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【摘要】目的研制理想的能較快修復大段骨缺損的人工骨材料。方法將重組骨形態發生蛋白-2（rhBMP-2）/透明質酸鈉纖維蛋白復合凝膠（HAFG）緩釋體系和多孔雙相鈣磷陶瓷（BCP）結合研制成BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨，并分別將BCP/HAFG-rhBMP-2和BCP/rhBMP-2及BCP/HAFG人工骨進行兔橈骨大段骨缺損修復的對比研究。術后分別行大體、放射學、組織形態學及生物力學測試。結果試驗中第12周與第2周相比較，3組堿性磷酸酶（AKP）值下降情況分別為BPC/HAFG-rhBMP-2組降低了65.13%，BPC/BMP-2組降低了71.03%，BPC/HAFG組降低了58.59%。組織學及掃描電鏡觀察顯示:12周時BPC/HAFG-rhBMP-2組材料已基本被成熟骨組織所代替，新骨結構與宿主骨無差別，而BPC/HAFG和BPC/rhBMP-2組骨小梁結構疏松細小，材料仍未完全被降解，材料與骨組織間形成較大間隙。術后12周時3組材料植入部位骨組織極限抗壓強度分別為:BCP/HAFG-rhBMP-2組（538±12.7）N、BCP/BMP-2組（368±24.0）N、BCP/HAFG組（256±8.4）N。BPC/HAFG-BMP-2復合型人工骨較BCP/BMP-2及BCP/HAFG人工骨具有更強、更持久的誘導成骨活性。結論BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨能更快促進長骨大段骨缺損的修復，是一種較理想的人工骨材料。

【關鍵詞】骨和骨組織;骨移植;生物力學

為尋找理想的人工骨組織材料，本實驗將多孔雙相鈣磷陶瓷（BCP）同重組骨形態發生蛋白-2（rhBMP-2）/透明質酸鈉（HA）和纖維蛋白復合凝膠（HAFG）緩釋體系結合，制成BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨材料，進行修復長骨大段骨缺損的實驗。

1材料與方法

1.1人工骨材料的制備

（1）BCP由東南大學材料科學與工程學院生物材料研究組研制提供。該BCP材料呈白色多孔狀結構，孔道彼此連通，孔徑約為300μm，孔隙率為80%。試驗中將BCP制成長10mm，直徑4mm圓柱體。

（2）BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨的制備:在BCP植入前用特制雙管注射器將混有等量rhBMP-2的HAFG復合凝膠緩慢滴注入BCP，使其在BCP表面涂布均勻。待復合凝膠由流體狀變為灰白色半鋼性狀態時植入缺損部位。同法制備并植入BCP/HAFG人工骨。（3）BCP/rhBMP-2工骨的制備:利用部分真空吸入法［1］將rhBMP-2和BCP結合在一起。制成的每支人工骨中約含rhBMP-21mg，植入前人工骨在密封包裝下環氧乙烷氣體消毒24h。

1.2實驗動物及分組

新西蘭兔60只，體重2.5～3.2kg，雌雄不限。隨機分為3組:A組為BCP/HAFG-rhBMP-2組;B組為BPC/rhBMP-2組;C組為BPC/HAFG組。

1.3實驗方法

用質量分數為3%的戊巴比妥鈉（1ml·kg-1）靜脈麻醉后，每兔隨機選用左右側前肢，經剃毛、消毒，取橈側切口切開皮膚及皮下組織，顯露橈骨干中段，用單片小鋸鋸下10mm連帶骨膜骨段，然后按組分別植入相應人工骨材料。術后給予慶大霉素10000U·kg-1，每日2次肌肉注射，連續注射3d。常規條件下喂養觀察。

1.4大體觀察

觀察動物的飲食、活動、傷口反應，術后第2、4、8、12周分批處死動物并取材，觀察植入材料的表面、局部成骨及炎癥反應等情況。

1.5X線觀察

術后第4、8、12周攝片，由3人盲法按照Lane-sandhuX射線評分標準［2］進行評分。

1.6堿性磷酸酶（AKP）活性檢測術后第2、4、8、12周3組各取5只動物，全麻后，從心臟抽血3ml離心，使用AKP試劑盒行血清AKP活性測定。

1.7橈骨生物力學檢測

術后12周時，每組各取5個標本及正常橈骨標本作力學強度測試。以材料植入處為中心截取橈骨長約1.4cm。經牙托粉兩端包埋后，置于MTS-858minibionixII型生物力學測試機上進行垂直壓縮試驗。加載速度為1mm·min-1，最大位移設定3mm。每隔0.1s記錄一次數據。

1.8組織病理學觀察

將每次所獲取的橈骨標本作好標記置于10%甲醛中固定24h后，經EDTA脫鈣、梯度酒精脫水、石蠟包埋，沿橈骨縱軸連續切片，厚度為6μm，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.9掃描電鏡觀察

于術后第2、4、8、12周每組各取3個標本，2.5%戊二醛（pH7.2～7.4）固定2h，然后用PBS緩沖液沖洗2次，1%鋨酸PBS液固定2h，再用PBS緩沖液沖洗2次，乙腈逐級脫水，真空干燥，表面離子濺射噴金處理，HITACHIS-520掃描電鏡下觀察標本的超微結構。

2.0統計學處理

采用SPSS11.5統計軟件包，每組測得的X線評分、AKP水平及生物力學評分采用方差及SNK分析，統計學顯著水平為α=0.05。

2結果

2.1大體觀察

術后動物前肢不能負重，跛行，術后1周恢復正常活動。所有動物切口均Ⅰ期愈合。術后2周時，A、B組材料植入區有明顯骨痂生成，而C組材料外周為纖維結締組織包裹。術后8周，A組材料已部分降解，新生骨組織的形成量明顯高于B、C組。12周A組骨缺損完全修復，而其他組骨缺損處仍可見到未吸收的材料及骨缺損（圖1）。

BCP/HAFG-rhBMP-2組骨缺損完全修復，骨皮質塑形良好（左）;BPC/HAFG組材料未完全降解，缺損部分修復（中）;BCP/rhBMP-2組骨缺損大部分愈合，仍可見少量未降解材料（右）

2.2組織學觀察結果

術后2周時，A、B組材料外周新骨開始形成，材料與新骨直接結合，材料內部孔隙中有纖維結締組織間充質細胞進入（圖2）。C組材料外周為纖維結締組織包裹，偶見炎性細胞浸潤，材料內部可見纖維結締組織填充。術后4周，各組骨缺損植入體孔隙中均有軟骨細胞生成，其中A組軟骨細胞量明顯高于B、C組，材料均未見明顯降解。術后8周，A組材料已部分降解，材料內、外新骨繼續增多。B、C組植入的材料少量降解，成骨較稀少，主要位于材料的邊緣區域。12周時，A組材料已基本降解，新生骨組織的形成量明顯高于B、C組。孔隙中有大量成熟的條索狀板層骨形成，骨細胞排列規則，骨小梁較粗大，分布均勻，其間有骨髓組織，中心區板層骨較多，軟骨較少（圖3）。B、C組植入物孔隙中也出現板層骨，但以周邊為主，其間偶見少量骨髓組織，中心區板層骨及軟骨均較少。

2.3AKP活性的變化

術后不同時間點3組AKP測定結果，見表1。在第2周，B組較A組和C組均明顯增高（P<0.05）;隨著術后時間的延長，各組AKP活性逐漸降低，其中B組降低較快，8周時A組AKP活性較其他兩組高，差異有顯著性（P<0.05）;A組與C組的AKP降低幅度較平緩。在第2～12周時間段內，第12周與第2周相比較，A組降低了65.13%，B組降低了71.03%，C組降低了58.59%。12周時各組AKP活性均恢復至正常水平。表13組術后各時間點AKP活性的變化（略）

BPC/HAFG-rhBMP-2材料與新骨之間及材料內部孔隙中有纖維結締組織和間充質細胞進入新生骨組織的骨小梁規則，骨髓腔及骨髓已形成，軟骨細胞較。

2.4生物力學測試結果

術后12周時A、B、C組植入材料和正常橈骨組的極限抗壓強度分別為（538±12.7）N、（368±24.0）N、（256±8.4）N和（547±14.8）N。A組的極限抗壓強度與正常橈骨非常接近，無顯著性差異（P>0.05），且兩者的抗壓強度均明顯高于B組和C組，統計學分析差異有顯著性（P<0.05）。

2.5掃描電鏡檢查

術后2周A、B組可見排列致密的膠原纖維及大量鈣鹽結晶及小梁狀新骨形成，C組未見明顯鈣結晶沉淀。4周時A組材料與骨界面形成骨組織與宿主骨結合，但新骨結構疏松，隨時間延長，骨組織逐漸轉向致密。到12周時A組材料已基本被成熟骨組織所代替，新骨結構與宿主骨無明顯差別（圖4）。而C和B組骨小梁結構疏松細小（圖5），材料仍未完全被降解，材料與骨組織間形成較大間隙（圖6）。

2.6X線檢查

（1）B組:4周時材料與骨界面形成骨組織與宿主骨小梁粗大，密集，較少見到骨吸收陷窩材料仍未完全被降解，可見羥基磷灰石結晶，材料與骨組織間形成較大間隙骨緊密結合，骨缺損內見密度較高的BCP影，周圍有中等量骨痂形成;8周時BCP影密度降低，周圍骨痂形成較前有所增多;12周時BCP影部分消失，骨缺損大部分愈合，骨髓腔部分再通（圖7）。

（2）A組:4周時移植材料與兩骨端融合，骨缺損區有較多骨痂形成;8周時部分骨缺損已愈合，骨髓腔部分再通;12周時全部骨缺損已愈合，皮質骨塑形良好，骨髓腔完全再通（圖8）。

（3）C組:4周時BCP影清晰;8周時BCP影密度降低，有少量骨痂形成;12周時大部分骨缺損仍存在（圖9）。Lane-sandhuX射線評分結果見表2。表23組術后各時間點X射線評分結果（略）

3討論

3.1骨缺損的形成及治療

由于某種因素如外傷、感染、腫瘤等而使骨喪失了一些骨質，形成較大的間隙，稱為骨缺損。骨缺損修復最常用的方法是自體骨或異體骨移植，但自體骨移植的不足是取骨數量受限、影響供骨區生物力學強度和功能、增加患者創傷和痛苦;異體骨具有自體骨一些優越的組織特點及可減少手術次數，但其存在免疫排斥反應，并有感染HIV和肝炎病毒等可能，而且制樣、處理和存貯的成本很高。為克服自體骨和異體骨移植的缺點，人們開始探索利用生物材料修復骨缺損。目前，用于骨缺損修復的生物材料主要有兩大類，一類為人工合成生物材料，如聚乳酸（PLA）、鈣磷陶瓷、聚乙醇烯（PVA）等;另一類為天然高分子材料，如膠原、骨生長因子（BMP）、明膠等。其中聚乳酸類因缺乏骨傳導性、機械強度差及降解產物酸性大等缺點，使其在應用上受到了限制。與其相比生物活性陶瓷具有較好的生物相容性和骨傳導性能。因而近年來國內外對生物活性陶瓷骨替代材料的研究日趨增多。目前對該類材料的研究主要著眼于利用先進的加工技術將其與各種活性因子進行復合，以獲得更好的骨缺損修復能力。

3.2BCP/HAFG-rhBMP-2復合人工骨生物學特性及成骨作用

多孔雙相鈣磷陶瓷材料以鈣、磷為主要成分，與骨基質中的無機成分相似。大量實驗證明它具有良好的生物相容性和降解性，但缺乏骨誘導活性［3］。試驗中將雙相鈣磷陶瓷多孔支架與HAFG-rhBMP-2緩釋體系進行了復合，從而使該材料在具有良好的生物相容性及骨傳導作用的基礎上，又獲得了較持久的體內誘導成骨能力。骨形態發生蛋白（bonemorphogenicprotein，BMP）是一種廣泛分布于各種動物骨組織中的酸性多肽，具有骨誘導活性。但單純的BMP在體內易被蛋白酶分解，其生物學活性難以得到持續性發揮［4］。為了克服這一問題，目前的研究主要是利用有機高分子化合物制成BMP緩釋微球以獲得體內緩釋的效果，但在微球的制備工藝中常需要有機溶劑等理化因素的處理，這使BMP的生物活性受到了影響。本實驗中選擇HAFG復合凝膠作為rhBMP-2的緩釋載體，利用纖維蛋白原發生快速γ交聯和緩慢的α交聯后形成半剛性三維網狀纖維蛋白凝塊，能將HA/rhBMP-2固定于纖維蛋白凝塊網孔內的特性，大大降低了HA在植入局部的溶散率，同時還避免了組織液及纖維蛋白酶過快地進入纖維蛋白凝塊內部，從而使HAFG-rhBMP-2復合凝膠緩釋體系能在機體內存留較長的時間［5］。

BPC/HAFG-BMP-2復合型人工骨的作用機制及優點如下。（1）生物相容性:本試驗將BCP與HAFG進行復合，使材料在成分及結構上與天然骨更為接近，再加上透明質酸及纖維蛋白凝膠聚合時釋放各種生物活性因子，使得細胞更易于在材料表面黏附、增殖并分泌基質。因此該復合材料具有比單純BCP更為良好的生物相容性。（2）骨誘導性:實驗中將rhBMP-2與HAFG制成緩釋體系后再和BCP進行了復合。由于HA帶大量的負電荷，能與帶正電的rhBMP-2形成較好結合，再加上三維網狀纖維蛋白凝塊具有較強的吸附及降低HA/BMP溶散的作用，使得rhBMP-2可隨著復合凝膠的降解緩慢釋放，能較長時間保持局部有效濃度。試驗中對AKP檢測及組織學的觀察結果均提示BPC/HAFG-rhBMP-2復合型人工骨的誘導成骨活性較BPC/rhBMP-2人工骨更為持久。（2）生物降解性:由于羥基磷灰石和磷酸三鈣（tricalciumphos-phate，TCP）在體內降解速度過快，與新骨生長速度不匹配，同時也影響材料植入后的穩固性能［6］。試驗中利用羥基磷灰石的高強度、高生物活性及穩定性，將其與TCP合成BCP系統，使得材料在體內的降解與新骨的生長更為匹配。（3）骨傳導性:BCP主要是依靠它的三維多孔結構，尤其是它的合適孔徑和孔隙間的連通，為成骨細胞的長入提供支撐作用［7］。

因此，BPC/HAFG-rhBMP-2人工骨是一種較理想的骨移植替代材料，具有較高的臨床實用價值。但多孔BCP本身在力學強度及脆性方面還有一定的缺陷，所以將其作為負重骨缺損的修復材料還需要作進一步探討。

［致謝］本研究中的BCP材料由東南大學材料科學與工程學院生物材料研究組董寅生老師提供。

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