likegrowthfactor1onthemechanicalcharacteristicsandmolecularpropertiesofventricularmyocytes［J］.CircRes,1998;82:594-603