導(dǎo)語(yǔ)：多元統(tǒng)計(jì)分析法評(píng)價(jià)杞菊地黃丸探討一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：建立杞菊地黃丸的HPLC指紋圖譜，為評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。方法：色譜柱：InertsilODS⁃3（4．6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈⁃0．3％磷酸溶液，梯度洗脫；體積流量：0．6ml·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μl。建立杞菊地黃丸的指紋圖譜，根據(jù)相似度評(píng)價(jià)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)杞菊地黃丸進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果：建立25批杞菊地黃丸的HPLC指紋圖譜，共確定26個(gè)共有指紋峰，通過與對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)了8個(gè)成分；25批樣品指紋圖譜相似度為0．731～0．981，通過聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法⁃判別分析（PLS⁃DA），25批樣品分成4類，分類結(jié)果與廠家呈相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異性標(biāo)記物。結(jié)論：所建立的HPLC指紋圖譜方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可為杞菊地黃丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：杞菊地黃丸；高效液相指紋圖譜；相似度評(píng)價(jià)；聚類分析；主成分分析；偏最小二乘法⁃判別分析

杞菊地黃丸由枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等八味中藥組成，現(xiàn)收載于中國(guó)藥典2020年版一部，可用于治療肝腎不足、陰虛陽(yáng)浮、頭暈耳鳴、羞明流淚、視物昏花等癥狀［1］。臨床應(yīng)用方面主要用于治療高血壓、高血脂、干眼癥、慢性結(jié)腸炎、早期老年黃斑變性、腦震蕩后遺癥等［2～5］。目前關(guān)于杞菊地黃丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究更多地是關(guān)于莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量測(cè)定［6～8］，其他成分研究報(bào)道較少。中藥復(fù)方制劑是多成分協(xié)同發(fā)揮治療作用，僅檢測(cè)單一或幾個(gè)成分含量不能充分、全面、客觀的評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量。中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與含量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，可應(yīng)用于質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)、真?zhèn)舞b別等方面。指紋圖譜即可定性鑒別使用，還可體現(xiàn)量的大小，包含的信息量大且多維［9，10］。為了快速、全面的解析數(shù)據(jù)，指紋圖譜數(shù)據(jù)分析常結(jié)合聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判別分析等化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)進(jìn)行［11］。本研究建立杞菊地黃丸的HPLC指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)譜圖進(jìn)行全面分析，為全面評(píng)價(jià)杞菊地黃丸質(zhì)量提供依據(jù)。

1儀器與試藥

Waterse2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；CPA225D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；El⁃masonicP超聲波清洗儀（德國(guó)Elma公司）；水浴鍋（天津泰斯特）莫諾苷對(duì)照品（批號(hào)：111998⁃201602，含量以96．3％計(jì)）、馬錢苷對(duì)照品（批號(hào)：111640⁃201707，含量以99．2％計(jì)）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708⁃201407，含量以100％計(jì)）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753⁃201716，含量以99．3％計(jì)）、木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111720⁃201408，含量以94．9％計(jì)）、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品（批號(hào)：111782⁃201706，含量以97．3％計(jì)）、木犀草素（批號(hào)：111520⁃200504）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸（批號(hào)：E⁃0451⁃19010531，含量以98．0％計(jì)）購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，液相用水為超純水。杞菊地黃丸（大蜜丸）來源于10個(gè)廠家共25批樣品，編號(hào)S1～S12（A廠家，批號(hào)：15010253、16012264、16013102、16013106、16013107、16013311、16013313、16013314、17010773、17010774、17010779、17010781）；編號(hào)S13（B廠家，批號(hào)：1710007）；編號(hào)S14～S16（C廠家，批號(hào)：161101、170401、171101）；編號(hào)S17（D廠家，批號(hào)：20161101）；編號(hào)S18～S20（E廠家，批號(hào)：5480072、5480074、5480075）；編號(hào)S21（F廠家，批號(hào)：115495）；編號(hào)S22（G廠家，批號(hào)：1704026）；編號(hào)S23（H廠家，批號(hào)：1606116）；編號(hào)S24（I廠家，批號(hào)：A17008）；編號(hào)S25（J廠家，批號(hào)：11170926）。

2方法與結(jié)果

2．1色譜條件

色譜柱：InertsilODS⁃3（4．6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）⁃0．3％磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～100min，1％→35％A）；流速：0．6ml·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量10μl。

2．2溶液的制備

2．2．1對(duì)照品溶液精密稱取莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素各對(duì)照品適量，加70％的甲醇制成濃度分別為238．63，131．82，385．13，19．82，13．68，88．32，9．36，20．51μg·ml－1的對(duì)照品混合溶液作為對(duì)照品溶液。2．2．2供試品溶液取剪碎的大蜜丸約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75％乙醇25ml，密封，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用75％乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，既得。2．2．3單味藥材供試品溶液按照樣品處方和工藝，分別取適量枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉，按“2．2．2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備單味藥材溶液。

2．3方法學(xué)考察

2．3．1精密度試驗(yàn)取杞菊地黃丸供試品（編號(hào)：S9）按“2．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2．1”色譜條件下連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖。結(jié)果，以馬錢苷峰為參照峰，26個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD為分別小于0．13％和2．6％（n＝6），將6次采集的色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012．1版本）”，以精密度1為參照?qǐng)D譜，6次采集的圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜相似度均大于0．992，表明儀器精密度良好。2．3．2重復(fù)性試驗(yàn)取杞菊地黃丸供試品（編號(hào)：S9）按“2．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2．1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，以馬錢苷峰為參照峰，26個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD為分別小于0．18％和3．5％（n＝6），將6次采集的色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012．1版本）”，以重復(fù)性1為參照?qǐng)D譜，6次采集的圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜相似度均為1，表明該方法重復(fù)性良好。2．3．3穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2．3．1”項(xiàng)下供試品溶液，在“2．1”色譜條件下于0，2，8，12，24h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果，以馬錢苷峰為參照峰，26個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD為分別小于0．58％和3．3％（n＝5），將5次采集的色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012．1版本）”，以穩(wěn)定性0h色譜圖為參照?qǐng)D譜，4次采集的圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜相似度均大于0．995，表明溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．4共有峰的歸屬及化學(xué)成分的指認(rèn)取

“2．2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、單味藥材供試品溶液，按“2．1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1～圖3，由對(duì)照?qǐng)D譜共指認(rèn)8個(gè)特征峰，分別為峰5莫諾苷、峰7綠原酸、峰9馬錢苷、峰15木犀草苷、峰173，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、峰184，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、峰23木犀草素、峰26丹皮酚。由單味藥材色譜圖比對(duì)可知，峰1，2，5，8，9，10歸屬酒萸肉；峰2，3歸屬熟地黃；峰1，4，6，8，11，13，15，16，24，26歸屬牡丹皮；峰7，8，12，14，15，17，18，19，20，21，22，23，24歸屬菊花；峰25歸屬山藥。

2．5指紋圖譜的建立及相似度的評(píng)價(jià)

［12］分別取25批供試品，按“2．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2．1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012．1版本）”，以S1號(hào)樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度0．2min、中位數(shù)法、多點(diǎn)校正、全譜峰匹配，共標(biāo)定26個(gè)共有峰；計(jì)算相似度，得到25批樣品及對(duì)照指紋圖譜的疊加圖及相似度結(jié)果，見圖4和表1。25批樣品相似度結(jié)果為0．731～0．981，其中S13、S17、S22、S24相似度較差，均低于0．90；其他廠家多個(gè)批次相似度結(jié)果在0．922～0．981之間，相似度較好。

2．6化學(xué)模式識(shí)別分析

［13］2．6．1聚類分析（clusteranalysis，CA）以25批杞菊地黃丸的26個(gè)共有峰面積為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS26．0軟件，采用組間連接，平方歐式距離進(jìn)行聚類分析。由圖5可知，類間距離為5時(shí)25批樣品分為4類，S13（B廠家）一類、S17（D廠家）一類、S24（I廠家）一類、其他廠家一類。聚類趨勢(shì)表明大部分廠家批次的樣品質(zhì)量趨于一致，但個(gè)別廠家樣品有差異性。2．6．2主成分分析（principalcomponentanalysiPCA）將25批樣品的26個(gè)共有峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca⁃P14．1軟件，以26個(gè)共有峰面積值作為變量，進(jìn)行主成分分析，觀察樣品的自然聚集，PCA得分圖見圖6。由圖6可看出，S13、S17、S22、S24樣品與其他樣品分散，其他廠家樣品聚集性明顯，這一結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)及聚類分析結(jié)果一致。2．6．3偏最小二乘法⁃判別分析（discriminantanalsisofpartialleastsquares，PLS⁃DA）CA和PCA分析僅能對(duì)樣品進(jìn)行分類，無(wú)法分析25批樣品間存在差異的原因，為分析引起組間差異的差異標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)將25批樣品共有峰面積值導(dǎo)入Simca⁃P14．1軟件，通過PLS⁃DA分析生成變量重要性投影值圖（VIP圖），VIP可直觀體現(xiàn)各化合物引起組間差異的權(quán)重大小，化合物VIP值大于1說明對(duì)樣品分類結(jié)果權(quán)重影響率大于50％，即對(duì)分類結(jié)果影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為差異標(biāo)志物［10～14］。通過PLS⁃DA分析，得到差異標(biāo)志物（VIP＞1）共16個(gè)，分別為峰8、13、6、17、3、7、24、16、2、10、1、4、18、26、12、21。涉及了能檢出成分的四個(gè)單味藥材。

3討論

3．1供試品溶液制備方法摸索

本試驗(yàn)對(duì)比了不同的提取溶劑（50％甲醇、50％乙醇、70％甲醇、75％乙醇、95％乙醇、純甲醇）、提取方法（超聲提取、加熱回流提取）、提取時(shí)間（30，45，60，75min）對(duì)杞菊地黃丸色譜峰數(shù)量及響應(yīng)值的影響。最終確定制備方法為75％乙醇醇加熱回流提取1h。

3．2流動(dòng)相選擇及優(yōu)化

本試驗(yàn)對(duì)比了不同種類的流動(dòng)相，首先對(duì)比了乙腈、甲醇與酸液，甲醇分析時(shí)間長(zhǎng)且峰型和分離度較差，因此有機(jī)相選擇了乙腈。后又對(duì)比了不同濃度的乙腈⁃磷酸、乙腈⁃冰醋酸溶液、不同的洗脫程序和不同的流速結(jié)果乙腈⁃0．3％磷酸溶液，梯度洗脫色譜峰數(shù)量多，峰型和分離度較好。因此最終確定，以乙腈⁃0．3％磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫。

3．3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用了全波長(zhǎng)掃描測(cè)定了杞菊地黃丸樣品，結(jié)果在254nm下供試品溶液色譜峰信息豐富，色譜峰分離度較好，因此采用254nm作為杞菊地黃丸指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3．4結(jié)果分析

本研究共分析了10個(gè)廠家25批樣品，25批樣品相似度結(jié)果為0．731～0．981，其中S13（B廠家）、S17（D廠家）、S24（I廠家）、S22（G廠家）四個(gè)廠家樣品相似度小于0．90；S1～S12（A廠家）相似度結(jié)果為0．942～0．981，S14～S16（C廠家）相似度結(jié)果為0．922～0．978、S18～S20（E廠家）相似度結(jié)果為0．934～0．974。由相似度結(jié)果看出，同一廠家相似度結(jié)果較好，且大部分廠家樣品相似度結(jié)果差別不大，個(gè)別廠家差異較大。通過聚類分析、主成分分析結(jié)果可以看出S13、S17、S22、S24與其他樣品差異較大，這與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果一致。為了找出差異標(biāo)志物，對(duì)25批樣品進(jìn)行了PLS⁃DA分析，找出影響樣品組間差異標(biāo)志物16個(gè)，這16個(gè)成分涉及酒萸肉、熟地黃、菊花、牡丹皮，說明其質(zhì)量差異影響因素與處方中各單位藥材均相關(guān)。

3．5小結(jié)

本研究建立了25批杞菊地黃丸HPLC指紋圖譜，進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，25批樣品的相似度為0．731～0．981。確定了26個(gè)共有指紋峰，結(jié)合化學(xué)對(duì)照品指認(rèn)出8個(gè)化合物，分別為莫諾苷、綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎寧酸、木犀草素、丹皮酚；并對(duì)25批樣品進(jìn)行了聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判別分析，找出了差異樣品4批和差異標(biāo)志物16個(gè)。該方法簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)，可為杞菊地黃丸質(zhì)量控制提供參考。

作者：王小芳 鄭倩倩 路麗娟 單位：石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心