導(dǎo)語：如何才能寫好一篇生物質(zhì)譜技術(shù)與方法，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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1質(zhì)譜分析的特點

質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定，同時具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

2質(zhì)譜分析的方法

近年來涌現(xiàn)出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：

①電噴霧電離質(zhì)譜；

②基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜；

③快原子轟擊質(zhì)譜；

④離子噴霧電離質(zhì)譜；

⑤大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛。

3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線型序列[稱為一級結(jié)構(gòu)]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱為二級，三級或四級]結(jié)構(gòu)。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。

3.1蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理以往質(zhì)譜(MS)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

3.2蛋白質(zhì)和肽的序列分析現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現(xiàn)在的研究熱點之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測定方法支持這些研究的進行。現(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測序方法包括N末端序列測定的化學(xué)方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測定標(biāo)準(zhǔn)方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對N末端保護的肽鏈則無法測序。C末端化學(xué)降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測序中，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進行的。近年來隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDITOFMS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前在歐洲分子生物實驗室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結(jié)果提供可靠的依據(jù)。

3.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫，搜索與之相對應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。

3.3.1蛋白消化蛋白的基團越大，質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率。一般而言，6-20個氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測。現(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。

3.3.2基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法(MALDI-TOFMS)簡而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量儀是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)量/電荷之比(mass/charge，m/z)來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。

3.3.3電子噴霧電離質(zhì)譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry，ESI-MS)。

篇2

1.離子化接口

液質(zhì)聯(lián)用經(jīng)歷了約30年的發(fā)展，直至采用了大氣壓電離（（API）技術(shù)之后，才發(fā)展成為可常規(guī)應(yīng)用的重要分離分析方法。液質(zhì)中最常用有大氣壓電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI），兩者同屬于大氣壓電離（API）技術(shù)，其離子化過程發(fā)生在大氣壓下，這與氣質(zhì)中采用在真空下電離的技術(shù)有本質(zhì)不同。其中ESI技術(shù)應(yīng)用更為廣泛。

2.質(zhì)量分析器

用于液質(zhì)聯(lián)用儀中最常用的有四極桿質(zhì)譜儀，離子阱質(zhì)譜儀、飛行時間質(zhì)譜儀、四極離子阱質(zhì)譜儀和四極飛行時間質(zhì)譜儀等等。迄今為止，四極質(zhì)譜儀與其它質(zhì)譜儀相比，仍然是應(yīng)用最為廣泛的。其包括單四極質(zhì)譜儀和三重四極質(zhì)譜儀。

單四極質(zhì)譜儀的主要優(yōu)點是相對可靠、優(yōu)良的性價比，適合于定性定量分析。其缺點是質(zhì)譜譜圖分辨率較低。只有在測定成分是純物質(zhì)且沒有化學(xué)背景雜質(zhì)與之重疊時，才可能測定準(zhǔn)確質(zhì)量。用單四極質(zhì)譜儀作定量分析采用選擇離子監(jiān)測（SIM），檢測限取決于能否將目標(biāo)化合物與樣品中的其它成分（包括背景干擾）加以區(qū)別。

單四極質(zhì)譜儀無法實現(xiàn)MS/MS功能，若需要該功能，以進行化合物結(jié)構(gòu)分析或者選擇反應(yīng)檢測（SRM）以提高選擇性及定量分析檢測限，則要采用三重四極質(zhì)譜儀（QQQMS或TQMS）。目前，用液質(zhì)聯(lián)用儀進行復(fù)雜成分的定量分析時，三重四極質(zhì)譜仍是首選儀器，它具有多種MS/MS功能，除產(chǎn)物離子掃描外，還有前體離子掃描和恒定中性丟失掃描。

二、液質(zhì)聯(lián)用儀的應(yīng)用概況

1.藥學(xué)領(lǐng)域

將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于藥物及其代謝產(chǎn)物研究是該技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛、研究論文報道最多的領(lǐng)域。液相質(zhì)譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用顯示了獨特的優(yōu)勢，代表了藥物代謝研究的發(fā)展趨勢。

從質(zhì)量分析器的角度看，盡管QQQMS在藥物生物轉(zhuǎn)化與代謝產(chǎn)物鑒定上取得顯著的貢獻，但他的局限性在于四極桿質(zhì)量分析器沒有足夠的質(zhì)量準(zhǔn)確度，不能給出母離子和子離子的元素組成，因此，用于結(jié)構(gòu)鑒定有時不夠明確。與QQQ相比，離子阱（TRAP）在MS和MS/MS的全掃描功能上更強，而且它的多級質(zhì)譜測定（MSn）靈敏度較好，并能解釋分子裂解過程。現(xiàn)在常常應(yīng)用此功能進行代謝物鑒定。但是TRAP具有低質(zhì)量截止點（1/3效應(yīng)）、碰撞效率低和定量分析性能較差等缺憾，而Q-TRAP不但可以克服這些缺點，而且可以選擇母離子掃描和中性丟失掃描等。Q-TRAP用于代謝產(chǎn)物是相對較新的方法，其組成相當(dāng)于QQQ中的第3個Q用線性離子阱代替，可以得到更豐富的數(shù)據(jù)。Q-TOF可以精確測定母體藥物或代謝產(chǎn)物分子以及由CID產(chǎn)生的碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量，從而獲得其元素的組成，但只有當(dāng)母離子不受元素組成相同的離子的干擾時，才可能用子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量測定去做結(jié)構(gòu)解析。QQQ以及Q-TOF還有一個局限性是產(chǎn)生的CID圖譜不能將一級子離子與二級或三級分解子離子區(qū)分開來，使圖譜解析變得困難。而Q-TRAP可以在質(zhì)譜分析的每一階段將母離子隔離并捕獲，從而可以確定離子的親緣關(guān)系，使代謝物的CID圖譜的解釋變得較為容易。

2.食品領(lǐng)域

食品中的化學(xué)污染物包括：農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、添加劑、加工過程中的污染物、有毒或不潔的包裝材料、環(huán)境污染物、生物毒素、真菌毒素以及重金屬等。對這些污染物的監(jiān)測能力則是控制食品安全的關(guān)鍵所在。此類分析對樣品的制備方法要求較高，并對分析儀器的檢測能力要求更為苛刻。

目前，國外LC/MS在農(nóng)殘上的應(yīng)用以分析苯脲、三嗪、氨基甲酸酯、氯苯氧酸及硝基酚為主。分析儀器主要使用QQQ和Q-IT。定量分析使用SIM。不同的農(nóng)藥分析需要選取不同的檢測模式。一般說來，中性及堿性農(nóng)藥，如三嗪、氨基甲酸酯、有機磷、季胺鹽農(nóng)藥、苯脲使用正離子（PI）檢測，而酸性農(nóng)藥，如苯氧酸、磺酰脲使用負離子（NI）檢測。有時兩種模式同時使用。

3.代謝組學(xué)

代謝組學(xué)以生物體液為研究對象，包括尿液、膽汁、血漿、組織提取液、腦脊液、、唾液、膀胱液等，力求分析生物體系中的所有代謝產(chǎn)物，整個分析過程應(yīng)能盡可能地保留和反映總體代謝產(chǎn)物的信息。

代謝組學(xué)要求分析生物體系中所有的代謝產(chǎn)物，單一的分析技術(shù)難以滿足這一要求。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）具有高靈敏度、高重復(fù)性、可檢庫鑒定已知物等特點，其局限性是樣品必須氣化，且不能分析大分子、難揮發(fā)性物質(zhì)和熱不穩(wěn)定性物質(zhì)；核磁共振（NMR）對樣品無損傷且重復(fù)性好，廣泛應(yīng)用于藥物工業(yè)和病人的尿、血樣分析，但其靈敏度不高，不能鑒定混合物；而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC/MS）是具有高效、快速分離效能的LC與靈敏、準(zhǔn)確的MS或MSn的結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于難揮發(fā)性化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物和大分子化合物（包括蛋白質(zhì)、多肽、多糖、多聚物等）的分析，既可定性，也可定量，是最具前途的代謝組學(xué)的研究技術(shù)之一。

4.蛋白質(zhì)組學(xué)

80年代后期在有機質(zhì)譜的發(fā)展中出現(xiàn)了歷史性的巧合，同期出現(xiàn)了基體輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI/TOF/MS）和電噴霧電離質(zhì)譜 （ESI/MS），打開了有機質(zhì)譜分析研究生物大分子的新領(lǐng)域，并很快發(fā)展成為能在所有層次上分析研究蛋白質(zhì)和其它生物分子的生物質(zhì)譜學(xué)。MALDI/TOF/MS 的肽質(zhì)量指紋譜方法（PMF）具有高通量高靈敏度和操作簡便等優(yōu)點，已得到了廣泛的應(yīng)用，但它不適合分析蛋白質(zhì)的混合物。與之相比HPLC/ESI/MS/ MS雖然只有較低的高通量分析，但能取得更好的分析結(jié)果，而且適合分析蛋白質(zhì)混合物和蛋白質(zhì)復(fù)合物。

5.同時液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)還廣泛應(yīng)用于興奮劑檢測、物證鑒定、印染行業(yè)有害物質(zhì)檢測、環(huán)境污染物分析、臨床診斷研究等領(lǐng)域。

篇3

EDC和POPs對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成的不良影響，危害人類的生殖能力，誘發(fā)腫瘤、影響人類神經(jīng)系統(tǒng)，成為繼溫室效應(yīng)、臭氧層破壞之后的第三大環(huán)境問題，引起全球廣泛關(guān)注，其分析檢測技術(shù)和方法的相關(guān)研究也得到廣泛關(guān)注。

EDC和POPs多有交叉，多數(shù)環(huán)境激素屬于持久性有機污染物，而持久性有機物幾乎都直接或間接地具有環(huán)境激素作用。我國從2004年開始開展水環(huán)境中持久性有機物和環(huán)境激素的檢測，目前已有多個研究機構(gòu)發(fā)展了EDC和Pops的分析能力，并應(yīng)用于水環(huán)境污染與評價研究；國外對該類有機污染物的檢測更是超過30年，如對水環(huán)境中多氯聯(lián)苯（PCBs），多氯代烷烴（PCAS），多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）等的轉(zhuǎn)化和遷徙均進行了大量的研究工作[3]。

當(dāng)前水環(huán)境中持久性有機物和環(huán)境激素的檢測技術(shù)仍隨著檢測新技術(shù)的發(fā)展而不斷改進與提高。本文一方面介紹水環(huán)境中環(huán)境激素和持久性有機物的檢測技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，另一方面對檢測技術(shù)中運用的重要技術(shù)特點，包括高分辯氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用或多重質(zhì)譜（HSGC/MS/MS）、柱后衍生、大體積富集濃縮等技術(shù)的要點進行分析，以利廣大環(huán)境研究工作者參考和借鑒。

1儀器分析技術(shù)

1.1色譜與質(zhì)譜分析

在水環(huán)境中，EDC和POPs具有分布廣泛、殘留濃度低的特點，因此，對水環(huán)境中的POPs進行分析時，要求分析手段必須具有靈敏、準(zhǔn)確、快速和自動化程度高等特點。氣相色譜法（GC）、氣相色譜/質(zhì)譜法（GC/MS）等是常用的分析方法。

采用氣相色譜進行分離分析時，配合電子捕獲檢測器（ECD）可以提高靈敏度。采用大容量注射（如編程的溫度汽化器，或柱上進樣）注入幾十微升的樣本提取，可以提高檢測限[4]。采用GC/MS，須針對環(huán)境激素的質(zhì)譜裂解特征，確定各個化合物的靈敏度高、抗干擾能力強的準(zhǔn)分子離子和子離子，優(yōu)化質(zhì)譜檢測模式，各個化合物的檢測條件，使每個組分均可獲得高的專一性和高靈敏度，使同時快速檢測痕量多組分成為可能。同時，用程序升溫方法，優(yōu)化氣相色譜方法，盡可能的提高分離度，為質(zhì)譜分析提供基礎(chǔ)。薛南東等采用GC-ECD檢測、GC-MSD定性證實的農(nóng)藥類內(nèi)分泌干擾物檢測方法,實現(xiàn)31種目標(biāo)物同時檢測[5]。常愛敏等采用GC-ECD定量檢測,GC-MS定性驗證,建立了同時分析水中31種農(nóng)藥類環(huán)境激素的檢測方法[6]。

采用GC/MS進行EDC的檢測，對樣品進行衍生化處理，可提高質(zhì)譜檢測靈敏度。普遍采用的方法為三甲基硅烷（TMS）衍生化，如加入100μL吡啶，200μL含有1%三甲基氯硅烷（TMCS）的雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA），混勻，密封，在70℃下水浴1h。

1.2GC或LC與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

POPs干擾物質(zhì)多、組成復(fù)雜，且毒殺芬、多氯聯(lián)苯、二惡英等包含多種同系物或異構(gòu)體，普通的低分辨質(zhì)譜難于達到上述要求。高分辨質(zhì)譜或多級質(zhì)譜，借助其高靈敏度和高選擇性、高特異性，能達到對POPs定性和定量的要求，因此，成為目前的發(fā)展趨勢[7]。

采用氣相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜(GC/MS/MS)法測定多氯聯(lián)苯(PCB),具有良好的靈敏度和選擇性,在地表水樣品檢測時,樣品只需進行簡單的液液萃取一濃縮,無須任何凈化過程即可上機分析,方法檢出限低于ng/L級[8]。

液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS),顏流水等建立了基于時間分段技術(shù)的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定飲用水中9種環(huán)境激素殘留的方法，利用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)和掃描時間分段檢測技術(shù)實現(xiàn)正、負離子不同掃描模式一次完成雙酚A和鄰苯二甲酸二丁酯的檢測，研究并建立了飲用水中環(huán)境激素的多組分快速檢測方法[9]。

2預(yù)處理技術(shù)

在應(yīng)用氣相色譜法(簡稱GC)或高效液相色譜法(簡稱HPLC)進行有機物分析，尤其是環(huán)境中EDC、POPs、PCB、Dionex等超痕量、多組分物質(zhì)的分析時，由于特異性、選擇性和靈敏度的要求極高，各種樣品的預(yù)處理技術(shù)被予以重視并得到充分應(yīng)用[10]。

2.1大體積富集濃縮技術(shù)

無論是EDCs還是POPs的水環(huán)境樣品檢測，都需要對大體積樣品進行富集、提取、濃縮，降低被測定物質(zhì)的檢測限，提高檢測靈敏度，實現(xiàn)痕量檢測。在EDC和POPs的檢測中，一般情況下，每個樣品都采集10L至20L水樣，經(jīng)過萃取濃縮，最后達到1mL甚至0.1mL的進樣體積，以滿足超痕量分析的需要。

在POPs水樣預(yù)處理中，采用丙酮和正己烷等有機溶劑，對12L水樣進行液-液萃取分離。對這樣大容量樣品進行萃取，可以巧妙地利用磁力攪拌，充分混合水相和有機相，使水相中POPs最大限度地轉(zhuǎn)移至有機相中。

2.2固相萃取技術(shù)

固相萃取技術(shù)(SolidPhaseExtraction，SPE)是一種吸附劑萃取技術(shù)，樣品通過填充吸附劑萃取柱，分析物和部分雜質(zhì)被保留在柱上，然后用選擇性溶劑除去雜質(zhì)，洗脫出分析物，從而達到分離和富集目的。EDCs分析中，普遍采用SPE技術(shù)進行EDC樣品的前處理。比如處理水樣體積為10L水樣。采用oasisHLB5cc萃取柱（玻璃壁）進行固相萃取，采用二氯甲烷和丙酮混合溶劑（70％二氯甲烷/30％丙酮）進行洗脫。

不同固相萃取吸附劑適用于不同環(huán)境激素的富集、凈化，這方面的優(yōu)化研究對象包括硅藻土吸附劑、氧化鋁吸附劑、活性炭吸附劑、鍵合硅膠基吸附劑、有機聚合物吸附劑。經(jīng)過優(yōu)化篩選出回收率高，凈化能力強的高效固相萃取劑，為痕量多組分同時檢測提供樣品處理方法。

2.3濾膜技術(shù)的廣泛應(yīng)用

濾膜技術(shù)廣泛應(yīng)用于EDCs分析中，對大體積樣品進行SPE之前，往往采用Millipore玻璃纖維濾膜（孔徑1μm）對水樣進行初步過濾，以去除雜質(zhì)、固液分離、膜萃取有機物。在EDCs和POPs的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用各種濾膜。在POPs分析中，采用高通量濾膜將水樣中的固體和液體部分過濾分離，分別處理后進行檢測分析。

2.4微波萃取技術(shù)

在利用液-液萃取分離富集固形物質(zhì)中的POPs時，濾膜中固體物質(zhì)可采用微波萃取進行分離。微波萃取時，為提高萃取效率，可將每張濾膜撕成條狀，放入50mL具有螺旋蓋的圓底離心管，每瓶加入溶劑，采用微波進行多次提取，保證了提取效率。最后一次離心后擠壓濾紙，收集殘留的萃取液，保證提取完全。

2.5大容量和分步濃縮技術(shù)

無論是EDC檢測中SPE處理后的洗脫液，還是POPs檢測中反復(fù)液-液萃取處理之后的丙酮層，均可使用濃縮儀進行濃縮。POPs分析中還采用了分步濃縮技術(shù)，先將萃取液濃縮至5mL，進行凈化處理，之后再濃縮至0.1mL進行GC/MS分析。高效濃縮技術(shù)能保證富集效率，滿足GC/MS的檢測要求，有效降低方法的檢測限。

2.6凈化柱技術(shù)

在EDC分析中，采用硅凈化柱（5％aqueousSilicagelcolumn）過濾，或者在固相萃取小柱之后連接凈化柱，在SPE的洗脫步驟之后，連續(xù)實現(xiàn)樣品的脫水和凈化。對POPs分析中濃縮至5mL的初步濃縮液，也同樣使用凈化柱，實現(xiàn)樣品的脫水和凈化。與采用無機物凈化相比，凈化柱能大大提高樣品的凈化程度，減少進入GC/MS的樣品中的雜質(zhì)，有利于后續(xù)GC/MS的高效分析工作。

3快速檢測方法的應(yīng)用

EDC分析中，除了使用高分辨分析儀器，還可利用生物對POPs的某些特征反應(yīng)進行檢測，以實現(xiàn)對環(huán)境中POPs的檢測，主要包括:生物傳感器檢測法、表面胞質(zhì)團共振(SPR)檢測法和以Ah受體為基礎(chǔ)的生物測試方法等。

例如采用特異性核受體檢測技術(shù)——NuclearLigandAssay的CoA-BaP系統(tǒng)（共激活劑－細菌堿性磷酸酶）進行EDC的生物分析。這是一種快速的生物配體篩選方法，易于使用，敏感度高，適用于大多數(shù)核受體。特異性核受體檢測技術(shù)使用器材為ERα雌激素試劑盒（MicrosystemCompany），應(yīng)用96孔板，具有高效、高通量篩選的特征[11]。

4結(jié)束語

在EDC和POPs檢測中，嚴密的工作方案是十分重要的，比如，對一個樣品進行反復(fù)萃取，能提高POPs和其他目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率。

實驗過程中必須嚴格避免交叉污染，避免有毒物質(zhì)對實驗室環(huán)境的沾污。實驗室操作中，非常注意器具和材料不能直接接觸桌面。分離的濾膜如果不能立即分析，用無塵紙包覆，并置于錫箔內(nèi)，嚴格避光保存于4℃以下。

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關(guān)鍵詞：肽類毒素　脂多糖內(nèi)毒素　霉菌毒素　檢測方法

項目類別：農(nóng)業(yè)科技 項目編號：XF11C004 項目名稱：徐州市乳品質(zhì)量安全檢測技術(shù)

生物毒素主要指微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的有毒化學(xué)物質(zhì)，微量毒素侵入機體后即可引起生物機能破壞，使人畜中毒。包括肽類毒素、脂多糖內(nèi)毒素、霉菌毒素等。

肽類毒素主要有溶血素、腸毒素等，其中產(chǎn)生溶血素的細菌主要有單核細胞增生李斯特菌、霍亂弧菌等。溶血素的致病機理是作用于細胞膜，造成其結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，使大量細胞內(nèi)的成分泄漏，導(dǎo)致細胞死亡。產(chǎn)生腸毒素的細菌主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌等。腸毒素是細菌外毒素，通過吸收或在腸內(nèi)產(chǎn)生，作用于腸黏膜，通常引起腹瀉等不適癥狀。

脂多糖內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分。研究表明，過量的脂多糖內(nèi)毒素可引起機體嚴重的病理生理反應(yīng)，表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓、休克、器官功能衰竭甚至死亡等。

霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的一種有毒的次級代謝產(chǎn)物，它是主要的真菌毒素，多數(shù)具有致癌作用。霉菌毒素主要有：黃曲霉素、赭曲霉素、單端孢霉烯族毒素等。目前為止，黃曲霉毒素有　B　1、B　2、M　1、M　2、G　1、G2　等幾種，其中黃曲霉素B1的毒性和致癌性最強，被稱為第一大類致癌物。赭曲霉素有　A、B、C、D　共4　種，其中毒性最大的是赭曲霉素A。單端孢霉烯族毒素中比較常見的是A　類單端孢霉烯族毒素，它主要包括T-2　毒素和HT-2　毒素。

目前，生物毒素的檢測技術(shù)已得到越來越多的重視，國內(nèi)外學(xué)者對這些毒素也研究頗多。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)以檢測致病菌為主，需要培養(yǎng)，檢測時間長。現(xiàn)代檢測技術(shù)簡便、快速、靈敏度高，且能達到微量檢測的目的。本文對這些生物毒素的檢測技術(shù)進行較為詳細的闡述并對這些方法的特點進行總結(jié)。

1、肽類毒素的檢測

肽類毒素傳統(tǒng)的檢測方法主要有：酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和生物傳感技術(shù)等。近年來產(chǎn)生了一些新興檢測技術(shù)，如：懸浮芯片技術(shù)等。

1.1　酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是利用酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原或抗體反應(yīng)和酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。所生成的顏色深淺與待測標(biāo)本含量成比例，由此進行定性或定量分析。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是一種敏感、快速、簡單的方法，應(yīng)用較廣，但是利用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素時，會因為假陽性或假陰性影響檢測結(jié)果。

1.2　聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是一種在體外模擬DNA　復(fù)制過程，對特定的DNA或DN段進行快速擴增的方法。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)具有靈敏度高、檢測時間短等優(yōu)點。目前常用的聚合酶鏈反應(yīng)種類有定性聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)是把熒光基團加入普通聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)反應(yīng)體系中，利用熒光信號積累檢測整個聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)的進程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知物進行定量。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)比常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)自動化程度更高、特異性更強，其應(yīng)用也更廣泛。根據(jù)報道已有包括葡萄球菌各型腸毒素，大腸桿菌毒素等30多種毒素可以應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)來檢驗。

1.3　生物傳感技術(shù)

生物傳感技術(shù)是以酶的催化或者抗原抗體結(jié)合等特異反應(yīng)，通過換能器將反應(yīng)結(jié)果輸出為可檢測的信號通過信號分析定性或定量待測物質(zhì)。生物傳感器檢測法具有分析速度快、檢樣微量、生物功能膜可反復(fù)多次使用等特點，可用于許多物質(zhì)的檢測。

1.4　懸浮芯片技術(shù)

懸浮芯片技術(shù)具有操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點。國外已經(jīng)有利用懸浮芯片技術(shù)檢測的報道。國內(nèi)孫肖紅等利用懸浮芯片系統(tǒng)建立檢測模型，檢測不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B，其線性范圍為0.2～1653.4ng/mL，最低檢測值為203pg/mL均優(yōu)于酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（最低檢測質(zhì)量濃度為60ng/mL），除與2.μg/mL金黃色葡萄球菌熱休克毒素有交叉反應(yīng)外，和其他幾種細菌、毒素、蛋白均無交叉反應(yīng)。實驗證明懸浮芯片定量檢測方法對于模擬添加的金黃色葡萄球菌腸毒素B　具有良好的檢測效果。這比國外報道的熒光免疫層析法、磁免疫層析法、芯片傳感器等方法的靈敏度都要高，與生物傳感器-　質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細管芯片技術(shù)等在同一數(shù)量級。綜合國內(nèi)外對懸浮芯片的研究來看，該技術(shù)應(yīng)用前景十分廣闊，但是懸浮芯片能否從粉末樣品中直接檢測毒素和病原，尚缺乏模型和評價。

2、脂多糖內(nèi)毒素的檢測

1968年，國外研究人員Levin等建立了利用鱟實驗檢測脂多糖內(nèi)毒素的方法。近幾十年來，脂多糖內(nèi)毒素的檢測方法已有很大進展，實驗簡便、經(jīng)濟、準(zhǔn)確性高，但是由于費時、響應(yīng)慢、自動化程度低等原因已限制了其應(yīng)用。近十年來出現(xiàn)了利用生物傳感技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測細菌內(nèi)毒素的報道。國外研究人員Goh等用增強型綠色熒光蛋白固定在傳感器上制成了熒光內(nèi)毒素生物傳感器，根據(jù)脂多糖內(nèi)毒素與之結(jié)合時熒光強度的衰減檢測細菌內(nèi)毒素的含量。此熒光生物傳感器存在非分析物產(chǎn)生的熒光干擾問題，是近年來發(fā)展較快的一類光學(xué)生物傳感器。國內(nèi)岳麗娜等利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)用技術(shù)，對脂多糖內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品所含的3-羥基脂肪酸種類進行檢測，用于分析脂多糖內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品菌種來源的純度。結(jié)果表明脂多糖內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品中含有非腸道細菌，因此會出現(xiàn)誤差，對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)用法檢測脂多糖內(nèi)毒素，不受其標(biāo)準(zhǔn)品及細菌的生物活性的限制，可用于細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品菌株來源的輔助監(jiān)控及應(yīng)用中的異常情況的研究分析。

此外，檢測脂多糖內(nèi)毒素也有酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)、流式細胞術(shù)、化學(xué)發(fā)光測定法等方法，這些方法特異性、準(zhǔn)確性高，但需要專業(yè)人員操作，步驟多，必須在實驗室完成，其應(yīng)用需要大量實際操作驗證。

3、霉菌毒素的檢測

檢測霉菌霉素的常規(guī)方法由經(jīng)典的薄層色譜法發(fā)展到高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)、免疫親和層析法等。現(xiàn)在，質(zhì)譜分析已被引入毒素分析中并衍生出各種質(zhì)譜方法，如高效液相色譜法-常壓化學(xué)電離質(zhì)譜測定法、液質(zhì)連用法、電噴霧-質(zhì)譜法、液相串聯(lián)質(zhì)譜法、超高壓液相聯(lián)合三重四極桿質(zhì)譜儀法，及同時測定上百種樣品的高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜-電噴霧陽離子等技術(shù)。隨著這些新方法、新手段的發(fā)展，為霉菌毒素的檢測提供了比較廣的選擇，適應(yīng)了不同的檢測目的和要求。

3.1　薄層色譜法

薄層色譜法是測定食品中霉菌毒素的經(jīng)典方法，該方法操作簡便、費用低、能同時定性定量霉菌毒素。其檢測過程是：提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離。由于此方法操作繁瑣、靈敏度低，現(xiàn)在的研究重點是改進樣品的提取和凈化方法，因此建立了薄層掃描法來測定霉菌毒素，進而提高薄層色譜法的精度。國內(nèi)張寰等報道了利用薄層掃描法，在掃描儀上繪制黃曲霉毒素掃描圖譜，并由此分辨出黃曲霉素種類，然后定量分析，從而得到樣品的黃曲霉毒素含量。鑒于此方法的靈敏度低、安全性差等缺點，已越來越不適用現(xiàn)代分析的要求。

3.2　高效液相色譜法

高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測限低、定量準(zhǔn)確的特點，是定性定量霉菌毒素的常用方法，其中應(yīng)用最廣的是反相高效液相色譜法。國外研究人員Sobolev等利用高效液相色譜法，以新研發(fā)的氧化物質(zhì)Al2O3作為流動相，對農(nóng)產(chǎn)品的甲醇　―　水提取液進行凈化處理，樣品中加標(biāo)品2.5～7.5ng/g，結(jié)果表明：AFBl、AFB2、AFGl、AFG2　的回收率為　80%～87%，最低檢測限為1.0ng/g，此方法與商業(yè)檢測黃曲霉素方法相比，凈化設(shè)備費用更低。國外研究人員Razzazi-Fazeli等利用高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測單端孢霉烯族毒素，檢測限為　5　0～8　5　n　g　/　g，回收率為77%～101%。鑒于高效液相色譜法的這些優(yōu)點，其在霉菌毒素檢測中的應(yīng)用越來越多，但是由于樣品前處理較復(fù)雜，設(shè)備昂貴，操作時需專門人員等問題，難以滿足快速檢測的目的，限制了其應(yīng)用。

3.3　酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)法靈敏度高、特異性強、操作簡便，適宜大量樣品的快速篩選，且設(shè)備費用比高效液相色譜法低，因此廣泛用于霉菌毒素的檢測。利用此方法檢測霉菌毒素可以達到定性定量的目的。此外，根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)開發(fā)的毒素試劑盒實現(xiàn)了快速檢測霉菌毒素的目的。國外Saha等利用基于酶聯(lián)免疫檢測的流動裝置檢測紅辣椒中黃曲霉素B1與赭曲霉毒素A，檢測限分別為2ng/g　和10ng/g，結(jié)果證明此方法準(zhǔn)確性高，與單獨酶聯(lián)免疫檢測相關(guān)性良好，并且為歐盟的法定標(biāo)準(zhǔn)提供了簡單、快速、有效的檢測方法。酶聯(lián)免疫檢測測定結(jié)果易出現(xiàn)假陽性問題，且只能測定單一毒素。目前的一項研究是將酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)和膠體金技術(shù)與噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，此方法可以顯著提高檢測限，縮短檢測時間，同時可以減少毒素測定中所使用的毒素標(biāo)準(zhǔn)品對實驗人員及環(huán)境的危害，這種結(jié)合技術(shù)應(yīng)用前景廣闊[　31]。

3.4　免疫親和柱法

免疫親和柱是以單克隆免疫親和柱為分離手段，根據(jù)單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)后將其填柱形成免疫親和柱，并與霉菌毒素抗原產(chǎn)生一一對應(yīng)的特異性吸附關(guān)系。免疫親和柱法包括免疫親和柱-熒光光度法和免疫親和柱-高效液相色譜法。裴道國等采用改良型免疫親和柱凈化-　熒光光度檢測技術(shù)檢測花生及花生制品中的黃曲霉毒素。結(jié)果表明：改良后的方法具有更好的準(zhǔn)確性和精密度，檢測技術(shù)操作更簡便，檢測時間由傳統(tǒng)的25min縮短至10min，大大提高了檢測效率。免疫親和柱-高效液相色譜法用于檢測霉菌毒素在國內(nèi)外的報道中也比較多。陳新等利用免疫親和柱-高效液相色譜法分別定量地檢測飼料中的黃曲霉毒素B1、B2、G1　和G2，在黃曲霉毒素B1為0～50μg/kg　測定范圍內(nèi)其線性相關(guān)系數(shù)為0.91，檢測靈敏度為1μg/kg，可以作為測定飼料及飼料原料中的黃曲霉毒素B1的定量確認法。國外研究人員Aksenov等利用免疫親和柱-熒光-高效液相色譜法檢測了赭曲霉素，將檢測限提高至0.5mg/kg，優(yōu)化了其檢測方法。免疫親和柱法簡便快速、靈敏度極高，一個樣品只需10～15min，比傳統(tǒng)方法快。特別是免疫親和柱-高效液相色譜法可以特效性地將霉菌毒素或其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高，比高效液相色譜法更有優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

4、結(jié)論

生物毒素的檢測方法多種多樣，但其靈敏度、精度、適用條件各不相同。近幾年來，檢測肽類毒素切實可用的檢測方法主要是熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，生物傳感器技術(shù)因其分析速度快、檢樣微量等特點，可用于許多物質(zhì)的檢測，但在國內(nèi)的使用情況來看，由于成本高而不能被廣泛采用。懸浮芯片技術(shù)由于操作簡便、靈敏度高以及線性范圍寬等優(yōu)點，未來的應(yīng)用前景將十分廣闊。利用氣色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測脂多糖內(nèi)毒素的技術(shù)相對比較成熟，而免疫學(xué)方法在我國還處于理論階段，未來還需要大量的實踐驗證及優(yōu)化。檢測霉菌毒素較常用的檢測方法是酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)法和免疫親和柱法。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)法法操作簡便，成本比較低，適合大量樣品的快速篩選，且設(shè)備費用較低，因此在我國已廣泛應(yīng)用。免疫親和柱法快速簡便、靈敏度極高，分離效率和回收率高。另外，國外一些新技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和使用，在我國是值得引進且具有推廣價值的。

參考文獻

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篇5

關(guān)鍵詞：食品安全；現(xiàn)代檢測技術(shù)；食品檢測

1引言

近年來，食品安全問題逐漸成為全球關(guān)注的焦點之一。危及人類健康和生命安全的重大食品安全事件屢屢發(fā)生，從歐州的瘋牛病、二惡英到我國的蘇丹紅、瘦肉精和三聚氰胺等令人防不勝防。新技術(shù)的發(fā)展、農(nóng)用化學(xué)品的濫用，養(yǎng)殖業(yè)的不規(guī)范用藥以及環(huán)境的污染等都是造成食品安全問題的原因，因此加強食品安全檢測是解決食品安全的重要措施。傳統(tǒng)的食品檢測方法已不能滿足人們對食品安全的需求，因此，新的檢測技術(shù)應(yīng)運而生。現(xiàn)代食品檢測技術(shù)主要通過儀器分析、分子生物學(xué)等方式對食品進行科學(xué)檢測，能夠?qū)κ称分泻械挠泻ξ镔|(zhì)、微生物及食品轉(zhuǎn)基因等問題進行檢測，從而及時采取合理措施對問題食品進行處理，保障社會中食品使用的安全。

2現(xiàn)代檢測技術(shù)

2.1熒光定量PCR檢測技術(shù)

熒光定量PCR檢測技術(shù)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上運用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，把核酸擴增、雜交、檢測等技術(shù)結(jié)合在一起，在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱來即時測定特異性產(chǎn)物的量，據(jù)此計算待檢樣品中目的基因的拷貝數(shù)。熒光定量PCR標(biāo)記的方法由最初單一的染料法，發(fā)展到特異性更高的探針法。

熒光定量PCR技術(shù)自產(chǎn)生以來，經(jīng)過不斷的發(fā)展完善，已廣泛應(yīng)用于食品中致病微生物的檢測。李光偉等[1]采用沙門氏菌fimY基因序列，設(shè)計特異引物和探針，建立了檢測食品中沙門氏菌的熒光定量PCR檢測方法。胡建華等[2]根據(jù)GenBank公布的志賀氏菌ipaH基因的保守序列設(shè)計特異性引物，篩選合適的DNA 模板制備方法，以熒光定量PCR檢測方法與常規(guī)PCR檢測方法結(jié)合，檢測培養(yǎng)液和牛奶陽性樣品中的志賀菌目。

同時，熒光定量PCR技術(shù)是檢測轉(zhuǎn)基因食品最可靠、最快捷的方法，基于轉(zhuǎn)基因特異DN段的熒光定量PCR篩選方法已被一些國家作為相關(guān)食品法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。吳志毅等[3]采用普通PCR法和熒光定量PCR法對Bt63轉(zhuǎn)基因大米的檢測靈敏度進行對比研究。根據(jù)大米內(nèi)源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和結(jié)構(gòu)特異性基因Btc的基因序列，選用特異性的引物和探針進行研究，經(jīng)驗證試驗表明具有專一性，能用于品系鑒定。在靈敏度試驗中，陽性轉(zhuǎn)基因大米按照不同質(zhì)量百分比進行梯度稀釋，提取DNA進行PCR擴增。結(jié)果表明：普通PCR檢測的靈敏度在0.1%左右，而熒光定量PCR檢測的靈敏度為0.01%，是普通PCR檢測的10倍以上。

2.2核酸探針檢測技術(shù)

核酸探針檢測技術(shù)的原理是堿基配對、互補的兩條核酸單鏈通過退火形成雙鏈，這一過程稱為核酸雜交。核酸探針是指帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品定基因序列的檢測。每一種病原體都有獨特的核酸片段，通過分離和標(biāo)記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷及食品安全等研究，該技術(shù)具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點。

在食品檢測中，核酸探針檢測技術(shù)主要用于致病性病原菌的檢測。核酸探針可用于檢測任何特定的病原微生物，并能鑒別密切相關(guān)的毒株，因此可廣泛應(yīng)用于進出口動物性食品的檢驗，包括沙門氏菌、彎桿菌、輪狀病毒、狂犬病毒等多種病原體[4]。但核酸探針技術(shù)在實際應(yīng)用中仍存在一些問題，如放射性同位素標(biāo)記的核酸探針半衰期短，對人體有危害，操作技術(shù)復(fù)雜，使用費高等缺點，所以多作為實驗室診斷手段。

2.3酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

ELISA是一種把抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的檢測技術(shù)。基本原理是，使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。

ELISA已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測的各個領(lǐng)域。在致病微生物檢測方面姚斐等[5]用間接ELISA可快速有效檢測出活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的大腸桿菌O157：H7。此外，采用Dot-ELISA檢測沙門氏菌，耗時短，比傳統(tǒng)方法快4～6d，這都表明了ELISA可以快速的檢測出食品中的致病微生物。

在農(nóng)藥殘留檢測方面，余向陽等[6]以辣根過氧化物酶對兔抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥抗體進行標(biāo)記，建立了檢測蔬菜中多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的直接競爭抑制ELISA方法，用該方法對南京市場107個樣品檢測的陽性檢出率明顯高于氣相色譜法。賀亮[6]建立了直接競爭ELISA檢測磺胺二甲嘧啶殘留方法，該方法最小檢出量為1.97ng/mL，檢測范圍5～200ng/mL。現(xiàn)已開發(fā)的商業(yè)化酶聯(lián)免疫ELISA檢測試劑盒，可快速定性、定量檢測動物組織、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）藥物的殘留量。

ELISA已用于檢測食品中毒素。黃曲霉毒素是一種致癌性很強的真菌毒素，各國都嚴格限制其在食品中的含量，其中B1的毒性最強。蔣建云等[7]利用ELISA法的AFB1試劑盒，通過抗黃曲霉毒素B1抗體與酶標(biāo)抗原、待測抗原的競爭免疫反應(yīng)以及酶的催化顯色反應(yīng)相結(jié)合來檢測黃曲霉毒素B1的含量。該方法具有分析速度快，提取和純化步驟簡便，準(zhǔn)確度高、成本低、污染少，一次可測定大批量標(biāo)本等優(yōu)點。

2.4高效液相色譜～質(zhì)譜連用技術(shù)

HPLC-MS技術(shù)是將液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)成為一個整機使用的檢測技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在食品安全檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

HPLC-MS技術(shù)在食品安全方面的應(yīng)用主要集中在食品中農(nóng)藥、獸藥殘留和非法添加物的檢測。王鳳池[8]建立了通過固相萃取（SPE）-HPLC-MS/MS技術(shù)同時測定腸衣品中8種硝基咪哇類藥物殘留量的方法。樣品經(jīng)乙酸乙醋提取，經(jīng)SCX固相萃取柱凈化后，通過HPLC-MS/MS測定，8種分析物在0.1、0.5和1μg/kg 3個水平的回收率在87.3%～117%之間，重復(fù)性在3.35%～10.1%，8種分析物的檢出限為0.049～0.083μg/kg。黃芳等[9]建立了食品中三聚氰胺的高效液相色譜-質(zhì)譜測定方法，用Kromasil C18 柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為5%乙腈：95%水（含0.1%甲酸），采用正離子模式的電噴霧質(zhì)譜檢測，線性范圍為0.01～0.5mg/L，檢出限0.01mg/L，回收率為80%～99%。

2.5近紅外光譜技術(shù)

現(xiàn)代近紅外光譜技術(shù)是將光譜測量技術(shù)、計算機技術(shù)、化學(xué)計量學(xué)技術(shù)與基礎(chǔ)測試技術(shù)有機結(jié)合，以無損檢測為優(yōu)勢的分析技術(shù)。近紅外光是介于可見光和中紅外光之間的電磁波，近紅外光譜區(qū)與被測物質(zhì)中O-H、N-H、C-H 及S-H 等含氫基團的分子內(nèi)部原子間振動的倍頻和合頻的吸收區(qū)一致，通過掃描樣品的近紅外光譜，能得到其中有機分子含氫基團的特征信息[10]。不同物質(zhì)在近紅外光譜區(qū)因成分不同而存在特定的吸收特征，這為近紅外光譜定量或定性分析物質(zhì)提供了理論依據(jù)。

近紅外光譜技術(shù)具有無損性、前處理操作簡便、檢測成本低、反應(yīng)迅速等特點使其在食品安全檢測中的應(yīng)用日益廣泛。Kawasaki等[11]構(gòu)建了基于近紅外光譜技術(shù)的牛奶品質(zhì)檢測模型，該模型可較好地檢測牛奶的各項理化指標(biāo)，評價牛奶的品質(zhì)。屠振華等[12]運用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合模式識別法對蜂蜜摻假進行了識別分析，分別采用偏最小二乘判別分析、獨立軟模式法等方法進行蜂蜜摻假識別模型的建立和樣品檢測，結(jié)果表明該方法的正確判別率達100%。Liu等[13]采用表面增強拉曼光譜建立了蘋果和番茄表面西維因、亞胺硫磷、谷硫磷殘留的檢測方法，采用偏最小二乘法和主成分分析法建立這3種農(nóng)藥的定性和定量模型對光譜數(shù)據(jù)進行校正處理，處理后西維因、亞胺硫磷和谷硫磷這3種農(nóng)藥在蘋果上的檢出限分別為4.51、6.51、6.66mg/mL，在番茄上的檢測限分別可達5.35、2.91、2.94mg/mL，方法回收率可達78%～124%，所建立的方法可以有效檢測水果和蔬菜中的農(nóng)藥殘留。

3結(jié)語

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活水平的提高，食品安全越來越受到大家的關(guān)注。食品安全關(guān)乎國計民生，政府機構(gòu)應(yīng)制定切實可行的食品安全政策法規(guī)，建立健全市場監(jiān)管機制，加強消費者的食品安全意識。同時，必須大力發(fā)展食品安全檢測技術(shù)，完善檢測體系，為食品的安全和品質(zhì)監(jiān)管作出更大的貢獻。

參考文獻：

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[11] Kawasaki M，Kawamura S，Tsukahara M，et a1.Near-infrared spectroscopic sensing system for on-line milk quality assessment in a milking robot [J].Computers and Electronics in Agriculture，2008，63（1）：22～27

篇6

關(guān)鍵詞：氣相色譜法 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 定性 物質(zhì)成分 添加劑

中圖分類號：TS207 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）02-0031-01

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們?yōu)榱嗽鰪姺治龅撵`敏性，把氣相色譜法和高靈敏選擇性檢測器結(jié)合了起來。氣相色譜法剛開始應(yīng)用是在20世紀五、六十年代，并且迅速在工農(nóng)業(yè)等行業(yè)里變得流行，它是一種把氣體當(dāng)作流動相的色譜法。氣相色譜法的原理是如果把樣品置于固定相和流動相中間，由于氣體擴散速度比較快，便能夠快速到達平衡狀態(tài)，所以在當(dāng)時可以算作是一種高新的分離分析技術(shù)。而后來出現(xiàn)的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則是為了彌補氣相色譜法定性能力不強的缺陷，既囊括了它的優(yōu)勢，又很好地解決了它僅能依靠組分的保留特性來對樣品進行定性的不方便問題，現(xiàn)在氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)正以其快分析速度、高靈敏度和高分離效率的良好特點被廣泛應(yīng)用在食品和藥品等領(lǐng)域中。

1 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分析特點

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時具有氣相色譜法的高效率和質(zhì)譜法的極強定性能力的優(yōu)點，克服了單一的氣相色譜和質(zhì)譜的缺陷，主要優(yōu)勢為：第一，既避免了樣品制備和樣品轉(zhuǎn)移等繁瑣過程，又滿足了質(zhì)譜分析的單一性樣品要求；第二，能夠兼具質(zhì)量、強度三維、保留時間等信息；第三，借助計算機，可以使操作更加簡單方便，實現(xiàn)高效的分析自動化。

2 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用在食品檢驗中的應(yīng)用

2.1 對物質(zhì)成分進行準(zhǔn)確分析

近幾年來，食品安全問題一直備受關(guān)注，而利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用可以準(zhǔn)確分析物質(zhì)成分，比如說，使用固相微萃取技術(shù)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析啤酒的成分，可以分析出的主要化合物有四十二種，用這種方法來檢測淡水魚肉氣味，醇類和羥基化合物等主要成分能夠被分析檢測出來，分析出的揮發(fā)性成分分別在鯽魚肉中有四十二種，草魚肉中有三十種，鰱魚肉中有四十種。由此可見，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用在食品檢驗中的成分分析方面可以有很廣泛的應(yīng)用。

2.2 在食品農(nóng)藥殘留檢驗中有著重要作用

近年來，菜農(nóng)都加大了對蔬菜噴施的農(nóng)藥劑量和次數(shù)，導(dǎo)致蔬菜中殘留的農(nóng)藥成分相當(dāng)復(fù)雜，由于現(xiàn)在農(nóng)藥殘留而導(dǎo)致的中毒事件頻發(fā)，食品安全的問題更加得到了人們的關(guān)注。傳統(tǒng)上是用氣相色譜的檢測器對農(nóng)藥殘留進行檢測，但是農(nóng)藥極性差別很大，不能利用單一色譜進行檢測，所以這種傳統(tǒng)的方法并不能全面地對所有品種的殘留農(nóng)藥進行檢測。利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的離子檢測方式回收率在百分之八十到一百二十之間，能夠定性、定量地對農(nóng)產(chǎn)品中的除蟲菊酯、氨基甲酸酯等殘留農(nóng)藥進行檢測，例如許國旺結(jié)合時間編程選擇離子檢驗?zāi)Ｊ剑柚鷼庀嗌V質(zhì)譜聯(lián)用方法，有效地檢測出了果蔬中的多種除蟲菊酯，這種技術(shù)操作簡單、實用性強、檢出限低、回收率高，由于不需要對提取液進行嚴格凈化，可以進行定性和定量分析，所以能使檢測速度大幅度提升。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在果蔬農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)用十分廣泛，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法能夠定量、定性地分析蘋果中的農(nóng)藥殘留，可以分析檢測出蘋果中的氨基甲酸酯、有機氯、有機磷等五十多種農(nóng)藥成分，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。此外，啤酒的有機磷農(nóng)藥檢測利用了固相萃取技術(shù)可以使回收率高達百分之八十以上，測量結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)值偏差小于百分之八。

2.3 在獸藥殘留中的應(yīng)用

養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖牲畜的時候通常要給動物喂養(yǎng)一些藥物，這些藥物可以幫助控制畜禽的疾病或者對某種疾病起到預(yù)防作用，另外還可以促進動物成長，而這些藥物在肉食產(chǎn)品中難免會有少量的殘留，這時對肉、禽、蛋、奶的藥物殘留檢測就可以用到氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

2.4 在食品添加劑中的應(yīng)用

為了使食品色、香、味等品質(zhì)得到改善，常常在食品加工過程中加入一些天然的或經(jīng)化學(xué)合成的添加劑，這些食品添加劑不僅可以增加食物的營養(yǎng)成分，還能夠使視頻的保質(zhì)期盡量延長，我國的食品添加劑種類眾多，像香料、著色劑、抗氧化劑、營養(yǎng)強化劑、防腐劑等加起來一共有兩千個的品種。

郭嵐等曾經(jīng)用酒精來提取食用油中的丁基羥基茴香醚（即BHA）和叔丁基對苯二酚（即TBHQ） 等，并且運用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離測定這幾種抗氧化劑，結(jié)果令人滿意。這種方法的平均回收率高達百分之八十以上，以其無毒、準(zhǔn)確、簡捷的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用在調(diào)和油、花生油和大豆油等食用油的抗氧化劑測定中。郭新東等人對測定辣椒油中蘇丹紅1和蘇丹紅2的分析方法進行了研究，采用了固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用，周敏等也采用改進的前處理方法，用氣相色譜一氣質(zhì)聯(lián)用儀快速對面粉中過氧化苯甲酞進行定性定量分析，此種方法操作很簡單，靈敏度高，穩(wěn)定性也很好。后來，胡強等人又建立了一種對不同食品中低含量甜蜜素的快速氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法，成功地對含脂肪等液、固體試樣、含蛋白等不同樣品除去雜質(zhì)，用超聲波提取、衍生，最后利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行定量、定性測試。

3 結(jié)語

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和食品檢測的高準(zhǔn)確性和迅速性的需求，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用也借著計算機技術(shù)的進步而達到了十分廣泛的應(yīng)用，且應(yīng)用范圍越來越寬，比如酒香氣成分檢測、品質(zhì)檢測等都可以用到這種方法。綜上所述，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用在食品檢驗中的應(yīng)用則主要表現(xiàn)在對物質(zhì)成分、對農(nóng)藥殘留、對獸藥殘留和食品添加劑的精準(zhǔn)的定性和定量檢測中，以后氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)必將在食品檢驗中發(fā)揮更重要的作用。

參考文獻

[1]劉艷霞，駱傳環(huán).色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在新藥研究中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器，2014（5）：6-8.

篇7

關(guān)鍵詞 微型輝光放電等離子體； 質(zhì)譜； 掃描； 成像

1 引 言

質(zhì)譜成像是一種分子成像技術(shù)，但是它不同于需要熒光標(biāo)記的激光共振聚焦、放射自顯影、免疫沉淀等方法，這種方法無需額外標(biāo)記或分子印染過程就能獲得獨特、精確的圖像，它使成像不局限于某些特異分子，而是面向大多數(shù)分子。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，質(zhì)譜成像已成為法醫(yī)、食品分析、地質(zhì)檢測[1～4]等相關(guān)領(lǐng)域的重要分析手段，近年來，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物組織及臨床研究[5～7]，并取得了較好的成果。質(zhì)譜成像是將樣品的空間信息與其化學(xué)信息一一對應(yīng)，可以對樣品x，y二維或x，y，z三維方向順次掃描，由此獲得對應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后用不同的顏色代表不同組分的空間分布，并通過相關(guān)的軟件按其空間位置做出質(zhì)譜影像圖。

目前，用于質(zhì)譜成像的技術(shù)根據(jù)其工作條件和解吸機制的不同，主要分為以下幾類：（1）在真空條件下的基質(zhì)輔助激光解吸電離（Matrix assisted laser desorption ionization， MALDI）質(zhì)譜成像技術(shù)[8]、二次離子質(zhì)譜（Secondary ion mass spectrometry， SIMS）[9]等技術(shù)；（2）常壓下基于噴霧的電離技術(shù)， 如解吸電噴霧電離（Desorption electrospray ionization， DESI）[10]、探針電噴霧電離（Probe electrospray ionization， PESI） ＼[11] 等技術(shù)；（3）基于激光電離技術(shù)，如激光燒蝕電噴霧離子化（Laser ablation electrospray ionization， LAESI）[12]、紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)離子化 （Infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IR-LAMICI） ＼[13]等技術(shù)；（4）基于等離子體的電離技術(shù)，如低溫等離子體探針（Low temperature probe， LTP）技術(shù)[14]、解吸大氣壓化學(xué)電離（Desorption atmospheric pressure chemical ionization， DAPCI）[15]等。近年來，隨著醫(yī)學(xué)診斷、地質(zhì)檢測等相關(guān)領(lǐng)域的需要，質(zhì)譜成像技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注，尤其是常壓開源質(zhì)譜成像，該技術(shù)主要用于分析分子量低于2000 Da的分子，空間分辨率通常為幾十到幾百微米[16～18]。基于等離子體的離子化技術(shù)由于其本身的限制，用于質(zhì)譜成像的還較少。由于本實驗室研發(fā)的微型輝光放電等離子體離子源（MFGDP）[19]具有無污染、高靈敏度、特異性強、高通量等優(yōu)點，同時又是尺寸小、低溫的等離子體，因而在質(zhì)譜成像方面具有巨大的潛能，基于此，本實驗對MFGDP作為離子源用于成像分析作了初步的探索研究，通過對加有尿素的鋼筆墨跡以及冬棗切片的掃描，得到了字跡的具體輪廓和切片中不同營養(yǎng)物質(zhì)硬脂酸和槲皮素衍生物的質(zhì)譜影像圖，并取得了較好的結(jié)果，因而為字畫研究、藝術(shù)品鑒定、營養(yǎng)物質(zhì)分布圖的獲取提供了一種新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

LCQ-Fleet型離子阱質(zhì)譜儀（Thermo Fisher， San Jose， CA），配置Xcalibur （Version 1.4RS1）工作站；載物臺、2維電控位移臺及步進電機控制器（北京卓立漢光儀器有限公司）；直流穩(wěn)壓電源（揚州雙鴻電子有限公司）；質(zhì)量流量控制器（北京七星電子有限公司）；MFGDP離子源（實驗室自主研發(fā)）。

碳素鋼筆墨水與冬棗均從當(dāng)?shù)厣痰曩彽茫环治黾兊哪蛩刭徸杂谏虾Ｉす荆黄胀鍤猓?9.9%）由僑源氣體公司提供。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備 配含有70 μg/mL尿素的碳素鋼筆墨水溶液，將鋼筆字跡“3”寫于陶瓷片，字跡的掃描面積為14 mm×12 mm；用刀片切下約0.5 mm厚的帶果皮的冬棗切片，并將切片置于干凈的載玻片上直接進行成像分析。

2.2.2 MFGDP的參數(shù)及工作條件 MFGDP離子源本體結(jié)構(gòu)參數(shù)見原報道[19，20]。工作條件：維持MFGDP離子源的穩(wěn)定放電電壓為1520 V，電流11 mA，氬氣流速0.8 L/min；等離子氣出口端距電動平移臺上的樣品約6 mm；離子源與質(zhì)譜儀進樣口距離為約1 cm；樣品與質(zhì)譜儀進樣口平齊；MFGDP-MSI的實際工作情況如圖1所示；電動位移臺的移動速度、移動順序均由步進電機控制。

2.2.3 質(zhì)譜條件 MFGDP直接與一臺去掉廠方配置離子源的LCQ-Fleet型離子阱質(zhì)譜儀聯(lián)用，進行質(zhì)譜分析檢測。 在正、負離子模式下均關(guān)閉質(zhì)譜儀的自動增益（ACG）。 質(zhì)譜儀參數(shù)如下：毛細管溫度200℃； 毛細管電壓9.5 V； Tube lens 29 V； Multipole RF DAC 320 V； 最大離子注射時間50 ms； 微掃描次數(shù)（Microscan）3； 其余參數(shù)均為質(zhì)譜儀的自動調(diào)諧值。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析時將質(zhì)譜儀得到的原始raw文件先用imzML Converter軟件轉(zhuǎn)化為imzML文件，再通過Datacube Explorer獲得最終的質(zhì)譜影像圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜成像的可行性評估

為了驗證MFGDP離子源用于質(zhì)譜成像的實用性，本實驗對含有70 μg/mL尿素的鋼筆墨跡進行了一系列對比分析。對鋼筆寫下的“3”字進行質(zhì)譜成像分析，圖像的掃描面積為14 mm×12 mm，單個像素點的尺寸為144 μm×150 μm，以尿素的質(zhì)子化分子離子峰m/z 61作為檢測對象，對應(yīng)的質(zhì)譜圖、質(zhì)譜成像圖和實際樣品圖如圖2所示。

結(jié)果表明，質(zhì)譜成像圖中尿素的二維離子分布輪廓圖與實際圖中分布基本一致，但在質(zhì)譜圖能觀察到較為明顯的明暗條紋，這可能是由于采用較小的行距引起，其影響因素還需進一步考察并驗證。實驗可以表明MFGDP離子源用于質(zhì)譜成像具有實用性，能夠提供目標(biāo)分子在樣品中的分布信息及其相對豐度。

3.2 MFGDP-MSI的條件優(yōu)化

與其它的等離子體常壓解吸源測試樣品一樣，用MFGDP離子源直接掃描樣品時儀器工作參數(shù)的設(shè)定會直接影響質(zhì)譜信號的強弱，進而影響成像的質(zhì)量。為了優(yōu)化實驗參數(shù)，繼續(xù)對含有70 μg/mL尿素的鋼筆字跡進行對比分析，在MFGDP離子源本身結(jié)構(gòu)參數(shù)確定的條件下，MFGDP離子源工作電流、工作氣的流速、樣品與等離子體羽尾端之間的距離、樣品與質(zhì)譜儀入口之間的距離、等離子體羽的長短、電動位移臺的移動速率、縱向間隔都會影響MFGDP-MSI的分辨率。本實驗中MFGDP離子源工作電流、工作氣的流速、樣品與等離子體羽之間的距離、樣品與質(zhì)譜儀入口之間的距離、等離子體羽的長短都采用了MFGDP離子源做質(zhì)譜分析時的最優(yōu)條件[19]，通過對影響質(zhì)譜信號的其它參數(shù)的優(yōu)化，選擇了最優(yōu)體系，結(jié)果表明，電動位移臺的移動速率、縱向間隔對圖案的輪廓清晰度以及縱向分辨率的影響最大。通過初步研究探索，確定電動位移臺的最佳水平移動速率為0.3 mm/s，縱向間隔dy為0.4 mm。由最佳條件下鋼筆墨跡“A”的影像圖（圖3）可見，影像圖與實際圖的輪廓一致，且清晰度較高。

3.3 實際樣品分析

以冬棗切片為分析對象，研究不同營養(yǎng)物質(zhì)硬脂酸和槲皮素在棗內(nèi)的分布情況。用刀片切下厚約0.5 mm的帶果皮的冬棗切片，并置于干凈的載玻片上直接掃描，掃描面積12 mm×11.2 mm，在最佳條件下，掃描總時間不超過20 min。圖4為冬棗切片的實際樣品圖、以硬脂酸和槲皮素為目標(biāo)離子的質(zhì)譜成像圖。從圖4可見，整個冬棗切片中都含有硬脂酸，但主要分布于果肉中，而槲皮素主要以其衍生物的形式多存在于果皮中。

3.4 實驗結(jié)果討論

從“A”字的成像圖中可以看出，成像圖雖與實際圖較符合，但還是存在明顯的拖尾現(xiàn)象，其主要是受等離子體羽本身的形狀、尺寸大小的限制，也可能與質(zhì)譜儀的記憶效應(yīng)有關(guān)。在冬棗的成像圖中，觀察到有明顯黑白相間的寬條紋，主要因為MFGDP產(chǎn)生的等離子羽在x軸方向為薄片而在y軸方向相對較厚。初步實驗證明，MFGDP質(zhì)譜成像在不需要對分析物標(biāo)記，也不需要對分析樣品復(fù)雜預(yù)處理的前提下，不僅能提供樣品中目標(biāo)物質(zhì)的空間分布，還能提供其分子的結(jié)構(gòu)信息；更重要的是，因其整個掃描過程具有耗時短、操作簡易、等離子體羽低溫等特點，使其有望成為生物化學(xué)、藥物定位、刑偵鑒定等領(lǐng)域的有力工具。目前其空間分辨率還不是很理想，本實驗中分辨率大約為300 μm，主要受到了MFGDP離子源本身的制約，還需進一步調(diào)整MFGDP離子源的結(jié)構(gòu)，現(xiàn)階段我們正在改進放電通道的結(jié)構(gòu)， 以得到尺寸更小的等離子體羽。

4 結(jié) 論

利用新型MFGDP離子源與常規(guī)離子阱質(zhì)譜儀聯(lián)用實現(xiàn)了對不同樣品的成像分析， 此方法無需復(fù)雜的預(yù)處理，具有無污染、耗時短、特異性強等優(yōu)點，比較適合定位小分子物質(zhì)在組織樣品中的分布。經(jīng)初步探索研究，雖取得較好的結(jié)果，但目前其空間分辨率、靈敏度還有待進一步提高，還需進一步調(diào)整MFGDP離子源本身的參數(shù)，通過改進MFGDP的結(jié)構(gòu)和設(shè)計可以獲得更微型化的等離子羽，從而進一步提高成像的分辨率。

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黃艷鳳， 康 妍， 王永嬋， 張 平. 保鮮與加工， 2008， 8（6）： 22-24

篇8

關(guān)鍵詞電感耦合等離子體質(zhì)譜；激光剝蝕；元素成像；單細胞分析；鼠腦切片；金納米顆粒

1引言

生物體內(nèi)的微量元素具有十分重要的生物功能，參與多種生物化學(xué)過程[1＼]，如金屬離子常作為蛋白質(zhì)的活性中心，催化和調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)[2＼]。微量元素還與一些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3＼]。研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病（Alzheimer′sdisease，AD）患者大腦的沉積斑中有高濃度的銅、鋅、鐵離子[4＼]；金屬離子在腦組織微區(qū)內(nèi)的代謝紊亂、氧化應(yīng)激與AD的形成和損傷關(guān)系密切[5＼]。因此，生物樣品中微量元素的分析和檢測，特別是元素的原位微區(qū)分析，無論對于研究微量元素在生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)、功能和生物效應(yīng)，還是對于闡明與微量元素相關(guān)疾病的發(fā)病機理，尋找這些疾病的預(yù)防和治療策略，都具有重要的意義。

生物體內(nèi)微量元素的分析主要使用原子吸收、原子發(fā)射、原子熒光、無機質(zhì)譜等原子光譜/質(zhì)譜儀器完成。常規(guī)方法大都需要使用強酸消化樣品，前處理過程冗長而繁瑣，一般只能得到元素總量的信息，而無法得到元素在生物樣品中的分布信息。如果采用具有空間分辨能力的原位分析方法，如二次離子質(zhì)譜[6＼]、激光電離飛行時間質(zhì)譜[7＼]、同步輻射X射線熒光[8＼]、激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜（Laserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry，LAICPMS）[9＼]等方法，可以實現(xiàn)生物樣品中元素的原位、微區(qū)分析，得到元素成像圖。

在上述原位元素分析方法中，LAICPMS由于具有空間分辨率好（約5μm）、分析檢出限低（10

4g/L級）、儀器商品化程度高、運行成本較低等優(yōu)點，逐漸成為應(yīng)用最廣泛的元素成像方法[10，11＼]。楊紅霞等[12＼]利用LAICPMS原位分析了印度芥菜中的7種元素，得到了植物莖中的元素分布圖；馮流星等[13＼]將同位素稀釋法應(yīng)用于LAICPMS的定量分析，建立了生物切片中Fe元素的原位定量分析方法。本實驗詳細描述LAICPMS元素成像的步驟和方法，并將建立的方法應(yīng)用于鼠腦切片和單個細胞的元素成像分析。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

NWR213Nd：YAG激光剝蝕系統(tǒng)（美國NewWave公司）；四極桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（NexION300DICPMS，美國PerkinElmer公司）；冷凍切片機（德國LEICA1900）；NuncLabTekII腔室載玻片（美國賽默飛世爾科技有限公司）

本實驗所用小鼠（C57BL/6J）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所；高純Ar氣和He氣購自北京普萊克斯公司；LAICPMS調(diào)諧用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（SRM612），30nm金納米顆粒（RM8012）購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）；細胞培養(yǎng)基、小牛血清、PBS、胰酶、青霉素、鏈霉素均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

2.2樣品前處理

3月齡正常小鼠麻醉后，用生理鹽水快速灌注15min，再斷頭取腦組織。將腦組織快速冷凍，制成30μm厚的冠狀切片，置于干燥器中備用。

小鼠巨噬胞（RAW264.7）用含有10%小牛血清（FBS）、100μg/mL鏈霉素、100units/mL青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)。NIST金納米顆粒超聲處理后，用純水稀釋至合適的濃度，加入細胞培養(yǎng)液。細胞暴露于0.1mmol/L金納米顆粒4h后，JP吸出細胞培養(yǎng)液，用PBS反復(fù)清洗后，將細胞轉(zhuǎn)移至腔室載玻片，待細胞貼壁后，除去腔室間的隔斷，將載玻片置于干燥器中備用。

2.3LAICPMS實驗

激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠由He氣載帶出樣品ZH（池，通過三通與Ar氣混合后進入ICPMS分析。ICPMS用NIST612調(diào)諧，使U、Th信號最強且得到較低的氧化物產(chǎn)率（UO+/U+）。LAICPMS所用的儀器參數(shù)見表1。

LA采用線剝蝕模式，激光剝蝕時自動觸發(fā)ICPMS以時間分辨模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel處理，用IgorPro.（美國WaveMetrics公司）軟件畫出元素成像圖。

3結(jié)果與討論

激光燒蝕系統(tǒng)可以作為ICPMS的固體進樣裝置，工作時激光束先剝蝕樣品表面，產(chǎn)生的固體氣溶膠被載氣運送至等離子體而完成電離，然后在質(zhì)譜中得到檢測。LAICPMS的準(zhǔn)確分析需要盡可能地滿足下面3個條件：（1）激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠與固體樣品的組成相同；（2）氣溶膠可以高效率地傳輸至質(zhì)譜；（3）進入質(zhì)譜的氣溶膠可以完全電離[14＼]。在實際分析過程中，上CM（203/5述條件常常很難完全滿足，這樣會導(dǎo)致“元素分CM）ZH）餾”（不同元素在LAICPMS分析過程中的行為差異）的產(chǎn)生。為了校正激光能量、樣品厚度、漂移對質(zhì)譜響應(yīng)的影響，LAICPMS元素成像分析時，需要選用適合內(nèi)標(biāo)元素。還要使用基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)，以獲取準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果。研究表明，相比過去常用波長的激光器（如266nm），使用213nm波長的NdKG-3∶KG-5YAG激光剝蝕得到的樣品更為均勻，元素分餾效應(yīng)更小[15＼]。使用氦氣作為載氣，可以有效地提高氣溶膠的傳輸效率，從而提高分析的靈敏度[16＼]。因此，在本實驗中，使用波長為213nm的激光，采用He氣作為載氣，并采用13C的信號作為內(nèi)標(biāo)校正元素。

3.1剝蝕模式的選擇

元素成像可采用點剝蝕模式（Spotablation）或線剝蝕模式（Lineablation）完成（圖1）。在點剝蝕模式中，激光在樣品表面每隔一定距離取一點剝蝕樣品，重復(fù)操作直到激光采樣的點陣覆蓋整個樣品。在此模式下，采集的數(shù)據(jù)真實反映每個采樣點上的元素信息，激光光斑越小，采樣點越多，得到的元素成像圖的分辨率越高。而在線剝蝕模式中，在樣品表面每隔一定距離設(shè)置一條剝蝕線段，重復(fù)設(shè)置剝蝕線段，直到激光采樣的線段覆蓋整個樣品。工作時激光沿直線連續(xù)剝蝕樣品，此時，元素成像圖的分辨率取決于激光光斑、剝蝕頻率、線掃描速率，以及剝蝕線間的距離等條件。

LAICPMS分析時，如果采用點剝蝕模式，在兩個剝蝕點之間需要耗費較多的時間等待質(zhì)譜信號回到本底水平，才能進行下一點的分析。這樣減少了有效質(zhì)譜分析時間的比例，增加了元素成像分析所需要的時間。所以在本實驗中，采用線剝蝕模式，并使用兩種剝蝕參數(shù)分別應(yīng)用于鼠腦切片和細胞樣品（見表1）。需要注意的是，由于剝蝕參數(shù)的選擇，最終得到的元素成像圖在激光掃描的方向常會拉長變形，一般需要在最后處理過程中恢復(fù)原始比例。

3.2激光能量的選擇

與地質(zhì)樣品不同，生物樣品的含水量較高，因此在剝蝕時，必須有效地控制剝蝕條件，既要實現(xiàn)完全剝蝕樣品，又要避免用過高的能量剝蝕而使樣品中的水大量汽化，造成樣品不規(guī)則撕裂和嚴重的元素分餾。此外，在分析生物樣品時，選擇較低能量密度（

3.3鼠腦和細胞的元素成像圖

元素C作為生物樣品的內(nèi)標(biāo)校正元素，F(xiàn)e，Cu，Zn是生物體中重要的必需微量元素，具有多種生物功能。所以，本研究選擇分析以上元素。LAICPMS分析得到的鼠腦元素成像見圖3。從圖3可以清楚地分辨小鼠腦的不同區(qū)域，并可以看出Fe，Cu，Zn等重要微量元素在各個腦區(qū)中的分布情況。由于Fe元素在ICPMS中受到ArO+等多原子離子的嚴重干擾，所以得到的Fe元素成像圖不如其它元素成像圖清晰。JP文獻＼[18＼]報道，采用碰撞反應(yīng)池技術(shù)可以消除測量時的質(zhì)譜干擾，得到更加清晰的Fe元素成像圖。由于缺乏可用于LAICPMS定量分析的生物標(biāo)準(zhǔn)參考物，定量元素成像分析相對困難。國外實驗室常自制基體匹配的生物切片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用外標(biāo)校正的辦法，實現(xiàn)生物樣品的定量元素成像[10＼]。

如果LAICPMS技術(shù)與免疫組織化學(xué)方法相結(jié)合，使用元素標(biāo)記的抗體與切片上的待測抗原反應(yīng)，通過分析標(biāo)記的元素，可以得到切片上蛋白質(zhì)（抗原）的分布信息，進一步拓展LAICPMS在生物成像分析的應(yīng)用范圍。Seuma等[19＼]成功得到了兩種癌癥生物標(biāo)志物在組織上的成像。利用類似的方法，Wang等[20＼]同時得到了Fe，Cu，Zn等金屬元素和β淀粉樣蛋白在老年癡呆模型鼠腦切片中的元素和分子成像圖。

圖4是暴露金納米顆粒后的單細胞光學(xué)成像和元素成像圖。在本實驗條件下，除了Mg元素外，不能得到其它天然微量元素的清晰成像。@主要是由于細胞中的這些元素含量較低，或者是由于分析這些元素時存在較為嚴重干擾。從圖4可見，Mg和Au元素濃度較高的位置與光學(xué)顯微鏡中細胞所在位置重合，而在沒有細胞的位置，Mg和Au元素濃度很低。因此可以確定，Mg和Au的元素信號分別來自于細胞本身和進入細胞的金納米顆粒。

為了準(zhǔn)確得到單個細胞中的元素含量，需要發(fā)展合適的定量標(biāo)準(zhǔn)和校正方法。Wang等使用微噴系統(tǒng)制備了與細胞大小和含碳量相似的標(biāo)準(zhǔn)液滴，作為基體匹配的單細胞定量標(biāo)準(zhǔn)，成功實現(xiàn)LAICPMS定量分析單細胞中的金屬納米顆粒[21＼]。此外，現(xiàn)有的激光器最小光斑約為5μm，如果希望用LAICPMS技術(shù)得到單個細胞中的元素成像圖，則需要進一步提高空間分辨率。Becker等提出的近場剝蝕技術(shù)，將LAICPMS空間分辨率提高到亞微米級，有望真正實現(xiàn)單個細胞成像分析[22＼]。

4結(jié)論

本研究建立了LAICPMS元素成像方法，得到了鼠腦切片、單細胞等不同水平生物樣品的元素成像圖。LAICPMS由于具有空間分辨率高、檢出限低、運行成本較低等優(yōu)勢，有望作為其它生物成像技術(shù)的有力補充，在生物醫(yī)學(xué)研究中得到更廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮更重要的作用。

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AbstractTraceelementsplayaveryimportantroleinbiologicalorganismandcloselyrelatedtomanydiseases.Thenewanalyticalmethodsareurgentlyneededforinsitudeterminationoftraceelementsinbiologicaltissuesorsinglecells.Amethodbasedonlaserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry（LAICPMS）wasdevelopedforsuchinsituanalysis.Lineablationmodewaschosenandtheoutputenergyofthelaserwasalsooptimizedatalowfluenceoflessthan1J/cm2.Thetwokindsofelementalbioimagingofbothacoronalsectionfrommousebrainandsinglecellsexposedtogoldnanoparticleswereobtainedbythedevelopedmethod.Becauseoftheuniquecharacteristics，suchasgoodspatialresolution，excellentdetectionlimit，andreasonablerunningcost，LAICPMSwillbeappliedwidelyandbecomeausefultoolinbiomedicalresearchinthefuture.

KeywordsInductivelycoupledplasmamassspectrometry；Laserablation；Elementalbioimaging；Singlecellanalysis；Mousebrainsections；Goldnanoparticles

篇9

關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)；血清前處理方法；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1引言

代謝組學(xué)是對生物系統(tǒng)的細胞在給定時間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)進行定性定量分析，從而定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體對內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律的科學(xué)。大鼠血清作為代謝組學(xué)研究中的重要體液樣本，在采用常用的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GM）對其進行分析之前，需要進行除蛋白質(zhì)和衍生化等前處理步驟。除蛋白質(zhì)是希望通過有機溶劑沉淀去除血清中所含的大量蛋白質(zhì)成分；衍生化是將血清中極性較強、揮發(fā)性較低的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性和揮發(fā)性較高的物質(zhì)。目前常用的除蛋白試劑有甲醇、甲醇乙醇等。衍生化通用的是兩步法（肟化和硅烷化），而兩步法中最常用的衍生化試劑有A（NOistrimethylsilyltrifluoroacetamide）、MA（NmethylNtrimethylsilyltrifluoroacetamide）。這些方法、試劑在血清代謝組GM分析中得以廣泛應(yīng)用，但目前還沒有文獻對它們給血清代謝物產(chǎn)生的影響進行過比較分析，本研究采用GM技術(shù)，對比分析了血清樣品前處理中常用的有機溶劑沉淀蛋白、兩步衍生化步驟中不同試劑對最終所能測到代謝組的影響，結(jié)果可望為血清代謝組學(xué)GM分析前處理方法的選擇提供依據(jù)。

2實驗部分

篇10

關(guān)鍵詞 粉葛； 高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜； 同分異構(gòu)體； 源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離

1 引 言

粉葛（Radix puerariae thomsonii）為豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根, 味甘, 辛、涼,有解肌退熱、透疹、生津止渴、通經(jīng)活絡(luò)之功效 \。粉葛自古與野葛同作葛根用。研究發(fā)現(xiàn), 粉葛與葛根（野葛）HPLC指紋圖譜\及臨床應(yīng)用\存在較大差別, 2005版中國藥典首次將粉葛與葛根（野葛）分列作為中藥材記載。粉葛中主要成分為異黃酮類化合物, 大部分以苷的形式存在, 主要包括：葛根素、3′羥基葛根素、大豆苷等\, 其主要結(jié)構(gòu)見表1。該類化合物中存在多對同分異構(gòu)體, 主要分為碳苷和氧苷兩類化合物。同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相似, 極性相近, 分離難度大。分離和鑒別中藥中同分異構(gòu)體化合物, 一直是藥物分析的難題。

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCESIMS）技術(shù)結(jié)合了色譜與質(zhì)譜的優(yōu)點, 可有效分析復(fù)雜混合物中的單個和多個組分\。文獻\采用高效液相色譜（二極管陣列）/電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（HPLCESIMS）方法分析葛根中異黃酮類化合物。但對粉葛中化合物質(zhì)譜分析尚未見報道。本研究采用HPLCPDAESIMSn技術(shù)鑒別分析了粉葛中C苷和O苷兩類化合物, 建立區(qū)分粉葛中異黃酮類化合物同分異構(gòu)體的電噴霧質(zhì)譜方法。表1 粉葛中主要異黃酮類化合物

譜配有電噴霧離子源（ESI）；高效液相色譜儀系統(tǒng)（Surveyor HPLC）包括 Surveyor PDA Plus檢測器、Surveyor AutoSample Plus自動進樣器、Surveyor MS Pump四元泵； Xcalibur 2.0化學(xué)工作站軟件； Mass Frontier 6.0軟件。

粉葛藥材購于合肥市當(dāng)?shù)厮幍? 經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室王德群教授鑒定為豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根；葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所, 批號 0752200509）; 乙腈、甲酸（色譜純, 美國Merck公司）, 實驗用水為亞沸蒸餾水。

2.2 樣品處理