導語：NMDA和AMPA型谷氨酸受體亞基在成年大鼠前腦室管膜及室管膜下區的分布一文來源于網友上傳，不代表本站觀點，若需要原創文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關鍵詞】谷氨酸受體；nmda受體；ampa受體；室管膜；免疫組織化學

cnLocalizationofNMDAandAMPAtypeglutamatereceptorsinforebrainventricularmembraneandsubventricularzoneofadultrats

【Abstract】AIM:ToinvestigatethedistributionpatternsofNMDAtypeandAMPAtypeglutamatereceptorsubunitsintheforebrainventricularmembraneandsubventricularzoneofadultrats.METHODS:Immunohistochemicalstainingwasappliedtovisualizethelocalizationof5kindsofNMDAandAMPAreceptorsubunitsintheforebrainsectionsofadultrats.RESULTS:TheimmunoreactivitiesforNMDAR1(NR1),NR2C,AMPAreceptorsubunit1(GluR1),GluR2/3,andGluR4weredetectedintheventricularmembraneandsubventricularzone.TheimmunoreactiveproductsforNMDAorAMPAreceptorsubunitswerehomogeneouslylocalizedinthecytoplasmaandcellmembrane.SemiquantitativeanalysisindicatedthatNR1andGluR4immunoreactivecellsweremoreanddistributedmoredenselythanNR2C,GluR1orGluR2/3immunopositiveonesinventricularmembraneandsubventricularzone.CONCLUSION:ThelocalizationofNMDAandAMPAreceptorsubunitsintheventricularmembraneandsubventricularzonesuggeststhatNMDAandAMPAreceptorsmaybeinvolvedinfunctionalmodulationofneurogenesisinaboveregions.

【Keywords】glutamatereceptors;NMDAreceptor;AMPAreceptor;ventricularmembrane;immunohistochemistry

【摘要】目的：觀察前腦室管膜及室管膜下區N甲基D天門冬氨酸（NMDA）和使君子酸（AMPA）型谷氨酸受體的分布.方法：應用成年SD大鼠前腦切片免疫組織化學方法，顯示NMDA和AMPA受體六種亞基的細胞定位.結果：在室管膜及室管膜下區有NMDA受體亞基NR1，NR2C及AMPA受體亞基GluR1，GluR2/3，GluR4免疫反應陽性產物的分布，免疫陽性產物則均勻地分布在細胞質或細胞膜.半定量分析表明NR1和GluR4陽性細胞的數目和染色密度均高于NR2C，GluR1和GluR2/3陽性細胞.結論：結合以往研究，NMDA和AMPA受體亞基在大鼠前腦室管膜及室管膜下區定位結果提示NMDA和AMPA受體可能參與該區域神經發生等功能活動的調節.

【關鍵詞】谷氨酸受體；NMDA受體；AMPA受體；室管膜；免疫組織化學

0引言

興奮性氨基酸是參與神經元興奮性傳遞、增殖發育、興奮性毒性等活動的重要遞質［1-5］.其興奮性傳遞主要由谷氨酸受體來介導，包括N甲基D天門冬氨酸（NmethylDaspartate，NMDA）、使君子酸（alphaamino3hydroxy5methyl4isoxazolepropionicacid，AMPA）和海人藻酸（kainicacid，KA）受體［1-2］.以往對NMDA和AMPA受體在腦內神經元上分布和功能已有許多報道［6-9］，但缺乏對室管膜及室管膜下區分布和功能的研究.資料表明室管膜及室管膜下區是成年動物神經發生活躍的主要區域之一.為此，我們應用免疫組織化學方法［10］，觀察NMDA和AMPA受體在大鼠室管膜及室管膜下區的分布，旨在探討NMDA或AMPA受體參與該區神經發生等功能活動的意義.

1材料和方法

1．1材料正常成年雄性SD大鼠6只，由第四軍醫大學實驗動物中心提供.第一抗體包括小鼠抗NR1抗體(1∶1000)，兔抗NR2C抗體（1∶1000），兔抗GluR1，GluR2/3，GluR4抗體（1∶300）均為Chemicon公司產品；biotin標記的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG(1∶200)，Vector公司產品；ABC復合物(1∶200),Vector公司產品.

1．2方法

1．2．1動物固定與切片動物在戊巴比妥鈉(40mg/kg，ip)麻醉下，開胸、經左心室至主動脈插管，用生理鹽水約100mL快速沖去血液，隨即灌注含40g/L多聚甲醛0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH7.4)，灌流30min.注畢立即取出大腦,4℃下后固定4h.然后換入300g/L蔗糖溶液內，4℃下過夜.冰凍連續冠狀切片，片厚30μm.切片按順序分為數套，分別作NMDA受體亞基NR1，NR2C，AMPA受體亞基GluR1，GluR2/3和GluR4免疫組織化學染色和對照染色.

1．2．2免疫組織化學染色參照文獻［10］的方法進行，切片于10mmol/LPBS內涮洗,再入含0.3mL/L過氧化氫溶，液內處理30min，用以滅活內源性過氧化物酶.經PBS涮洗后，分別入第一抗體血清（用含2mL/L正常山羊血清和0.1mL/LTritonX100的PBS稀釋）內，4℃下孵育48h.然后入biotin標記的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG(1∶200)溶液，室溫下放置4h、入ABC復合物(1∶200,)溶液，室溫下孵育2h.每次抗體孵育后均用PBS涮洗，3×10min.最后入DAB/H2O2溶液(0.05~0.01g/L)反應10min.用正常血清溶液代替特異性第一抗體孵育切片，作為免疫染色對照.切片裱于載玻片上，晾干、脫水、透明和封片，在BX60顯微鏡下進行觀察、圖像采集和陽性細胞計數分析.

1．2．3半定量數據分析為便于描述前腦室管膜及室管膜下區內NMDA，AMPA受體免疫陽性細胞的數量，將陽性細胞密度分為高（多于10個細胞/高倍視野，表示為）,中（3~10個細胞/高倍視野，表示為）,低（低于3個細胞/高倍視野，表示為+）.

2結果

2．1NMDA和AMPA受體亞基免疫反應產物的定位特征在應用特異性第一抗體孵育的切片上，免疫反應產物呈深棕色，主要定位于細胞胞體及突起上.NMDA受體和AMPA受體亞基NR1，NR2C，GluR1，GluR2/3和GluR4的免疫反應陽性產物呈均勻的棕色分布在細胞質或細胞膜上.在用正常血清取代特異性第一抗體進行孵育的切片上，未發現陽性染色.

2．2NMDA受體亞基在成鼠室管膜及室管膜下區的定位NR1及NR2C陽性產物均勻地分布在細胞質或細胞膜，室管膜及室管膜下區均有免疫陽性細胞存在，NR1的免疫染色強度和陽性細胞的密度均比NR2C大（圖1）.A:NR1;B:NR1;C:NR2C;D:NR2C.

2．3AMPA受體在室管膜及室管膜下區的分布GluR1和GluR2/3的免疫陽性產物主要分布在細胞體及其突起內，陽性細胞密度比較稀疏，GluR2/3的染色強度更淡.GluR4分布在室管膜下區的細胞內，染色強度深，陽性胞體密集分布（圖2）.

2．4NMDA和AMPA受體分布的半定量分析通過對前腦室管膜及室管膜下區內NMDA，AMPA受體免疫陽性細胞的觀察，結果表明免疫陽性細胞密度從高到低依次為：NR1（），GluR4（），GluR2/3（），NR2C（+）和GluR1（+）.

3討論

前腦室管膜下區與海馬齒狀回是成體動物腦內神經發生或活躍的主要增殖區，在腦結構功能可塑性和損傷修復中具有重要意義.結合以往資料［1-5,8-9］，本研究顯示了成年大鼠前腦室管膜及室管膜下區內存在五種NMDA和AMPA受體免疫陽性細胞的分布，結果提示NMDA和AMPA受體所介導谷氨酸信號參與前腦室管膜及室管膜下區細胞的功能活動，可能是該區域內的神經發生活動的重要調節因素之一.

NMDA受體屬于鈣離子通透性離子通道，除介導神經細胞間的興奮性信號傳遞外，還參與神經發育和可塑性活動，在細胞增殖、遷移、損傷與死亡過程中發揮重要作用［1-6,8,11］.應用NMDA受體的拮抗劑CGP43487后2d即見海馬齒狀回內BrdU陽性增殖細胞增多，用后7d仍見大量的增殖細胞，并見早期顆粒神經元、放射狀膠質細胞的增多［4］.腦缺血可以引起海馬CA1區錐狀神經元的死亡，在腦缺血的同時給予NMDA受體拮抗劑MK801則可以阻斷細胞的死亡［5］.AMPA受體依構成亞基的差異，其受體功能特性具有明顯的差別［1,6,12］.GluR1和GluR4為鈣離子通透性AMPA受體，GluR2為鈣離子非通透性受體［1,7,12］.研究表明AMPA受體也參與興奮性毒性和細胞增殖過程［2,5,9,13-14］.在受損傷的細胞中GluR2表達增多，而GluR3，4表達減少［13］.AMPA受體的活化可以抑制小腦內少突膠質前體細胞的分裂與增殖，但不改變星形膠質細胞的數量［14］.

另外，我們還發現NMDA或AMPA受體在室管膜及室管膜下區的細胞上與Nestin共存（待發表資料），輻射損傷引起動物室管膜及室管膜下區內神經前體細胞標記物Nestin表達和細胞增殖標記物Ki67染色細胞增加，提示輻射損傷對該區域神經前體細胞的機能或增殖產生明顯影響［15］.還有研究證明腦組織或腦室內直接給予NMDA或AMPA能夠引起前腦室管膜下區的細胞增殖變化，提示NMDA和AMPA受體可能與該區的神經發生活動有密切關系［8-9］.因此，NMDA和AMPA受體參與成體動物前腦室管膜和室管膜下區的神經發生活動調節、及其在損傷修復中的功能意義，值得進一步研究.

【參考文獻】

［1］OzawaS,KamiyaH,TsuzukiK.Glutamatereceptorsinthemammaliancentralnervoussystem［J］.ProgNeurobiol,1998,54(5):581-618.

［2］TanovicA,AlfaroV.Glutamaterelatedexcitotoxicityneuroprotectionwithmemantine,anuncompetitiveantagonistofNMDAglutamatereceptor,inAlzheimersdiseaseandvasculardementia［J］.RevNeurol,2006,42(10):607-616.

［3］BeharTN,ScottCA,GreeneCL,etal.GlutamateactingatNMDAreceptorsstimulatesembryoniccorticalneuronalmigration［J］.JNeurosci,1999,19(11):4449-4461.

［4］NacherJ,RosellDR,AlonsoLlosaG,etal.NMDAreceptorantagonisttreatmentinducesalonglastingincreaseinthenumberofproliferatingcells,PSANCAMimmunoreactivegranuleneuronsandradialgliaintheadultratdentategyrus［J］.EurJNeurosci,2001,13(3):512-520.

［5］BernabeuR,SharpFR.NMDAandAMPA/kainateglutamatereceptorsmodulatedentateneurogenesisandCA3synapsinIinnormalandischemichippocampus［J］.JCerebBloodFlowMetab,2000,20(12):1669-1680.

［6］PickardL,NoelJ,HenleyJM,etal.DevelopmentalchangesinsynapticAMPAandNMDAreceptordistributionandAMPAreceptorsubunitcompositioninlivinghippocampalneurons［J］.JNeurosci,2000,20(21):7922-7931.

［7］CornilC,FoidartA,MinetA,etal.Immunocytochemicallocalizationofionotropicglutamatereceptorssubunitsintheadultquailforebrain［J］.JCompNeurol,2000,428(4):577-608.

［8］FaizM,AcarinL,CastellanoB,etal.Proliferationdynamicsofgerminativezonecellsintheintactandexcitotoxicallylesionedpostnatalratbrain［J］.BMCNeurosci,2005,6(1):26.

［9］XuG,OngJ,LiuYQ,etal.Subventricularzoneproliferationafteralphaamino3hydroxy5methyl4isoxazolepropionicacidreceptormediatedneonatalbraininjury［J］.DevNeurosci,2005,27(24):228-234.

［10］魏麗春，石梅，馬海昕，等.大鼠脊髓側角內NMDA受體與一氧化氮合酶的免疫細胞化學定位與生后發育［J］.第四軍醫大學學報，2000,21（10）：1178-1181.

［11］SadikotAF,BurhanAM,BlangerM,etal.NMDAreceptorantagonistsinfluenceearlydevelopmentofGABAergicinterneuronsinthemammalianstriatum［J］.BrainResDevBrainRes,1998,105(1):35-42.

［12］SanganahalliBG,JoshiPG,JoshiNB.NMDAandnonNMDAreceptorsstimulationcausesdifferentialoxidativestressinratcorticalslices［J］.NeurochemInt,2006,49(5):475-480.

［13］YamayaY,YoshiokaA,SaikiS,etal.Type2astrocytelikecellsaremoreresistantthanoligodendrocytelikecellsagainstnonNmethylDaspartateglutamatereceptormediatedexcitotoxicity［J］.JNeurosciRes,2002,70(4):588-598.

［14］YuanX,EisenAM,McBainCJ,etal.Aroleforglutamateanditsreceptorsintheregulationofoligodendrocytedevelopmentincerebellartissueslices［J］.Development,1998,125(15):2901-2914.

［15］ShiM,WeiLC,CaoR,etal.Enhancementofnestinproteinimmunoreactivityinducedbyionizingradiationintheforebrainependymalregionsofrats［J］.NeurosciRes,2002,44(4):475-481.