導(dǎo)語：小鼠前向運(yùn)動(dòng)精子分離采集思考一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的提高從小鼠附睪采集的精子中前向運(yùn)動(dòng)精子的比例。方法設(shè)計(jì)“雙艙培養(yǎng)皿”和“雙艙浮游法（B法）”采集小鼠精子,并與當(dāng)前普遍采用的“常規(guī)浮游法（A法）”進(jìn)行配對(duì)比較實(shí)驗(yàn)。采用A,B法分別采集同一只小鼠的雙側(cè)附睪精子。結(jié)果前向運(yùn)動(dòng)精子活躍地從“雙艙培養(yǎng)皿”的內(nèi)艙游出至外艙。A、B兩法分離得到的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率分別為(56.83±7.23)％和(77.33±5.69)％,變異系數(shù)分別為12.72％和7.36％,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論“B法”能穩(wěn)定顯著地提高前向運(yùn)動(dòng)精子的百分率,優(yōu)于“A法”。

【關(guān)鍵詞】附睪精子精子能動(dòng)性疾病模型動(dòng)物

ABSTRACT:ObjectiveThetechniqueofmousespermcollectioniscommonusedinmanyfieldsoflifesciencecurrently.Theaimofthisresearchisinordertoimprovetheratioofforwardmotilespermcollectingfrommouseepididymides.MethodAnovel"doublechambersdish"andconvenient"doublechambersswim"methodweredesignedandcomparedwith"conventionalswimup"methodwhichisincommonusednowadays.Experimentsshowedthattheforwardmotilespermswimoutactivelyfromtheinnerchamberandtherateofforwardmotilespermincreased.Spermwascollectedfromdifferentsideofthesamemousebyusing"conventionalswimup"or"doublechambersswim"method,respectively.ResultThemeansoftherateofforwardmotilespermcollectedwere56.83％±7.23％withCV12.72％in“conventionalswimup”groupand77.33％±5.69％withCV7.36％in“doublechambersswim”group,respectively.Statisticalanalysisshowedtherearesignificantdifferencesbetweentwodatasaccordingtothepairedttest.ConclusionThe“doublechambersswim”methodcanimprovetheratiooftheforwardmotilespermstablyandobservablyandwouldbeabettermethodinmousespermcollection.

KEYWORDS:epididymis；sperm；permmotility；diseasemodels,animal

福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2008年7月第42卷第4期江帆等：小鼠前向運(yùn)動(dòng)精子分離采集技術(shù)改良小鼠精子采集技術(shù)是受精機(jī)制研究和生殖工程中常用的實(shí)驗(yàn)方法[1]。自然小鼠精液中含有結(jié)構(gòu)、功能并不一致的多種精子和少量生殖道脫落細(xì)胞,只有活躍向前運(yùn)動(dòng)的精子（前向運(yùn)動(dòng)精子）具有正常生理功能,才能游到受精地點(diǎn)與卵細(xì)胞發(fā)生受精。因此,快速簡(jiǎn)便地獲得高百分率的前向運(yùn)動(dòng)精子,是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的重要前提。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的“常規(guī)浮游法（A法）”是將含有成熟精子的小鼠附睪尾或輸精管放在培養(yǎng)液里剪開,讓其中的前向運(yùn)動(dòng)精子浮游到培養(yǎng)液中[2],其收獲的前向運(yùn)動(dòng)精子的百分率不高且不穩(wěn)定。筆者改良設(shè)計(jì)一種新型簡(jiǎn)便的“雙艙浮游法（B法）”,并與A法進(jìn)行比較。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器

35mm塑料培養(yǎng)皿（江蘇海門聯(lián)合塑料制品公司）,0.5mL微型塑料離心管（EP管,江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）,20mL一次性無菌注射器（福建莆田仁德醫(yī)療器械有限公司）,血球分類計(jì)數(shù)器（福建羅源醫(yī)療器械二廠）,超凈工作臺(tái)（HFsafe1200,上海力申科學(xué)儀器有限公司）,CO2培養(yǎng)箱（BB16HF,上海力申科學(xué)儀器有限公司）,光學(xué)顯微鏡（BHT112,日本Olympus公司）。

1.1.2動(dòng)物

8～12周齡的普通級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～25g（福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.1.3試劑

小鼠精子培養(yǎng)液M16按文獻(xiàn)[3]配制,配方主要成分為：NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4·7H2O，乳酸鈉,葡萄糖,青霉素,鏈霉素,碳酸氫鈉,丙酮酸鈉,氯化鈣（均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?BSA（FractionⅤ,美國(guó)SigmaA3311）；胚胎培養(yǎng)級(jí)輕質(zhì)礦物油（Sigma，M8410）,氯仿（廣東汕頭西隴化工廠）,生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司）。

1.2方法

1.2.1“B法”精子采集方案設(shè)計(jì)

“A法”是在直徑35mm的培養(yǎng)皿中央加入約1.0mL培養(yǎng)液形成一個(gè)液滴,液滴四周及其表面覆蓋礦物油；小鼠附睪尾放在液滴中央剪開,使精液從組織中擴(kuò)散到培養(yǎng)液里；培養(yǎng)一段時(shí)間后從液滴的上層吸取懸液以收獲游出的精子（圖1A）。

本研究設(shè)計(jì)的“B法”在上述培養(yǎng)皿中央增加2個(gè)直徑不同的同心圓環(huán),制成“雙艙培養(yǎng)皿”。內(nèi)環(huán)加入培養(yǎng)液并使其溢出至外環(huán)形成一個(gè)大液滴,液滴覆蓋的區(qū)域構(gòu)成內(nèi)、外半隔斷的2個(gè)“艙”；小鼠附睪尾放在內(nèi)艙中剪開,精液只在內(nèi)艙中擴(kuò)散,而前向運(yùn)動(dòng)精子則可以跨越內(nèi)環(huán)而游到外艙；培養(yǎng)一段時(shí)間后從外艙底部吸取懸液以收獲游出的精子,大部分運(yùn)動(dòng)功能差及或死亡的精子將被擋在內(nèi)艙而被排除（圖1B）,從而分離出前向運(yùn)動(dòng)精子。

1.2.2雙艙培養(yǎng)皿制作

用手術(shù)刀平整切下0.5mLEP管內(nèi)蓋上凸出的圓環(huán)（直徑約8mm,高約3mm）,于氯仿中浸泡下緣3min左右,鑷子夾起圓環(huán)立即貼于35mm塑料培養(yǎng)皿中央作為內(nèi)環(huán)；再?gòu)?0mL塑料注射器上剪下一圈圓環(huán)(直徑約22mm,高約2mm)同法浸泡后套在內(nèi)環(huán)之外作為外環(huán),高度略矮于內(nèi)環(huán)。內(nèi)外2圓環(huán)組成同心圓,確認(rèn)內(nèi)外環(huán)都貼緊培養(yǎng)皿而無縫隙,即制成雙艙培養(yǎng)皿（圖2）,內(nèi)環(huán)之內(nèi)的區(qū)域稱為內(nèi)艙,內(nèi)、外環(huán)之間的區(qū)域稱為外艙。

1.2.3附睪尾取材

在超凈工作臺(tái)無菌條件下操作。“脊椎錯(cuò)位法”處死小鼠,仰臥,酒精噴灑體表消毒,在其下腹部橫向剪開一道小口,縱向撕開,暴露腹壁肌肉,組織鑷捏起膀胱投影區(qū)上方腹壁肌肉,輕微抖動(dòng)避免內(nèi)臟粘連,提起后橫向剪開至腹壁兩側(cè),充分暴露其下脂肪囊；拉出脂肪囊,暴露睪丸和附睪,鑷子夾住附睪體的尾部末端,剝離附睪尾周圍的脂肪和血管,沿鑷子夾取部位剪下雙側(cè)附睪尾,放入生理鹽水中清洗表面殘留脂肪及血污。

1.2.4精子采集

每次實(shí)驗(yàn)對(duì)同一只小鼠左右兩側(cè)附睪尾分別隨機(jī)編為A、B組：A組將附睪尾置于培養(yǎng)皿液滴中央,采用“A法”采集精子；B組將附睪尾置于培養(yǎng)皿內(nèi)環(huán)中,采用“B法”采集。切碎附睪尾時(shí)注意動(dòng)作盡量輕巧,避免過分振動(dòng)。將培養(yǎng)皿移入培養(yǎng)箱中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05％的CO2培養(yǎng)15min后移出至超凈臺(tái)上,用1000μL可調(diào)微量移液器分別從2組吸取500μL精子懸液并裝入2個(gè)1.5mLEP管中。A組從液滴的上層吸取懸液,B組則從外艙的底部貼近內(nèi)環(huán)處吸取懸液（圖1）。將EP管中的1只移回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)等待檢查,另1只EP管的精子懸液立即進(jìn)行顯微觀察與計(jì)數(shù)。

1.2.5顯微觀察與計(jì)數(shù)

用200μL可調(diào)微量移液器對(duì)EP管中的精子懸液反復(fù)吹吸數(shù)次使精子混勻,吸取40μL精子懸液滴加在載玻片上,覆蓋蓋玻片后觀察。對(duì)蓋玻片中央和四角（避免蓋玻片邊沿）的5個(gè)區(qū)域內(nèi)精子進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。利用血球分類計(jì)數(shù)器對(duì)“前向運(yùn)動(dòng)精子”和“非前向運(yùn)動(dòng)精子”的數(shù)目進(jìn)行分別計(jì)數(shù),每片樣本計(jì)數(shù)精子總數(shù)（前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)＋非前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)）200個(gè)。

1.2.6前向運(yùn)動(dòng)精子百分率計(jì)算

分別計(jì)算A、B樣品的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率,計(jì)算方法為：前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)（forwardmovementspermnumber,FMSN）除以精子總數(shù)（totalspermnumber,TSN）再乘以100%,即等于前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（forwardmovementspermrate,FMSR）。

FMSR=FMSN/TSN×100%

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用MicroCalOringin3.0（MicroCalSoftwareInc.）分別統(tǒng)計(jì)出2組前向運(yùn)動(dòng)精子百分率的x±s,計(jì)算變異系數(shù)（CV=Mean/SD）并繪制成柱形圖。采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)對(duì)均數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

共進(jìn)行12例配對(duì)實(shí)驗(yàn)。A,B組的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均值分別(56.83±7.23)％和(77.33±5.69)％,CV分別為12.72％和7.36％。配對(duì)資料t檢驗(yàn)顯示差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,B組顯著高于A組（圖3）。

3討論

3.12種精子采集技術(shù)的比較

小鼠精子采集技術(shù)不僅應(yīng)用于直接與生殖相關(guān)的研究課題,如受精機(jī)制研究、輔助生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)研發(fā)和生殖毒理學(xué)研究等,也是當(dāng)前功能基因組學(xué)時(shí)代轉(zhuǎn)基因小鼠制備中不可或缺的實(shí)驗(yàn)步驟[46]。在常用的多種活細(xì)胞分離技術(shù)中,密度梯度離心和流式細(xì)胞儀的分離純度高,但要求樣本量較大,且耗時(shí)較長(zhǎng),所需材料和設(shè)備昂貴。由于小鼠的原始精液量少、精子獲能時(shí)程短（60～120min）,精子離開附睪尾后將較快發(fā)生生理生化的改變。因此,與其它體細(xì)胞或大型動(dòng)物的精子不同,小鼠精子的分離采集不宜采用密度梯度離心和流式細(xì)胞儀這類高技術(shù),而是利用精子的前向運(yùn)動(dòng)特性,采用“浮游”法分離。但此法要求較高的操作技巧,且方法不穩(wěn)定,難于獲得滿意的百分率,失敗率較高[2]。“A法”中不同狀態(tài)的多種細(xì)胞混雜在同一個(gè)“艙”里,收獲精子懸液時(shí),一些運(yùn)動(dòng)功能差及或死亡精子也隨液流被吸出。基于此現(xiàn)狀,本研究設(shè)計(jì)“B法”以改良小鼠前向運(yùn)動(dòng)精子的分離采集技術(shù)。此法除了采用的培養(yǎng)皿與常規(guī)法有別外,整體實(shí)驗(yàn)程序與常規(guī)方法一樣簡(jiǎn)便、快速,在操作手法上甚至比常規(guī)方法更易于把握。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,“B法”采集到的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率高于“A法”,CV明顯低于“A法”,說明“B法”得到的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性較高,且可以極顯著地提高前向運(yùn)動(dòng)精子的百分率。

3.2“B法”技術(shù)優(yōu)勢(shì)分析

“B法”顯著提高前向運(yùn)動(dòng)精子比例的原因：（1）附睪尾放在內(nèi)艙中,在剪碎組織和隨后將培養(yǎng)皿移入或移出培養(yǎng)箱等操作中,附睪尾被局限于相對(duì)狹小的內(nèi)艙不易移動(dòng),避免造成較大的液體波動(dòng)而減少非前向運(yùn)動(dòng)精子及其它組織碎片在培養(yǎng)液中隨機(jī)擴(kuò)散；（2）附睪尾切開,精液流出組織后將主要在內(nèi)艙中擴(kuò)散。內(nèi)環(huán)具有一定高度,只有前向運(yùn)動(dòng)精子能夠游到其頂端并跨越到外艙,而非前向運(yùn)動(dòng)精子絕大部分將被內(nèi)環(huán)阻擋在內(nèi)艙區(qū)域并逐漸沉降于內(nèi)艙底部,從而實(shí)現(xiàn)了前向運(yùn)動(dòng)精子與非前向運(yùn)動(dòng)精子在一定程度上的區(qū)域分離。因重力的關(guān)系,游出到外艙的精子可能逐漸沉降到艙底而比較難于游回到內(nèi)艙。故隨時(shí)間推移,外艙中的前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)量將有富集的趨勢(shì)；（3）在吸取精子懸液時(shí),“B法”要求從外艙的底部貼近內(nèi)環(huán)處吸取懸液,可最大限度減少內(nèi)艙中產(chǎn)生液流,避免內(nèi)艙區(qū)域中高比例的非前向運(yùn)動(dòng)精子被吸出。

在實(shí)際操作過程中,培養(yǎng)皿及其液滴難免受到一些振動(dòng),大量前向運(yùn)動(dòng)精子從內(nèi)艙游出時(shí)也會(huì)形成微小的液體潛流,這些因素都可造成一些非前向運(yùn)動(dòng)精子漂浮于液滴中,在吸取懸液時(shí)被采集。因此,“B法”采集到的精子中,仍將有一部分非前向運(yùn)動(dòng)精子。另外,本研究為了適應(yīng)多種實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰?采用了較短的分離采集時(shí)間（15min）,內(nèi)艙區(qū)域中漂浮的“非前向運(yùn)動(dòng)精子”可能還未充分沉降,以致其中的一部分隨吸取懸液時(shí)產(chǎn)生的液流被吸出,從而降低了前向運(yùn)動(dòng)精子的百分率。這可能是本研究中平均前向運(yùn)動(dòng)精子百分率尚不是很高的原因。對(duì)于單純?yōu)榱双@取前向運(yùn)動(dòng)精子進(jìn)行體外受精的研究而言,可以將精子采集步驟與隨后的精子獲能步驟合二而一,故允許培養(yǎng)皿在CO2培養(yǎng)箱里停留更長(zhǎng)時(shí)間,則將有更多的非前向運(yùn)動(dòng)精子充分沉降于內(nèi)艙,有望進(jìn)一步提高前向運(yùn)動(dòng)精子百分率。

3.3“B法”的推廣價(jià)值

“B法”的基本原理是促使前向運(yùn)動(dòng)精子與非前向運(yùn)動(dòng)精子的區(qū)域分離,所有哺乳動(dòng)物的正常精子皆有前向運(yùn)動(dòng)特性,故此法不僅可應(yīng)用于大鼠、金黃地鼠及其它在體積、附睪結(jié)構(gòu)和精子結(jié)構(gòu)及功能特性上與小鼠相類似小動(dòng)物的前向運(yùn)動(dòng)精子分離采集,也可以推廣設(shè)計(jì)出適應(yīng)于各種哺乳動(dòng)物精子的分離采集技術(shù)。

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