導(dǎo)語：電鏡技術(shù)研究油菜油體形態(tài)大小論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

編者按：本文主要從材料與方法；結(jié)果與分析；討論三個方面進行論述。其中，主要包括：油體是植物種子的貯油細(xì)胞器、即使同一粒種子,不同組織中的油體大小也不相同、試驗材料試驗材料為甘藍(lán)型油菜揚油6號、超薄切片與透射電鏡觀察將切過半薄切片的包埋塊進一步修塊、油體的分離油體的分離參考、油體觀察油體的觀察采用電鏡負(fù)染色方法、油體大小的統(tǒng)計分析利用、胚子葉顯微結(jié)構(gòu)、胚子葉超微結(jié)構(gòu)胚子葉超微結(jié)構(gòu)、分離油體的形態(tài)觀察分離的油體經(jīng)負(fù)染色、油體大小的統(tǒng)計分析對分離的油體的大小進行統(tǒng)計分析、植物油體是植物貯油細(xì)胞器等，具體請詳見。

摘要:研究油菜種子樹脂半薄切片和超薄切片,發(fā)現(xiàn)胚子葉細(xì)胞被蛋白體和油體所充實,蛋白體為球狀晶體蛋白體,油體大小差異較大,小油體呈球形,大油體呈橢球形。油體經(jīng)分離和統(tǒng)計分析,表明小油體數(shù)量較多,平均直徑為0.57μm;大油體數(shù)量較少,平均直徑為2.39μm;不同大小油體的數(shù)量隨著油體體積的增加而逐漸減少。

關(guān)鍵詞:油菜;種子;油體

油體是植物種子的貯油細(xì)胞器,通常在子葉、胚乳或盾片中積累,為種子的萌發(fā)和植株的早期生長提供能量[1~3]。油體為直徑0.5~2.5μm的球體,其大小因植物種類的不同而不同,且受營養(yǎng)和環(huán)境的影響。即使同一粒種子,不同組織中的油體大小也不相同[4]。Tzen和Huang提出的油體結(jié)構(gòu)模型認(rèn)為油體內(nèi)部主要為三酰甘油酯(TAG)的液態(tài)基質(zhì),外部則為磷脂單分子層及嵌入其內(nèi)的油體結(jié)合蛋白組成的半單位膜,這個半單位膜的基本單位是由13個磷脂分子和1個油體結(jié)合蛋白分子組成[5]。

油體結(jié)合蛋白占油體表面的20%,但僅占油體總成分的1%~4%,其中90%為油質(zhì)蛋白(oleosin),少量其他蛋白,如鈣結(jié)合油質(zhì)蛋白(caleosin,Sop1)、固醇油質(zhì)蛋白(steroleosin,Sop2)和Sop3等[5,6]。

研究表明,種子含油量與油體大小有一定關(guān)系,而油體大小受油質(zhì)蛋白含量的調(diào)控[7~10]。無論在細(xì)胞中還是在離體狀態(tài)下,油體均非常穩(wěn)定,在干燥種子細(xì)胞內(nèi)或在體外離心分離的懸浮液中,油體之間并不發(fā)生融合或聚合,甚至經(jīng)過長時間的貯存也能保持穩(wěn)定[11]。近年來對油體的研究已有許多報道,集中在油體的形態(tài)、油體的蛋白質(zhì)成分、結(jié)構(gòu)功能和分子水平,以及用油體構(gòu)建的植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白等[12,13]。油菜是我國重要的油料作物,是研究油體的理想實驗材料,但由于油菜的油體較小,目前缺乏快速便捷的用于油菜種子中油體觀察的技術(shù)方法,限制了對油菜油體的研究。本文利用電鏡技術(shù),觀察了油菜油體的形態(tài)和大小,為油菜油體的研究提供重要的參考。

1材料與方法

1.1試驗材料試驗材料為甘藍(lán)型油菜揚油6號(Brassicana-pusL.cvYangyou6),種植于江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗基地。

1.2胚子葉樣品包埋塊制備將種子在ddH2O中于室溫浸泡1d,去除種皮,將胚子葉切成約2mm×2mm大小的小塊,于0.1mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.2)配制的2.5%戊二醛固定液中,0~4℃冷室中固定2d,用相同的緩沖液洗滌3次,再以1%四氧化鋨(緩沖液同前)在室溫固定2.5h。四氧化鋨固定后,用上述緩沖液洗滌3次,乙醇逐級脫水,Spurrs''''樹脂滲透和包埋,60℃聚合2d,獲得樣品包埋塊,干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3半薄切片與光鏡染色觀察樣品包埋塊經(jīng)修塊后,在LeicaEMUC6超薄切片機上用玻璃刀切取1μm厚的半薄切片,然后轉(zhuǎn)移到干凈的載玻片上的一滴雙蒸水上,70℃電熱板上使切片伸展和干燥,60℃烘箱中烘48h以上備用。

半薄切片的光鏡染色參考胡適宜和徐麗云的多重染色法[14],即切片經(jīng)PAS(高碘酸-希夫試劑,period-icacid-Schiffs''''reagent)-蘇丹黑B-考馬斯亮藍(lán)R依次連續(xù)染色后,置于Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察,用附帶的成像系統(tǒng)拍照。

1.4超薄切片與透射電鏡觀察將切過半薄切片的包埋塊進一步修塊,用鉆石刀在超薄切片機上切取厚度約70nm的超薄切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后,在PhilipsTecnai12透射電子顯微鏡(荷蘭)下觀察,用附帶的CCD成像系統(tǒng)拍照。

1.5油體的分離油體的分離參考Tzen等的方法[15],并作適當(dāng)改動。

2g干種子在ddH2O中于室溫浸泡過夜,去除種皮,研磨液(0.6mol/L蔗糖,10mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH7.5)清洗胚,然后在研體內(nèi),4℃下用10mL研磨液充分研磨。研磨液過三層紗布,收集濾液。將上述濾液加到50mL離心管中,小心在其上加10mL漂浮液I(0.4Mol/L蔗糖,10mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH7.5),10000g離心30min,然后收集上層油體,并用20mL去污清洗液(0.1%Tween-20,0.2mol/L蔗糖,5mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH7.5)懸浮油體。將油體懸浮液20mL加到50mL離心管中,小心在其上加20mL10mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5),10000g離心30min,然后收集上層油體,并用20mL離子洗脫液(2mol/L氯化鈉,0.6moL蔗糖,10mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH7.5)懸浮油體。將油體懸浮液20mL加到50mL離心管中,小心在其上加20mL漂浮液II(2mol/L氯化鈉,0.25moL蔗糖,10mmol/L磷酸鈉緩沖液,pH7.5),1000離心30min,然后收集上層油體,并用少量研磨液懸浮油體,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6油體觀察油體的觀察采用電鏡負(fù)染色方法。

將分離的油體用研磨液稀釋合適濃度后,將帶有Formvar支持膜的500目銅網(wǎng)在油體懸浮液滴上漂浮(有支持膜的一面向下)5min,用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體。然后再將銅網(wǎng)在磷鎢酸負(fù)染色液的液滴上漂浮3min,用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體。銅網(wǎng)自然干燥后,在PhilipsTecnai12透射電子顯微鏡(荷蘭)下觀察,用附帶的CCD成像系統(tǒng)拍照。

1.7油體大小的統(tǒng)計分析利用JD801形態(tài)分析軟件測量油體的直徑,從放大3000倍的油體電鏡照片中,隨機測量25個直徑大于1.5mm的油體直徑,測量10張照片,共2個油體;從放大10000倍的油體電鏡照片中,隨機測量50個直徑小于1.5mm的油體的直徑,測量張照片,共500個油體。利用EXCEL,分析計算數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,并進行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1胚子葉顯微結(jié)構(gòu)胚子葉半薄切片經(jīng)PAS-蘇丹黑B-考馬斯亮藍(lán)R多重染色,細(xì)胞中的脂類被染成灰色,貯藏蛋白質(zhì)被染成藍(lán)色,細(xì)胞壁經(jīng)PAS單染后呈紅色,但在其后的蘇丹黑B和考馬斯亮藍(lán)復(fù)染后,顏色變?yōu)樯詈谏?圖1)。胚子葉細(xì)胞被貯藏的脂類和蛋白體

所充實,其中蛋白體分散在細(xì)胞中央,而脂類充滿整個細(xì)胞(圖1)。雖然脂類物質(zhì)以油體的形式存在,但由于油體直徑較小(0.57μm),半薄切片厚度較厚(1μm),因此光學(xué)顯微鏡下無法分辨出油體。

2.2胚子葉超微結(jié)構(gòu)胚子葉超微結(jié)構(gòu)表明,蛋白體多為近球形,體積較大,位于細(xì)胞中間,蛋白體內(nèi)含有球狀晶體,這些球狀晶體在超薄切片時崩出,在蛋白體內(nèi)留下電子透明的空洞,球狀晶體顆粒在蛋白體內(nèi)差異較大(圖2)。細(xì)胞內(nèi)油體大小差異較大,小油體多分布在蛋白體周圍,呈球形;大油體多分布在細(xì)胞壁附近,呈橢球形(圖2)。

2.3分離油體的形態(tài)觀察分離的油體經(jīng)負(fù)染色,利用透射電鏡觀察,表明油體明顯分為大小兩類,小油體數(shù)量較多而大油體數(shù)量較少(圖3)。

2.4油體大小的統(tǒng)計分析對分離的油體的大小進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)油體的直徑在0.1~6.0μm,其中在0.4~0.5μm之間的油體數(shù)量最多,直徑大于0.5μm的油體,其數(shù)量隨著油體直徑的增加而減少(圖4、5)。為了便于統(tǒng)計和分析,將直徑小于1.5μm的油體定義為小油體,而直徑大于1.5μm的油體定義為大油體。

從圖4可以看出,小油體在直徑小于0.5μm時,其數(shù)量隨著油體的體積增加而增加,而在大于0.5μm時,其數(shù)量隨著油體體積的增加而減少(圖4)。圖5顯示的大油體的大小分布,表明大油體的數(shù)量隨著油體體積的增加而逐漸減少(圖5)。對大、小油體的直徑進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,大油體平均直徑為2.39μm,小油體平均直徑為0.57μm。

3討論

植物油體是植物貯油細(xì)胞器,為直徑0.5~2.5μm的小球體,其大小因植物種類的不同而不同,保持這種較小體積可以為脂酶提供最大的作用面積,同時也提高了TAG的流動性[4]。對植物種子中油體大小的研究一直受到人們的關(guān)注。Ting等研究發(fā)現(xiàn),高油玉米品種具有較大的油體和較高的TAG/油質(zhì)蛋白比[7]。Peng等對芝麻油體進行了人工合成,合成的油體大小與TAG/油體蛋白成正比[16]。

Siloto等通過在擬南芥中調(diào)控油質(zhì)蛋白基因的表達(dá)水平,直接證明了油質(zhì)蛋白的積累情況決定種子中油體的大小,而且油體大小的變化會影響種子內(nèi)脂肪酸的累積[9]。油菜種子油體較小,對其形態(tài)和大小的研究較少。本文的超薄切片觀察表明,油體大小差異較大,分布在蛋白體周圍的油體較小,多呈球形,而其它部位的油體較大,形狀多呈橢球。對分離的油體進行統(tǒng)計分析,表明油體以小油體數(shù)目居多,其平均直徑大小為0.57μm,這與Tzen等[4]報道的0.65μm有差異,可能是由于實驗方法不同造成的。

分離的油體和超薄切片都顯示存在大油體,但數(shù)目較少,并且其數(shù)目隨著體積的增加逐漸減少。

Heneen等觀察燕麥胚乳發(fā)育,發(fā)現(xiàn)大油體是由小油體融合而形成,并且油體的大小與含油量有關(guān)[17]。

Hu等通過研究不同含油量油菜品種的油體大小發(fā)現(xiàn)在低含油量品種中具有較大的油體[18]。油菜大油體是如何產(chǎn)生的、油體的大小與含油量的關(guān)系等有待進一步研究。

參考文獻:

[1]程紅焱,宋松泉.種子的貯油細(xì)胞器:油體及其蛋白[J].植物學(xué)通報,2006,23:418-430.

[2]趙傳志,盧金東,蘇磊,等.以油體作為生物反應(yīng)器的研究進展[J].生物技術(shù)通報,2008,(2):73-76.

[3]胡適宜,徐麗云.顯示環(huán)氧樹脂厚切片中多糖、蛋白質(zhì)和脂類的細(xì)胞化學(xué)方法[J].植物學(xué)報,1990,32(11):841