導(dǎo)語(yǔ)：短肽模擬脂多糖研究論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：得到擬類脂A的六肽。方法：用抗類脂A的單克隆抗體篩選噬菌體隨機(jī)六肽庫(kù)，經(jīng)四輪篩選后進(jìn)行ELISA檢測(cè),用得到的15個(gè)陽(yáng)性克隆分別免疫小鼠，并將使小鼠產(chǎn)生抗LPS抗體的10個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，將保守序列進(jìn)行肽合成。結(jié)果：得到保守序列為L(zhǎng)ys-Phe-Ser-Ser-Arg,即KFSSRX。固相合成此小肽可與其1B6抗體結(jié)合，且此結(jié)合可被LPS抑制。結(jié)論：此六肽可模擬脂多糖或類脂A表位。

關(guān)鍵詞脂多糖模擬短肽噬菌體肽庫(kù)

PreparationofpeptidesmimicringlipidAepitopeusingphagedisplaypeptidelibrary

BAOYong-Li,FUNing①,YANGGui-Zhenetal.

DepartmentofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021.①DepartmentofImmunology,FirstMilitaryMedicalUniversity，Guangzhou510515

AbstractObjective:FindingmimicLipidA6-merpeptides.Methods:Usedanti-LipidAMcAbtofishoutphagedisplay6-merpeptiderandomlibrary.After4roundsselection,15positiveclonesweredetectedbyELISAandusedtoimmunizemice.TenofthemcouldgetantibodyforLPS.ToanalyzetheDNAsequencesandtosynthesizethepeptidefromconservativesequences.Results:TheconservativeaminoacidsequenceisLys-Phe-Ser-Ser-ArgorKFSSRX.Thesolidphasesynthesispeptidecanbindto1B6antibodyandthisbindingcanbeinhibitedbyLPS.Conclusion:Theseresultssuggestthat6-merpeptidecanmimicrytheepitopeofLPSorLipidA.

KeywordsLPSMimicpeptidePhagedisplaypeptidelibrary

已知細(xì)菌脂多糖為非胸腺依賴抗原，難以誘導(dǎo)有效的免疫回憶反應(yīng)，90年代初曾有人用抗獨(dú)特型抗體成功地模擬了脂多糖表位，提示了用蛋白或多肽模擬脂多糖的可能性。從噬菌體肽庫(kù)中篩選目的短肽是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，是研究蛋白質(zhì)分子之間相互作用的一個(gè)有效工具。本研究用具有交叉反應(yīng)性的抗鼠傷寒桿菌脂多糖類脂A單克隆抗體篩選噬菌體隨機(jī)六肽庫(kù)，旨在得到可模擬脂多糖類脂A表位的短肽，為研制具有胸腺依賴性抗原性質(zhì)的LPS疫苗及內(nèi)毒素拮抗劑奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料噬菌體隨機(jī)六肽庫(kù)及大腸桿菌K91Kan均為美國(guó)密蘇里大學(xué)Smith博士惠贈(zèng)；T7DNA聚合酶測(cè)序試劑盒購(gòu)自Promega公司；32P-dATP購(gòu)自北京亞輝公司；抗類脂A單抗1B6為IgG1亞類系本室自制，方法見(jiàn)文獻(xiàn)［1］；豚鼠抗野生型M13噬菌體抗體為本室制備。

1.2噬菌體六肽庫(kù)的篩選親合素包被全塑培養(yǎng)皿，4℃過(guò)夜，1%BSA封閉，4℃1h，加入生物素化單克隆抗體1B6室溫2h，加肽庫(kù)，4℃作用1h洗去未結(jié)合的噬菌體，用洗脫液解離已結(jié)合的噬菌體，侵染K91Kan，擴(kuò)增并提取噬菌體，用于下一輪篩選。共進(jìn)行4輪篩選，每一輪都不斷減少生物素化單抗的用量及單抗與肽庫(kù)作用時(shí)間旨在得到高親和力，特異性強(qiáng)的克隆。四輪篩選后挑選單斑擴(kuò)增，PEG沉淀回收噬菌體，并測(cè)其滴度，詳見(jiàn)文獻(xiàn)［2］。

1.3夾心ELISA法篩選陽(yáng)性噬菌體克隆用1B6包被酶標(biāo)板，1％BSA封閉后加篩選出的噬菌體克隆，同時(shí)以野生型噬菌體Fuse1為對(duì)照，43℃30min后加豚鼠抗M13血清，43℃30min后加HRP-SPA，最后加OPD顯色，酶標(biāo)儀測(cè)OD490值。

1.4陽(yáng)性噬菌體克隆免疫原性的測(cè)定用篩選出的15個(gè)陽(yáng)性克隆及野生型噬菌體分別免疫Swiss小鼠，每次1012個(gè)顆粒，第1次加弗氏佐劑免疫，14d后用噬菌體顆粒直接腹腔注射，2次免疫后5d取血清，間接ELISA方法測(cè)LPS抗體。用LPS包被，加入待測(cè)血清，然后加入兔抗鼠丙種球蛋白，再加入HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG，最后加OPD顯色，測(cè)OD490值。

1.5陽(yáng)性噬菌體克隆DNA序列分析用Sanger雙脫氧末端終止法對(duì)可刺激小鼠產(chǎn)生抗LPS抗體的噬菌體克隆進(jìn)行序列分析，測(cè)引物序列為5′HO-TGAATTTTCTGTATGAGG-OH3′，測(cè)序方法參照Promega公司T7DNA聚合酶測(cè)序試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6模擬短肽的固相合成根據(jù)陽(yáng)性克隆的保守序列在TentaGelS樹(shù)脂珠上合成固相短肽。方法為固相Fmoc化學(xué)合成法，如下：合成反應(yīng)在8.0×1.6cm的Polypropylene柱中進(jìn)行，將3倍克分子濃度的L型Fmoc氨基酸及交聯(lián)劑BObT及DIC加入溶漲的TentaGelS樹(shù)脂珠，交聯(lián)時(shí)間為1h，反應(yīng)過(guò)程均用Ninhydrintest檢查其完全程度。Fmoc氨基酸脫保護(hù)劑為20％Piperidine/DMF。全部交聯(lián)完成后用三氟乙酸(TFA)/Phenol/Ethaneditiol/Anisole(94:2:2:2V/W/V/V)去側(cè)鏈保護(hù)基，用DMF，甲醇，雙蒸水及PBS洗滌并保存于含0.02％NaN3的PBS備用。

1.7合成短肽的抗原性鑒定以0.2μg/ml生物素標(biāo)記1B6抗體與短肽交聯(lián)樹(shù)脂珠混合，室溫振搖2h，洗滌后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，室溫1h，洗滌后加入底物BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phophate)溶液，立即倒入3.5cm平皿，呈色反應(yīng)完全后以1mol/LHCl終止反應(yīng)。陽(yáng)性樹(shù)脂珠于普通光學(xué)顯微鏡下呈綠色。抗原競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)即于加抗體同時(shí)加入150μg/ml的LPS，余同上。

2結(jié)果

2.1陽(yáng)性克隆的篩選及免疫原性的測(cè)定從第4輪篩選洗脫物中任選22個(gè)克隆以雙抗體夾心ELISA測(cè)定其抗原性，用PBS調(diào)零點(diǎn)，F(xiàn)use1為對(duì)照。結(jié)果如表1所示。

經(jīng)ELISA法篩選后得到15個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆，將其分別免疫Swiss小鼠，結(jié)果2次免疫后有10個(gè)克隆產(chǎn)生抗LPS抗體，其中有2個(gè)克隆效價(jià)較高，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1用夾心ELISA法檢測(cè)噬菌體克隆抗原性

Tab.1AntigenicitydetectionofphageclonesbysandwichELISA

No.ofphagecloneOD490nmNo.ofphagecloneOD490nm

10.53120.92

20.37130.62

30.23140.83

40.43150.67

50.45160.21

61.07170.37

70.36180.85

81.05190.94

91.02200.80

100.52211.01

110.84220.70

Control（Fuse1）0.20

圖1陽(yáng)性克隆免疫小鼠血清LPS抗體效價(jià)的測(cè)定

Fig.1Titerofmurineanti-LPSantiserumimmunizedwithpositivephageclone

表2擬類脂A合成肽的抗原性

Tab.2TheantigenicityofsynthesismimiclipidApeptides

No.andsequencesofpeptidesBiotin-1B6Biotin-1B6mixedwithLPS

1.KFSSRF+++++

2.Ac-KFSSRF++++

3.AFSSRA++++

4.Ac-AFSSRA－N

5.KCSSRK+N

6.Ac-KCSSRK－N

7.YGGFL－N

8.Ac-KPfQwFwLQ－N

9.rPKPwQwFwLL－N

Note：SmalllettershowDtypeaminoacid；N:Notdone

2.2擬類脂A六肽編碼DNA序列分析將10個(gè)可使小鼠產(chǎn)生抗LPS抗體的噬菌體克隆通過(guò)Sanger末端終止法進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果其序列為5′-AAGTTTAGTTCTCGTTTC（部分為T(mén)TG)-3′進(jìn)而推斷其氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Phe-Ser-Ser-Arg-Phe（或Leu)即KFSSRX。其N末端5個(gè)氨基酸序列呈高度保守。

2.3合成短肽的抗原性鑒定根據(jù)上述保守序列合成的六肽交聯(lián)樹(shù)脂珠可與生物素標(biāo)記1B6單抗反應(yīng)，且可被LPS特異性抑制，見(jiàn)表2中的短肽1～3。這一結(jié)果說(shuō)明KFSSRF可模擬特異性LPS類脂A表位，N末端乙酰化對(duì)其與抗體的結(jié)合有輕度影響；用甘氨酸置換兩端的短肽3仍具有較好的抗原性，但乙酰化的短肽則不能與抗體結(jié)合。對(duì)照短肽5.6為用無(wú)關(guān)抗體篩出的與短肽1～4有共同序列SSR的短肽，其不能被1B6抗體結(jié)合說(shuō)明FSSR為該目的短肽所必需的核心序列；對(duì)照短肽7、8、9分別為內(nèi)啡肽及P物質(zhì)（SubstanceP)表位合成模擬短肽［3，4］。

3討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，大量的蛋白質(zhì)分子得以被克隆、重組、改造，表達(dá)并付諸應(yīng)用，存在于許多細(xì)菌，病毒，真菌及腫瘤細(xì)胞表面多糖抗原表位的重要性也日漸被重視。曾認(rèn)為分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)無(wú)法直接用于研究多糖，而噬菌體肽庫(kù)與合成肽庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)為研究并以短肽模擬多糖表位提供了有效的工具。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)用抗多糖抗體或酶的底物從肽庫(kù)中篩出的短肽不但具有多糖表位的抗原性，而且可模擬多糖的功能。如Kooyman等從噬菌體肽庫(kù)中篩出并合成的六肽分子可模擬大量存在于豬紅細(xì)胞表面的Galα1.3(galactosyl)，并抑制熱滅活的人血清對(duì)豬紅細(xì)胞的凝集作用［5］，這正是異種移植中亟待解決的難題之一。Taki等嘗試從噬菌體肽庫(kù)中篩選出(神經(jīng))糖鞘脂的模擬肽，根據(jù)其編碼核苷酸合成的九肽不但模擬了糖脂的抗原性，而且引人注目的是可調(diào)節(jié)糖苷酶的活性［6］。對(duì)病原微生物多糖的模擬短肽研究目前主要限于新型隱球菌多糖,鏈球菌莢膜多糖及HIV多糖［7-9］。有關(guān)革蘭氏陰性菌脂多糖內(nèi)毒素方面僅Phalipon等進(jìn)行了LPS的O抗原的模擬肽研究［10］，尚未見(jiàn)到有模擬LPS類脂A表位的報(bào)道。

脂多糖內(nèi)毒素(LPS)是革蘭氏陰性菌的共同致病成分，目前雖可應(yīng)用大量的抗生素治療該類細(xì)菌的感染，但菌體死亡后釋放的脂多糖（LPS）仍可造成機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p傷。類脂A為L(zhǎng)PS毒力中心，且在各種革蘭氏陰性菌中高度保守，LPS對(duì)機(jī)體的損傷主要是通過(guò)此部位與血漿中的LPS結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合，再與巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞上的CD14分子結(jié)合，從而使巨噬細(xì)胞等釋放一系列的細(xì)胞因子IL-1，TNF等造成機(jī)體的損傷［11］。目前有人采用針對(duì)LPS，IL-1及TNF的抗體治療革蘭氏陰性菌敗血癥，但效果均不顯著，且有不同程度的副作用［12］，亦有人嘗試用類脂A的結(jié)構(gòu)類似物作為拮抗劑［13］。由于LPS及類脂A均為胸腺非依賴性抗原不能誘導(dǎo)有效的再次應(yīng)答，也難以成為有效的疫苗用于預(yù)防。本研究用具有交叉反應(yīng)性的抗鼠傷寒桿菌類脂A保護(hù)性單抗篩選噬菌體隨機(jī)六肽庫(kù)，所得的陽(yáng)性克隆其編碼序列呈高度保守，為KFSSR。據(jù)此序列合成的短肽在體外反應(yīng)顯示了較好的抗原特異性。因條件所限暫未進(jìn)行各位置上的氨基酸置換，但以FSSR為核心將兩端換為甘氨酸仍具有良好的抗原性及對(duì)照短肽5僅具有微弱抗原性可提示FSSR為該表位的核心序列。N末端乙酰化的目的是延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示乙酰化對(duì)抗原性有不同程度的影響，這是在設(shè)計(jì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)予以考慮的。在進(jìn)行免疫原性測(cè)定時(shí)，各個(gè)克隆刺激小鼠產(chǎn)生的抗體效價(jià)高低不一，但測(cè)序結(jié)果顯示為同一序列，其原因可能是普通小鼠個(gè)體差異較大所致，其次與免疫次數(shù)較少亦有關(guān)。

本研究證實(shí)了表達(dá)于噬菌體表面的短肽可模擬脂多糖類脂A表位，且據(jù)此合成的六肽即可具有較好的抗原性。此結(jié)果將為進(jìn)一步研制擬LPS表位的多肽疫苗及內(nèi)毒素的新型拮抗劑奠定基礎(chǔ)。

致謝：本研究的肽合成部分工作是在美國(guó)ArizonaCancerCenter的LamKS的指導(dǎo)下完成的,在此表示感謝。

噬菌體表達(dá)短肽模擬脂多糖類脂A表位的研究本項(xiàng)目受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No.39470658)

富寧現(xiàn)在第一軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，廣州510515

作者簡(jiǎn)介：鮑永利，女，30歲，講師，從事免疫生物工程方面的研究；

富寧，女，45歲，教授，主要從事抗感染免疫及細(xì)胞因子受體的研究

作者單位：（白求恩醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)教研室，長(zhǎng)春130021)

4參考文獻(xiàn)

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