導(dǎo)語：醫(yī)學(xué)生社會(huì)實(shí)踐論文：大腸癌中VHL mRNA，F(xiàn)IH一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤；低氧誘導(dǎo)因子1α；VHL基因；缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子1

EffectofVHLmrnaandfih1mRNAexpressionsincolorectalcarcinomaonHIF1αproteinlevel

【Abstract】AIM:TodetectmRNAexpressionsofVHLandFIH1incolorectalcancer,andexploretheireffectonHIF1αproteinlevel.METHODS:SemiquantitativeRTPCRassaywasusedtodetecttheexpressionsofVHLmRNA,FIH1mRNAin42patientswithcolorectalcancer;ExpressionofHIF1αproteinwasmeasuredbySPimmunohistochemistry;Spearmanrankcorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenthem.RESULTS:mRNAlevelsofVHLandFIH1incolorectalcancerweresignificantlylowerthanthoseinadjacenttissue（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；BothexpressionsdecreasedasDukesstageincreased,andtheexpressionsinDukesA+BstageweresignificantlyhigherthanthoseinDukesC+Dstage（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；Theirexpressionshadnorelationshipwithtumorlocationandgender.In42casesofcolorectalcancer,positiverateofHIF1αproteinwas69.1%(29/42),theexpressioninDukesC+Dstage(80.0%,24/30)wassignificantlyhigherthanthatinDukesA+Bstage(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02);itwasnegativeinadjacenttissue;SpearmanrankcorrelationdisplayedthattheexpressionsofVHLmRNAandFIH1mRNAwerenegativelycorrelatedwiththeHIF1αproteinlevel(rs=-0.97,P=0.01;rs=-0.66,P=0.01).CONCLUSION:TheoverexpressionofHIF1αmayplayanimportantroleinthedevelopmentandmatastasisofcolorectalcancer；ThedecreaseofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsiscloselycorrelatedwiththeincreaseofHIF1αproteinlevelincolorectalcancer.

【Keywords】colorectalneoplasms;HIF1α;VHL;FIH1

【摘要】目的：檢測(cè)大腸癌中VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA以及HIF1α蛋白的表達(dá),探討VHL，F(xiàn)IH1對(duì)HIF1α蛋白水平的影響.方法：采用RTPCR技術(shù)檢測(cè)42例大腸癌組織和相應(yīng)的癌旁正常粘膜組織中VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA的表達(dá)，采用免疫組化SP法檢測(cè)HIF1α蛋白在大腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)，Spearman相關(guān)關(guān)系檢驗(yàn)分析其之間的相關(guān)性.結(jié)果：大腸癌組織VHLmRNA和FIH1mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；二者的表達(dá)水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；它們的表達(dá)水平與與腫瘤部位、性別無關(guān).大腸癌組織HIF1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；DukesC+D期(80.0%,24/30)顯著高于DukesA+B期(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02)；Spearman相關(guān)分析顯示，HIF1α表達(dá)水平與VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.97,P=0.01，rs=-0.66,P=0.01）.結(jié)論：HIF1α的過表達(dá)在大腸癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，大腸癌組織中VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關(guān).

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤；低氧誘導(dǎo)因子1α；VHL基因；缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子1

低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxiainduciblefactor1，HIF1）在低氧狀態(tài)下通過對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)控著血管發(fā)生、紅細(xì)胞生成以及糖酵解等過程［1］.希佩爾林道病(vonHippelLindau,VHL)希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(proteinvonHippelLindau,pVHL)在依賴于氧的條件下作用于HIF1的α亞單位，促使其發(fā)生泛素化和蛋白酶體的降解［2］.低氧誘導(dǎo)因子1抑制因子(factorinhibitingHIF1,FIH1)能結(jié)合HIF1α并抑制其轉(zhuǎn)錄激活功能［3］.我們采用RTPCR法檢測(cè)了大腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中VHLmRNA,FIH1mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)采用免疫組化方法檢測(cè)HIF1α蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步分析探討它們之間的相關(guān)性.

1材料和方法

1．1材料甘肅省人民醫(yī)院肛腸科200410/200504手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的新鮮大腸腺癌標(biāo)本42(男27，女15)例，年齡31～76（中位56)歲.其中結(jié)腸癌7例，直腸癌35例.DukesA期5例，B期7例，C期18例，D期12例(有7例發(fā)生轉(zhuǎn)移),術(shù)前未做化放療.同時(shí)距腫瘤邊緣5～10cm以上切取正常組織作為自身對(duì)照.標(biāo)本離體后5min內(nèi)即投入液氮罐并轉(zhuǎn)至-80℃冰箱凍存.RNA提取試劑,飽和酚,100bpDNAladder購(gòu)自上海生工;逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV(RNaseH)，Taq酶，AgaroseGel，MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)，RNA酶抑制劑，瓊脂糖（Agarose）均購(gòu)自大連寶生物公司;兔抗人HIF1α多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司;生物素鏈霉素抗生物素蛋白檢測(cè)系統(tǒng)(SP)試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司;根據(jù)從NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中所查到VHL和FIH1mRNA序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參對(duì)照選用磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh).引物均由上海生工合成，使用濃度均50μmol/L(表1).

1．2方法

1．2.1VHL及FIH1的RTPCR檢測(cè)從-80℃冰箱中取出凍存的新鮮組織(癌及癌旁正常組織)200mg，采用Trizol法提取組織總RNA，測(cè)定總RNA濃度及純度.使用Takara的MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈，接著合成第2鏈（均照說明書操作）.將所得30μL產(chǎn)物凍存于-20℃以備進(jìn)行PCR.PCR反應(yīng)體系50μL，包括10×Buffer5μL,25mmoldNTPmixture0.5μL,TaqDNA酶1μL，目的引物（VHL或FIH1）上下游各1μL，Gapdh引物上下游各1μL，cDNA模板1μL，無菌水38.5μL.反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,退火30s(退火溫度VHL55℃,FIH158℃)，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min后終止反應(yīng).PCR產(chǎn)物于20g/L的瓊脂糖凝膠做電泳,以無菌水代替cDNA模板的PCR管為陰性對(duì)照，天能凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶拍照并進(jìn)行半定量分析.VHLmRNA,FIHmRNA相對(duì)表達(dá)量以同一反應(yīng)體系中目的產(chǎn)物電泳條帶密度指數(shù)與內(nèi)參對(duì)照Gapdh電泳條帶密度指數(shù)的比值來表示.

1.2.2HIF1α免疫組化染色取出凍存的新鮮標(biāo)本迅速置于40g/L甲醛中固定，制成石蠟塊.先行HE染色確定,取標(biāo)本無出血、壞死區(qū)域,組織厚度5μm連續(xù)切片,HIF1α稀釋度1∶50,SP法染色，用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照.DAB作底物顯色,蘇木素復(fù)染核,梯度酒精脫水,二甲苯透明,樹脂膠封片,顯微鏡下觀察.HIF1α判斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)［4］:陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈棕黃色顆粒著色,陰性(-)為腫瘤組織完全不著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%；陽(yáng)性(+)為腫瘤組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的范圍為5%～25%；陽(yáng)性()為腫瘤組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的范圍為>25%～50%；陽(yáng)性()為腫瘤組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn).計(jì)數(shù)資料兩組率的比較采用四格表的校正卡方檢驗(yàn)，RTPCR結(jié)果和免疫組化結(jié)果的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，按α=0.05的水準(zhǔn)判斷是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2．1RTPCRVHLmRNA在大腸癌組織中的表達(dá)水平為0.51±0.08，癌旁正常組織中的表達(dá)水平為0.63±0.11，配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有顯著性（t=-10.14,P=0.00）；FIH1mRNA在大腸癌組織中的表達(dá)水平為0.52±0.05，癌旁正常組織中的表達(dá)水平為0.60±0.14，配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有顯著性（t=-15.26,P=0.00）.VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA表達(dá)水平與發(fā)病部位，性別，Dukes分期以及有無轉(zhuǎn)移等臨床病理資料之間有關(guān)(圖1,2,表2).表2大腸癌組織VHLmRNA與FIH1mRNA的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

2．2免疫組化染色癌旁正常組織HIF1α免疫組化染色均為陰性（圖3）；癌組織中29例（69.1%）HIF1α陽(yáng)性(圖4)，其中(+)16例，()10例，()3例.HIF1α表達(dá)與Dukes分期明顯相關(guān)，DukesA+B期和DukesC+D期的陽(yáng)性率分別為41.7%(5/12),80.0%(24/30),兩者差異具有顯著性(P<0.05).無轉(zhuǎn)移者HIF1α陽(yáng)性率為65.7%(23/35),有轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率為85.7%(6/7),兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2．3VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA表達(dá)與HIF1α蛋白水平的關(guān)系我們采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Spearman等級(jí)相關(guān)分析，結(jié)果顯示，大腸癌組織中HIF1α表達(dá)水平與VHLmRNA和FIH1mRNA的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.97,P<0.01；rs=-0.66,P<0.01).圖3癌旁正常組織HIF1α的表達(dá)SP×400

3討論

HIF1是一個(gè)異二聚體，由對(duì)氧敏感的α亞單位(HIF1α或HIF2α)和組成性表達(dá)的β亞單位(HIF1β,也稱之為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位分子，ARNT)構(gòu)成［5］.HIF1調(diào)節(jié)通路的失調(diào)對(duì)于癌癥以及缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響作用［6］.VHL基因定位于染色體3p2526區(qū)域,包含3個(gè)外顯子，編碼由284個(gè)氨基酸殘基組成的pVHL［7］.FHI1基因定位于染色體10q24，它在生物工程信息數(shù)據(jù)庫(kù)國(guó)家中心的基因座ID為55662.此基因有8個(gè)外顯子，全長(zhǎng)14kb，可以編碼一種特異性的天冬酰胺羥化酶，屬于2酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族［8］.我們用RTPCR法檢測(cè)了大腸癌和癌旁正常組織中VHLmRNA和FIH1mRNA的水平，同時(shí)用免疫組化法檢測(cè)了HIF1α蛋白在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá).結(jié)果表明，VHLmRNA和FIH1mRNA在癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織；二者的表達(dá)水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期；FIH1mRNA在有轉(zhuǎn)移的病例中顯著低于無轉(zhuǎn)移的病例；它們的表達(dá)水平與與腫瘤部位、性別無關(guān).而HIF1α蛋白表達(dá)在癌組織中總陽(yáng)性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；在DukesC+D期顯著高于DukesA+B期；HIF1α蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)移的病例中高達(dá)85.7%(6/7)，而未轉(zhuǎn)移者為68.6%(23/35)，但卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是樣本量過少的緣故.

Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，HIF1α表達(dá)水平與VHLmRNA，F(xiàn)IH1mRNA的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)，這表明大腸癌組織中抑癌基因VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關(guān).HIF1α的過表達(dá)在大腸癌的發(fā)生發(fā)展，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，HIF1α高表達(dá)的癌組織具有較強(qiáng)的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力.提示HIF1α的表達(dá)可反映結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為，可以作為判斷結(jié)直腸癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有價(jià)值指標(biāo).此外，低氧適應(yīng)性反應(yīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而HIF1α是此過程中的樞紐環(huán)節(jié)，利用反義核酸抑制HIF1α的轉(zhuǎn)錄活性已經(jīng)成為治療腫瘤的一個(gè)重要切入點(diǎn)［9-11］，隨著對(duì)VHL和FIH1作為HIF1α負(fù)性調(diào)節(jié)子功能的逐步闡明［12］，進(jìn)一步探討聯(lián)合應(yīng)用VHL基因治療和FIH1的擬似物，以降低HIF1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，抑制癌細(xì)胞的低氧適應(yīng)反應(yīng)，在防治大腸癌的發(fā)生發(fā)展，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面將會(huì)有更廣闊的前景.

【參考文獻(xiàn)】

［1］BelozeroyVE,VanMeirEG.Hypoxiainduciblefactor1:Anoveltargetforcancertherapy［J］.AnticancerDrugs,2005,16(9):901-909.

［2］KuwaiT,Kitadai,Y,TanakaS,etal.MutationofthevonHippelLindau(VHL)geneinhumancolorectalcarcinoma:Associationwithcytoplasmicaccumulationofhypoxiainduciblefactor(HIF)1α［J］.CancerRes,2004,95(2):145-153.

［3］McneillLA,HewitsonKS,ClaridgeTD,etal.Hypoxiainduciblefactorasparaginylhydroxylase(FIH1)catalyseshydroxylationatthebetacarbonofasparagine803［J］.BiochemJ,2002,367(3):571-575.

［4］果宏峰,龔侃,鄒霜梅,等.腎透明細(xì)胞癌中VHL基因突變與缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)的研究［J］.中華外科雜志,2004,42(4):196-200.

［5］HudsonCC,LiuM,ChoangGG,etal.Regulationofhypoxiainduciblefactor1alphaexpressionandfunctionbythemammaliantargetofrapamycin［J］.MolCellBiol,2002,22(20):7004-7014.

［6］任學(xué)群，孟繼明，傅侃達(dá)，等.缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)及微血管密度與結(jié)直腸癌生物行為的關(guān)系［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004，25（8）:721-724.

［7］RankinEB,HigginsDF,WalisserJA,etal.Inactivationofthearylhydrocarbonreceptornucleartranslocator(Arnt)suppressesvonHippelLindaudiseaseassociatedvasculartumorsinmice［J］.MolCellBiol,2005,25(8):3163-3172.

［8］CheoljuL,SeungJK,DaeGJ,etal.StructureofhumanFIH1revealsauniqueactivesitepocketandinteractionsitesforHIF1andvonHippelLindau［J］.JBiolChem,2003,278(9):7558-7563.

［9］李先茂,曾位森,張亞歷,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合肽介導(dǎo)顆粒酶B靶向性抗腫瘤血管生成［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(21):1929-1932.

［10］CharlesED,RichardKB,JohannD.Structureoffactorinhibitinghypoxiainduciblefactor1:Anasparaginylhydroxylaseinvolvedinthehypoxicresponsepathway［J］.PNAS,2002,99(24):15351-15356.

［11］LandoD,PeetDJ,WhelanDA,etal.AsparaginehydroxylationoftheHIFtransactivationdomainahypoxicswitch［J］.Science,2002,295(5556):858-861.

［12］MorrisMR,MainaE,MorganNV,etal.MoleculargeneticanalysisofFIH1,FH,andSDHBcandidatetumoursuppressorgenesinrenalcellcarcinoma［J］.JClinPathol,2004,57(7):706-711.