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【摘要】目的探討外標四點法的可行性。方法HPLC法，色譜柱：ALLTECHC18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相：正丙醇-四氫呋喃-水(1：15：85)，流速1.0ml/min，ELSD參數：漂移管溫度108.0℃；載氣(壓縮空氣)流速3.10L/min。結果外標四點法得出回歸方程，經統計學方法證明成立，且相關系數r顯著。結論外標四點法可以用于銀杏萜類內酯的含量測定。

【關鍵詞】銀杏葉萜類內酯；含量測定；HPLC-ELSD；外標四點法

StudyonreliabilityofESMoffourpointstodeterminetheassayforGinkgoTerpeneLactones

【Abstract】ObjectiveStudyonthereliabilityofESMoffourpoints.MethodsHPLCsystemconsistingofanAlltechC18column(4.6mm×250mm，5μm)，andthemobilephasewasn-Propylalchol，tetrahydrofuranandwater(1:15:84)atflowrateof1.0ml/min.Thedetectortemperaturewas108.0℃andthedrygasflowratewas3.10L/min.ResultsTheESMoffourpointshasbeenestablished.ConclusionTheESMoffourpointscanbeusedondeterminetheassayforGinkgoTerpeneLactones.

【Keywords】ginkgoterpenelactones；assay；HPLC-ELSD；ESMoffourpoints

有關銀杏葉中萜類內酯的含量測定方法的報道較多，目前銀杏葉制劑的萜類內酯含量測定方法采用的多為HPLC法［1～3］。我們亦采用2005版中國藥典收錄的HPLC法［4］，蒸發光散射檢測器進行測定。HPLC-ELSD使用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏葉內酯A、銀杏葉內酯B和銀杏葉內酯C的含量，四種銀杏內酯的含量之和為萜類內酯含量。我們在實際工作中使用外標兩點法時，直接從數值上難以判斷對照溶液的配制是否準確，及其外標兩點法對應的工作曲線(n＝2)是否可靠。因此，同時配制兩份對照溶液各自分別測定5μl、10μl兩點，將四個濃度和相應峰面積一條標準曲線（n＝4），得出回歸方程及相關系數r，通過統計學方法考察曲線和回歸方程是否成立［5］。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀：SHIMADZU-10A；蒸發光散射檢測器ALLTECHELSD2000。

1.2試藥白果內酯，銀杏葉內酯B、銀杏葉內酯C對照品購于中國藥品生物制品檢定所；銀杏葉內酯A對照品購于SIGMA。甲醇為色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件與系統適應性試驗色譜柱：ALLTECHC18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：正丙醇-四氫呋喃-水(1：15：84)；流速1.0ml/min；ELSD參數：漂移管溫度108.0℃；載氣(壓縮空氣)流速3.10L/min；柱溫35℃；進樣量5、15μl。理論塔板數按白果內酯峰計算應不低于2500，相鄰峰的分離度應＞1.5。

2.2對照品溶液的制備分別精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的白果內酯、銀杏葉內酯A、銀杏葉內酯B和銀杏葉內酯C對照品適量，置同一10ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得。

2.2.1對照品溶液一白果內酯22.73mg、銀杏內酯A13.42mg、銀杏內酯B11.13mg和銀杏內酯C9.05mg。

2.2.2對照品溶液二白果內酯14.71mg、銀杏內酯A11.34mg、銀杏內酯B12.24mg和銀杏內酯C18.99mg。

以對照品濃度的自然對數InC(x)為橫坐標，峰面積的自然對數InA(y)為縱坐標作圖，見圖2～5。

圖中四點有成一條直線的趨勢，在直線方程y＝ax+b中，通過統計計算按公式1、2、3分別求出兩個常數a，b及直線的相關系數r，見表2。

2.3外標四點法直線回歸方程的確定分別精密吸取對照品溶液一和二5μl、15μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖。結果：對照溶液中白果內酯(tR＝8.375)、銀杏葉內酯A(tR＝9.811)、銀杏葉內酯B(tR=12.040)和銀杏葉內酯C(tR＝7.194)，相鄰組分分離效果良好(見圖1)。濃度與峰面積的數據及處理見表1。

(出峰順序為銀杏內酯C，白果內酯，銀杏內酯A，銀杏內酯B)

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2.4直線回歸方程的統計學檢驗

2.4.1相關系數檢驗法相關系數表示兩變量間關系的密切程度。使用相關系數檢驗法來進行相關系數的顯著性測驗。見表2。

檢驗rn＝4，顯著性水平α為0.01時，查相關系數臨界值表得r0.01，4＝0.990，表2中r＞r0.01，4，說明確立的回歸方程是有意義的。

2.4.2t檢驗法進行相關系數r的顯著性測驗t檢驗法進行相關系數的顯著性測驗，公式4如下：

t＞t(n-2)，0.01時，x(InC)與y(InA)間的相關關系有非常顯著意義。查表得t（2）0．01＝9．93。表2中t均＞t(2)0.01，所以認為x(InC)與y(InA)之間存在線性相關關系。外標四點對數方程法的直線可確立。

2.4.3外標四點法的重復性考察取對照一與對照二，按照標準曲線的制備進行六次實驗，分別得到六組標準曲線及相關系數r，見表3。

3結論

實驗數據中外標四點法對應的標準曲線相關系數均大于r0.01，4＝0.990，線性相關且回歸方程是有意義的。在實驗得到的回歸方程當相關系數＞0.990時可用計算內酯的含量，該方法增加了標準曲線的可靠性，可有效控制制劑的質量。

【參考文獻】

1MarkBlumenthal.GermangovernmentlimitsGinkgolivlactonelevelsinginkgoleaf.HerralGram，1997，(41):29.

2ZhangL，ChenXP，DongXP，etal.DeterminationofGinkgolactoneinGinkgocapsulesbyHPLC(HPLC法測定銀杏葉膠囊的含量).JiangsuPharmacyandClinicalResearch(江蘇藥學與臨床研究)，2004，12(1)：29-32.

3TangJW.DeterminationofGinkgolactoneinKangmailingcapsulesbyHPLC(HPLC法測定康脈靈膠囊中銀杏萜內酯的含量).TianjinPharmacy(天津藥學)，2005，17(1)：11-13.

4ChP.(中國藥典).VolI.2005.

5蔣子剛，顧學梅.分析檢驗的質量保證和計量認證.上海：華東理工大學出版社，1998，50-210.