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[關鍵詞]烏芪舒筋通絡片；微生物限度；方法學研究；《中國藥典》2015年版

[中圖分類號] R286 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（c）-0093-04

[Abstract]Objective To establish a microbial limit test method of Wuqi Shujin Tongluo tablets.Methods Methodology research on microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets was conducted according to the "1105，1106，1107" of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition with the fourth part.Results The total number of aerobic bacteria could be tested by plate dilution method and membrane filtration method，the total number of fungus and yeasts could be tested by the plate routine method，and the recovery was between 0.5 and 2，Escherichia coli，Salmonella，Bile salt resistant Gram-negative bacteria could be detected through control bacteria by direct inoculation method.Conclusion The total number of aerobic bacteria can be tested by plate dilution method，the total number of fungus and yeasts can be tested by plate routine method，and the control bacteria can be tested by direct inoculation method，the methods used are feasible，and easier to operate，which are suitable for the microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets.

[Key words]Wuqi Shujin Tongluo Tablets；Microbial limit；Methodology research；Chinese Pharmacopoeia 2015 edition

躑問鍆絡片是根據我院省名中醫驗方制成的純中藥制劑，具有補肝腎，通絡止痛的作用，由細辛、制川烏、制草烏、桂枝、牛大力、防己、黑老虎、蜈蚣、走馬胎、羚羊角骨、牛膝、黃芪、杜仲、續斷、甘草等藥味組成[1]。該制劑微生物限度檢查法原按《中國藥典》2010年版進行方法學驗證[2]，隨著《中國藥典》2015年版的實施，新版微生物限度檢查方法變化很大，必須重新進行驗證。為此，本研究按《中國藥典》2015 年版四部“1105、1106、1107”項下方法[3]，對該制劑的微生物限度檢查方法進行了再次驗證研究，制訂了新的切實可行的微生物限度檢查法，替代了舊標準，并應用于該制劑的日常檢驗，使該制劑的微生物限度檢查法提升到新版《中國藥典》的水平。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SZX型超凈工作臺（上海滬南科學儀器聯營廠）；BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設備有限公司）；YXQWF32-500臥式榘形壓力蒸氣消毒器（湖南衡陽醫療器械廠）；LRH-250A生化培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）；MJ-160B-Ⅱ霉菌培養箱（上海躍進醫療器械廠）；CX31生物顯微鏡（奧林巴斯）；HTY HOMO761勻漿儀（浙江泰林生物技術股份有限公司）；JA2003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；JC101型電熱鼓風干燥箱（上海成順儀器儀表有限公司、南通嘉程儀器有限公司合作出品）。

1.2 樣品

烏芪舒筋通絡片（肇慶市中醫院，批號：15050401；15051102；15052401）。

1.3 菌種

實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代[4]，并采用適宜的保藏方法保存，確保試驗菌株的生物學特性。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌種均來自于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：3105210）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：3105120）、胰酪大豆胨液體培養基（批號：3105305）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號：3105054）、麥康凱液體培養基（批號：3105291）、麥康凱瓊脂培養基（批號：3105138）、RV沙門增菌液體培養基（批號：3104847）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號：3104852）、三鐵塘瓊脂培養基（批號：3105052）、腸道菌增菌液體培養基（批號：3105093）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號：3104750），均由廣東環凱微生物科技有限公司生產，使用前先進行培養基的適用性檢查，并且在有效期內使用，培養基的制備按照標示方法進行。

1.5稀釋液、沖洗液

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3105256）、胰酪大豆胨液體培養基（批號：3105305）、0.9%無菌氯化鈉溶液（自制）。

2 方法與結果

參照《中國藥典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度檢查法[3]進行驗證。

2.1 菌液制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物分別接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h；分別取各培養物 1 ml，加 0.9%無菌氯化鈉溶液9 ml，按10 倍遞增稀釋級數制成每毫升含菌數為

2.1.2 白色念珠菌

取白色念珠菌的新鮮培養物接種至100 ml沙氏葡萄糖液體培養基中，20～25℃培養2～3 d，取培養物 1 ml，加 0.9%無菌氯化鈉溶液9 ml，按10 倍遞增稀釋級數制備成每毫升含菌數

2.1.3黑曲霉

取黑曲霉新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，20～25℃培養5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子。再選用適宜的方法將孢子懸液吸至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每毫升含菌數

2.2 供試液的制備

取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養基至100 ml，用勻漿儀打碎，混勻，作為1∶10的供試液。量取1∶10的供試液10 ml，加胰酪大豆胨液體培養基稀釋至100 ml，混勻，作1∶100的供試液。

2.3 微生物計數方法適用性試驗

2.3.1 平皿常規法

2.3.1.1 試驗組 需氧菌總數計數：取1∶10的供試液5份，每份100 ml，分e加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液適量，振搖均勻，使每毫升供試液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制備2份，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，凝固，30～35℃中培養≤3 d，計數。

霉菌和酵母菌總數計數：取1∶10的供試液2份，每份100 ml，分別加入白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液適量，振搖均勻，使每毫升供試液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制備2份，立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，凝固，20～25℃中培養≤5 d，計數。

2.3.1.2 供試品對照組 取1∶10的供試液，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組操作。

2.3.1.3 菌液對照組 取胰酪大豆胨液體培養基代替1∶10的供試液，按試驗組項下方法操作，加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

2.3.1.4 計算 各菌株的回收率（R）=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%[5-6]，依據《中國藥典》2015年版四部規定，比值R應為0.5≤R≤2[7-9]（表1）。

2.3.2 平皿稀釋法

2.3.2.1 試驗組 需氧菌總數計數：取1∶100的供試液5份，每份100 ml，按“2.3.1.1”項下方法操作。

霉菌和酵母菌總數計數：采用平皿常規法R為0.5～2，所以不再進行稀釋法研究。

2.3.2.2 供試品對照組 取1∶100的供試液，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗組操作。

2.3.2.3 菌液對照組 取胰酪大豆胨液體培養基代替1∶100的供試液，按試驗組項下操作方法加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

2.3.2.4 計算 按“2.3.1.4”項下公式計算，結果見表2。

2.3.3 薄膜過濾法

2.3.3.1試驗組 取1∶10供試液10 ml，濾過，取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 ml，分2次沖洗濾膜，在第2次沖洗中加入相應的菌液適量（含菌量≤100 cfu），濾過，取出濾膜，需氧菌檢查將膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基中，在30～35℃下培養，≤3 d，霉菌和酵母菌檢查將膜貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，在20～25℃下培養≤3 d。

2.3.3.2 供試品對照組 取1∶10供試液10 ml，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗組操作。

2.3.3.3 菌液對照組 取胰酪大豆胨液體培養基代替1∶10的供試液，按試驗組項下操作方法加入試驗菌液，同時進行微生物回收試驗。

2.3.3.4 計算 按“2.3.1.4”項下公式計算，結果見表3。

由表1～3可知，烏芪舒筋通絡片需氧菌總數計數檢查采用平皿稀釋法、薄膜過濾法，霉菌和酵母菌計數檢查采用平皿常規法、薄膜過濾法，R均在0.5～2內，符合《中國藥典》2015年版四部微生物學限度檢查驗證的要求。考慮到實際操作中，平皿常規法、平皿稀釋法操作簡便，優于操作繁瑣的薄膜過濾法，故需氧菌總數計數法可選用培養基稀釋法，霉菌和酵母菌總數計數檢查選用平皿常規法為最佳方法。

2.4 控制菌適用性試驗

2.4.1耐膽鹽革蘭陰性菌檢查驗證試驗

取1∶10供試液適量，混勻，20～25℃培養2 h，作為預培養供試品。取預培養供試品3份，每份10 ml，分別加入10 ml腸道菌增菌液體培養基，第1份加入1 ml緩沖液作為供試品組，第2份加入1 ml大腸埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml）作大腸埃希菌陽性對照組，第3份加入1 ml銅綠假單胞菌（含菌量≤100 cfu/ml）作為銅綠假單胞菌陽性對照組。另取胰酪大豆胨液體培養基10 ml，加入10 ml腸道菌增菌液體培養基及1 ml緩沖液，作為陰性對照組。于30～35℃培養24～48 h，劃線接種到紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基的平板上，30～35℃下培養18～24 h，觀察菌落形態，結果見表4。

2.4.2大腸埃希菌檢查驗證試驗

取1∶10供試液2份，每份10 ml，分別加入到100 ml胰酪大豆胨液體培養基中，第1份加入1 ml緩沖液，混勻，作為供試品組，第2份加入1 ml大腸埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml），混勻，作陽性對照組；另取胰酪大豆胨液體培養基110 ml，加入1 ml緩沖液，作為陰性對照組，均于30～35℃中培養18～24 h。

取以上培養物1 ml加入到100 ml麥康凱液體培養基中，在42～44℃下培養24～48 h。然后劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，在30～35℃下培養18～72 h，觀察菌落形態，結果見表5。

2.4.3沙門菌檢查驗證試驗

取1∶10供試液2份，每份100 ml，第1份加入1 ml緩沖液，混勻，作為供試品組，第2份加入1 ml沙門菌（含菌量≤100 cfu/ml），混勻，作陽性對照組。另取胰酪大豆胨液體培養基100 ml，加入1 ml緩沖液，作為陰性對照組，在30～35℃下培B18～24 h。然后分別取培養物0.1 ml，接種至10 ml RV沙門增菌液體培養基中，在30～35℃下培養18～24 h，取少量RV沙門增菌液體培養物，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂的培養基上，在30～35℃下培養18～48 h，用接種針挑選疑似菌落，進行斜面和高層穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養基上，于30～35℃中培養18～24 h，觀察菌落形態，結果見表6。

由表4～6可知，控制菌檢查采用直接接種法，即可達到要求。

3討論

2015年版與2010年版《中國藥典》相比[10-11]，微生物計數法適用性試驗，從對細菌總數作方法適用性檢查，變成對需氧菌總數作方法適用性試驗，試驗菌株3種變為5種；培養基由胰酪大豆胨瓊脂替代營養瓊脂，用于檢查需氧菌，沙氏葡萄糖瓊脂培養基代替玫瑰紅鈉培養基，用于檢查霉菌與酵母菌，雖然增加了試驗的工作量，但卻具有良好的廣譜性，提高檢出率，方法更靈敏[12]。對控制菌的檢查，新版刪除了大腸菌群的檢查，新增了耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查[13]，對含有藥材粉末的固體口服給藥制劑都必須檢查沙門菌，提高了對致病菌控制的要求。

烏芪舒筋通絡片處方藥味中多種成分含有抗菌活性[14-15]，由實驗可知，對需氧菌具有抑制作用，故需氧菌總數計數檢查時采用常規平皿法回收率較低，需選用平皿稀釋法或薄膜過濾法。

在實際工作中，勻漿儀打碎樣品時，經常出現泡沫，往往對驗證結果造成影響，待泡沫消除后再加入菌種，基本能消除由操作引起的影響。

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一、生物實驗教學中培養學生思維方法存在的問題

目前中學生物實驗中，教師對學生思維方法的培養上存在一些問題。一方面，教師給予學生過多過細的指導，學生缺少探索、自由發展的情境，不利于發展學生的探究能力，更不利于學生應對當今的高考模式；另一方面，學生不能使知識成為解決實際問題的思維方法。在實驗課上，常常反映出理論歸理論，不能有效地把所學的理論彼此聯系，靈活地應用于實驗，不能使知識成為一種動態的知識。鑒于以上出現的問題，我們每一個高中生物教師都應該轉變思路，重視實驗教學中的思維方法與實驗設計訓練。

二、生物實驗教學中學生思維方法與探究能力的培養

1.重視經典實驗的教學，讓學生學會科學實驗的思維方法。大多數的生物概念、原理和規律都是建立在實驗基礎上的。我們應仔細分析書中的經典實驗，比如演示實驗（滲透作用實驗裝置）、模擬實驗（基因的分離定律）、驗證實驗（植物細胞質壁分離和復原實驗）、雜交實驗（孟德爾豌豆雜交實驗）、探究實驗（生長素發現實驗）等，同時引導學生學習經典實驗設計的技巧、科學的研究方法（觀察實驗——提出問題——作出假設——反復實驗——驗證實驗——形成規律）。嚴謹的、實事求是的科學態度和持之以恒的科學精神，有助于培養學生建立科學實驗的思維方法。例如“孟德爾的基因分離定律研究”成功的原因在于：實驗材料選擇適當；有科學的實驗設計程序（假說—演繹法）；有科學的研究方法（先研究1對相對性狀，再研究多對相對性狀）及統計方法（觀察子代性狀分離現象，統計每一種子代數目）等。

2.開放實驗室，讓學生邊動手邊領悟實驗的各個關鍵環節。課本中的實驗和其他知識點一樣是基礎知識、基本能力的載體，在最近幾年的生物高考題中也有意識地強調這一點。因此，在高三復習中，我們應盡量讓學生親自動手做實驗，將《考試說明》中所列的實驗從實驗目的、原理、方法和操作步驟等方面進行綜合分析，掌握相關的操作方法和技能，并能綜合運用其解決問題。

例如，2011年江蘇高考第10題（題目略）。本題考查的是書本實驗的綜合，涉及用顯微鏡觀察多種多樣的細胞、檢測生物組織中的脂肪、觀察植物細胞的質壁分離和復原。這道題的關鍵在于把握題干中的“直接”二字。在光鏡下可看到的對象有較大的如液泡；本身有顏色的，如葉綠體；或者經特殊染色的，如染色體、線粒體、脂肪。B項中的花生子葉和C項中的線粒體因未作染色，所以不可見；D項中的紫色洋蔥鱗片葉外表皮細胞內體積相對較大的紫色液泡，占據了很大的視野，因而也不易觀察到細胞核。要想能正確地解答此類題，教師要引導學生對教材中的基本實驗有一個清楚的認識，嘗試從實驗情境的角度來分析確認相關描述的準確性。如果我們在平時的教學中讓學生親自動手做實驗，那學生的解題能力就會大大提高。正如一位專家所講：“不做學生不知，老師也未必知。”

3.借助實驗思維進行試題分析，提高學生解決問題的能力。在平時的教學中，我們引導學生進行題目分析時，一方面要讓學生借助實驗思維，排除干擾信息，提高解決問題的能力；另一方面讓學生借助實驗思維，依據實驗目的，提高表達能力及歸納、比較、推理等邏輯思維能力。

例如，2011年江蘇高考第31題（題目略）。本題中對怎么操作交代得很清楚，為什么要這樣操作，還要注意什么問題，則需要考生在本題的情境下作出仔細的分析和推理，學生只有具備較強的思維能力，才能很好地解答本題。2011年江蘇卷28、30、31三大題均為實驗分析題，有各自的情境，提供信息的渠道豐富，問題的角度也有所不同，但都很強烈地傳遞了一個信號——重視生物實驗思維分析，重視學生實驗探究能力的考查。因此，我們在平時的教學中一定要充分意識到實驗題的重要性，訓練學生解答實驗題的思維能力。

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在一所學校里，無論是校園文化建設還是課堂改革，無論是學校規劃發展還是學生養成教育，都需要教師的參與，教師的處事態度、工作方法將直接影響到學校工作質量。而長時間單調、繁重的教學生活，或多或少的都會使教師產生職業倦怠，因此，如何激發教師工作的積極性，充分挖掘教師的潛能，就成為每一位學校管理者不得不面對的一個實際問題。

一提到調動教師積極性，很多學校管理者馬上會想到通過多發獎金和物質獎品的方法來激發教師的工作熱情，這的確是最簡單、最直接、最容易被教師接受的一種方法。但是對于義務教育階段的農村中小學來說，有限的經費維持平時的辦公開支還捉襟見肘，根本就拿不出用于獎勵教師的“富裕”錢。因此，在農村中小學，我們必須把調動教師積極性的重點放在精神獎勵上，讓教師發自內心地去愛教、樂教、愿意從教。

一、弘揚主旋律，宣傳新的教育政策，對教師們進行正面引導

目前國家的教育理念已經開始改變，例如：從提倡教師像蠟燭一樣燃燒自己照亮別人轉向鼓勵中小學教師發展自我、成名成家；從大規模的合校并點轉向區域化、均衡化的教育發展。十八屆三中全會更是提出了“立德樹人”的教育理念，改變科目的分值設置，改變功利化的教育模式，讓教育回歸原生態。為了提高教師地位，對教師任職資格制度也進行了改革，提高了獲取教師任職資格的門檻，即使師范院校畢業的學生也必須通過國家統一組織的教師資格考試，才能取得教師任職資格證書。此外，教師職稱制度也在逐步改革，在中小學教師中已經開始增加正高級職稱的名額。管理者可以通過這些正面信息的傳達讓教師知道國家正在想辦法提高教師待遇，引導他們積極地去對待教育工作。

二、學校要建立公平、公正的管理制度，做到規范化辦學 學校的管理制度都是為教學工作服務的，涉及學校所有教師的切身利益。因此，在制定管理制度時一定要尊重廣大教師的意見。學校管理制度的制定應該分以下幾個步驟：1調查研究。制度的制定是為了解決某一方面的問題，不調查不研究就沒有發言權，所以第一步就是調查研究、了解實情。2．組織教職工委員會討論，拿出初稿。3．把初稿分發給教師并征求他們的建議。4．對教師提出的建議進行匯總并提交教職工委員會再次討論定稿。5．學校大會公布實施。

比如：《沙河五中績效工資分配方案》就是在教師全員參與的情況下制定的，并且隨著學校實情的變化不斷進行修改。修改的過程也是透明的，完全是由教師討論并提出反饋建議，學校再組織教師代表整理建議，并依照大多數教師的建議進行修改。發放績效工資時，學校嚴格按照制度執行，對于分配結果教師也都能夠欣然接受。．

三、學校管理者要擺正自己的位置，演好自己的角色，提高自身的素質

1．借助榜樣的力量。首先，學校管理者要做教師的榜樣，要求教師做到的事自己一定要做到、做好。在道德標準、思想作風上，要高標準要求自己，做教師生活中的楷模；在教學工作中，要提高自身的教育教學研究能力，積極主動地參加學校的各項教學活動，做教師工作中的領路人。其次，從我校教師隊伍內部找典型、樹榜樣，比如我們學校的崔然老師課堂教學理念先進，善于創新，在教學改革上常有突破，就可以把她作為課改榜樣；陳捧書老師，埋頭苦干從不計較工作得失，30年如一日，教學工作從未放松，可以作為師德楷模。身邊榜樣的力量，更能激發教師的積極性。

2．學會服務于教師。作為學校管理者，不應高高在上，而應多為教師服務，在生活上關心他們，在工作上幫助他們，在業務上指導他們，融入他們中間去，以此調動他們的積極性，營造和諧的工作氛圍。

從人性的角度來講，一直要求教師把全部精力放在工作中也是不現實的，對此，我們大膽提出了“家庭第一，健康第二，工作第三”的口號。讓教師看到學校管理者對他們的愛護，當他們真正感受到學校管理者的關心之后，反而會做到“工作第一，健康第二，家庭第三”。我想這也許就是《孫子兵法》上所說的“不戰而屈人之兵”的道理吧！

3．學會與教師溝通。教師是小知識分子，普遍愛面子、自尊心強，在與他們溝通時要適時、適地、適度。對于個性特別強的教師，要運用多種渠道進行溝通，要給教師講明道理：要想獲得自尊，就必須自強，要想在工作中做出成就，就必須有勇于獻身的精神，有投入才會有收獲。不實在、不踏實、不努力、不奮斗、不積極的人永遠得不到別人的尊重。

四、規劃教師的專業化發展，為教師們樹立一個明確的奮斗目標

教師長年在學校里閉門教書，從初一教到初三，又從初三教到初一，視野被固定在一個小范圍內，有的教師經過幾輪教學小有成就沾沾自喜，停步不前，進而產生職業的倦怠。因此，必須要把老師從自滿的“牢籠”中解放出來，要為教師謀劃專業發展之路，促使他們不斷充實自己、改變自己。

1．給教師一個明確的奮斗目標。學校管理者在規劃學校愿景的時候，要幫助每位教師找到自己的發展方向，并制定個人的發展計劃。例如：為了讓教師認識到自身價值，看到自己的發展潛力，學校每年都要組織一些活動，讓教師在活動中展示自我，學會溝通．找回自信。

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2009年10月13日，衛生部了關于印發《臨床路徑管理指導原則（試行）》的通知，為醫保支付套上了規范治療的“緊箍咒”。衛生部首批制定22個專業112個病種的臨床路徑，確定23省市110家醫院試點。截至2011年底，全國已有3467家醫院25503個科室開展臨床路徑管理，目前開展臨床路徑管理的醫院數量占公立醫院總數的46.9%。2012年開始的“三甲醫院復評”工作在全國范圍內展開，本輪評審的一大突出特點是：涉及質量管理中的臨床路徑、單病種管理等關鍵指標，納入“等級評審一票否決條款”。

“臨床路徑”指醫生、護士及其他專業人員針對某個病種或手術，以循證醫學為基礎，以提高醫療質量和保障醫療安全為目的，所制定的有嚴格工作順序和準確時間要求的程序化、標準化的診療計劃，以減少康復延遲及資源浪費，使患者獲得最佳的醫療護理服務。

這將讓處方藥推廣面臨巨大挑戰。國內仿制藥和中成藥如何應對臨床路徑的實施，創新學術推廣策略呢？仿制藥推廣的重點是提供或解釋診療方案，包括為患者提供簡單的說明書、適應癥及用法用量等，為醫生提供詳細的產品推介、禁忌癥、適應癥、同類藥品比較、用法用量、保存方法、不良事件等，以及診療方案、相關疾病診治指南、用藥選擇、藥品信息、藥品搭配與相互作用、相關不良事件的處理、藥物經濟學知識等。

改變認識拓市場

具體而言，代表可通過分析產品的適應癥和參與的臨床試驗，進一步分析臨床試驗所涉及的診療方案，結合診療方案所涉及指南和共識來闡述產品。比如對大環內酯類藥物地紅霉素的推廣，要結合醫生對治療的認識現狀和目前國內外指南、共識內容的差距進行分析。

美國傳染病學會／美國胸科學會2007年成人社區獲得性肺炎（CAP）診療指南指出：對于嚴重CAP患者，至少應該進行血樣細胞培養、檢測嗜肺軍團菌和肺炎鏈球菌的尿液抗原試驗以及痰樣本細菌培養。對于氣管插管患者，應進行氣管內抽吸物檢測。對于先前身體健康且無耐藥肺炎鏈球菌感染風險因素患者的治療方案為：1.一種大環內酯類藥物（強力推薦，1級證據），2.多西環素（一般推薦，3級證據）。這一證據充分強調了地紅霉素的單藥治療。

當CAP患者有慢性心、肺、肝或腎臟疾病，糖尿病，酗酒，惡性腫瘤，無脾，免疫抑制或使用免疫抑制劑，或者先前3個月內使用抗生素或具有其他肺炎鏈球菌感染風險，推薦治療方案：1.一種用于呼吸道感染的氟喹諾酮類（強力推薦，l級證據），2.一種β-內酰胺類+一種大環內酯類（強力推薦，1級證據）。這一證據強調地紅霉素的參與治療。

重點通過如下五個方面與指南結合推廣：

1.結合流行病學調查，指出醫生目前使用地紅霉素不廣是因為他們不了解肺炎的致病菌中有非典型微生物。

2.結合指南指出，這些非典型微生物要常規檢查。

3.結合指南指出，使用地紅霉素為代表的大環內酯類藥物可覆蓋非典型微生物。

4.結合指南指出，地紅霉素為代表的大環內酯類藥物可單用，也可和其他藥物聯合使用，是治療的基石（聯合治療）。

5.結合指南指出，重癥感染的患者在使用超廣譜抗生素滿療程后應換用地紅霉素、阿洛西林等誘導耐藥率少的藥物（貫續治療）。

尋找意外點造市場

通過尋找醫生對診療指南的盲點，闡述產品對該盲點的覆蓋，創造產品新市場。比如對于N-乙酰半胱氨酸產品的推廣，結合國外現有指南的思考，我們可以提出如下的推廣創新：有呼吸道感染，即有痰，有痰須祛痰，可用N-乙酰半胱氨酸；抗感冒的藥物含有對乙酰氨基酚，苯成分過量易中毒，N-乙酰半胱氨酸可解毒；慢性肺炎，肺易纖維化，N-乙酰半胱氨酸可抗纖維化；血管造影、腫瘤增強掃描時使用造影劑易損腎，N-乙酰半胱氨酸可保腎。

新產品先講效果出眾，再講安全可靠。老產品先講安全可靠，再講效果依舊。同樣安全、有效，可比比效益多少；效益一樣多，比比方便與否。

中成藥推廣的重點是將產品融入診療方案：通過分析產品的藥理特性及法定適應癥，分析診療方案所涉及的共識、指南精神要點，結合診療方案闡述產品特點，將產品和指南共識對號入座。

“因病循證醫學”應用于中成藥的學術推廣意義重大。

目前，中藥的循證醫學多數是在西醫框架內進行，缺乏相應的中藥循證醫學的方法學研究。同時，對疾病缺乏適應癥的理解與支持。多數中藥使用治則、治法或者中醫的證來表述適應癥，雖然能給推廣帶來更多的彈性，但在與化學藥物發生藥物臨床用藥競爭時證據級別較低。中成藥所進行的臨床試驗大多屬于動物實驗或觀察性試驗，目的集中在驗證藥物療效的有效性。

隨著循證醫學的發展，臨床治療證據以嚴謹、科學的方法被記錄下來，對應最新的循證醫學證據級別，我們可以發現，多數中成藥的證據級別可能集中在論點、評論與觀點，病例報告以及隊列研究級別，存在相當數量的醫家用藥經驗、驗方、病例集，亦有相當數量的面向藥物療效的臨床研究。由于藥物的化學特征和藥理作用不能輕易更改，只關注藥物特征，如適應癥、給藥方式、療效、安全性和作用機制等，就無法找出更多說服客戶處方的理由，更好地關注競爭，并確定自己的治療優勢。同時，關注臨床試驗中藥物體現出來的特點，還可以增加推廣概念，獲得更寬敞的視野。

結合指南、共識推廣

當然，中成藥推廣的終極解決之道是組織大規模的臨床試驗，但是該方法時間長、組織難、花費大，現實的解決之道是結合現有指南、共識精神進行推廣，從而改變專家觀念，進而改變臨床路徑。

比如康婦凝膠的推廣，結合美國CDC2010年指南和美國陰道鏡和宮頸病理學會ASCCP2006年指南，將康婦凝膠各中藥成分的藥理作用對號入座，符合CDC陰道炎治療指南和宮頸病變管理指南中以下治療要求：抗真菌，用于真菌性陰道炎；抗細菌，用于細菌性陰道炎；抗病毒，用于宮頸病毒感染；冰片鎮痛作用，可用于宮頸活檢鎮痛，如醫生根據宮頸細胞學管理指南進行宮頸活檢，使用康婦凝膠可減少疼痛，促進傷口愈合，有利于指南執行。

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[關鍵詞] 檢驗師;臨床;實驗室;橋梁

[中圖分類號] R446-4[文獻標識碼] B [文章編號] 1673-7210(2010)02(a)-137-02

一個高質量的檢驗結果的產生,有實驗室一半的功勞,也有臨床醫護人員的一半功勞;但是一旦出現問題,究其責任,更多的在于檢驗醫師。隨著醫學科技和檢驗設備的更新與發展,檢驗醫師工作已經不只是局限于檢驗樣品本身,而應擴展到檢驗分析前、分析中、分析后的整個過程,把有限的實驗數據轉變為高效的診斷信息,更多更直接地參與臨床的診斷和治療。主要表現在這幾個方面:

1 注重分析前實驗誤差

有資料統計,在1997年約有68.2%的檢驗誤差發生在檢驗前期,而來自于檢驗中、檢驗后的誤差率分別為13.3%和18.5%。到2007年,又有人對檢驗誤差做了類似統計,結果顯示檢驗前期誤差發生率仍高達61.9%。所以,10年間,雖然醫學科技不斷發展,但檢驗誤差發生率幾乎沒有改善。60%以上的檢驗誤差在檢驗還沒有開始前就發生了,這也更加說明了檢驗醫師與臨床醫師之間有必要加強溝通。所謂分析前階段是指從采集標本前的準備到實驗室檢測前的一系列處理過程,包括患者準備、真空管的選擇、樣本采集標記、樣本的運送與交接、接到樣本后的處理及保存等環節。雖然分析前的工作很重要,卻沒有引起醫生、護士的重視。造成這些誤差的主要因素包括采集標本不規范(包括用錯抗凝管、護士直接從輸液器抽血、標本張冠李戴等)、采集時間不對、標本收集后未及時送檢,標本不合格等。尤其體現在細菌培養方面,標本的采集就更加不夠規范。正確采集和處理標本是實驗室檢查獲得正確結果的前提,由于標本采集主要由醫護人員操作,但是臨床醫護人員對于微生物標本的采集要求和注意事項不甚了解,比如標本采集前患者應做些什么準備,采集標本應選擇什么時機、什么部位,每天采樣幾次、采集多少以及采集部位如何消毒等一系列問題。其結果可能導致標本采集不合格,使致病菌檢出率降低或即使分離出某種細菌,但該菌未必是致病菌。這樣的結果非但不能提供病原信息,反而造成誤導。所以檢驗醫師有責任對臨床醫護人員進行這方面的宣傳和指導,以引起全體人員對檢驗標本分析前質量控制重要性的足夠重視。當臨床醫師需要做細菌培養加藥敏時,檢驗醫師要向臨床醫師咨詢問清患者的情況,包括臨床表現及用藥情況等,然后告知醫護人員讓其指導患者或幫助患者如何正確留取標本,以保證檢驗結果的準確性。因此,在臨床診療過程中,檢驗醫師應指導或協助醫護人員結合患者自身情況,包括主動詢問患者飲食習慣、用藥等情況考慮對化驗結果產生的影響來對患者化驗單做綜合分析;同時對檢驗申請、患者識別、標本采集以及不能即時化驗的標本如何保存等整個過程給予指導、培訓、答疑和咨詢。

2 制訂檢驗項目組合應合理化

在日常工作中,部分醫師為了自身利益或對檢驗項目組合不是充分了解而對患者采取拉網式檢查,也已成為我國臨床診療過程中的普遍現象。如肝功或腎功的檢查,一般幾個關鍵指標便能反映問題,但有的醫師往往選擇“大生化”。這樣不但給患者造成經濟負擔,也造成實驗室資源浪費。因此,這就需要檢驗醫師根據不同的檢驗儀器、設備、項目向臨床科室組織開展多種形式的專題座談,建立和臨床醫師聯合查訪機制,多與臨床醫師溝通協商。經常與臨床交流溝通一方面可以根據實驗項目的方法學研究及臨床意義與臨床醫師共同制定有效、合理、經濟的項目組合、指標“參考范圍”、“危機報告值”等;另一方面還可以通過與臨床醫師的交流和溝通,能夠了解臨床醫師對醫學檢驗工作的建議與意見,積極開展臨床醫師帶來的新實驗新項目,這樣更加有利于檢驗科工作的開展,更好地服務于患者。

3 要提供有價值的診斷信息

檢驗醫師與臨床醫師的溝通越來越被重視。比如CK和CK-MB,在兩者升高時,檢驗醫師應該及時與臨床溝通,說明此項目會受檢驗方法的影響造成假陽性;而患者嚴重創傷后其肌肉損傷也可能造成CK升高,所以判斷創傷患者是否有心肌損傷應再結合CK-MB與CK比值,結合臨床表現、體征及心電圖等檢查結果做綜合診斷,同時建議動態監測心肌損傷的特異性指標肌鈣蛋白,以免漏診或誤診。再比如做細菌培養及藥敏,指導臨床正確的標本采集方法,才能保證又快又準確的報告。而現在有的臨床醫師也越來越依賴藥敏結果,尤其是對長期應用抗生素或住在ICU室的患者,我們的化驗結果就會更加重要。通過臨床醫師與檢驗醫師的及時溝通,選擇相應的指標監測能使患者得到確診和有效治療,并且使診斷過程縮短。因此現在有的臨床醫師會主動與檢驗醫師聯系并商討抗生素的用法。這也是檢驗醫師是臨床與實驗室間的橋梁的體現。

由此可以看出,臨床醫師與檢驗醫師溝通的重要性。近年來,檢驗儀器實現了半自動化、自動化、微機化。先近的實驗技術與儀器不僅提高了實驗結果的準確性和精確性,還為臨床不斷提供許多新的實驗指標。然而,如何從臨床獲得患者資料,病情變化以保證分析后的質量評估,并對臨床的診治工作提出我們的建議;如何將一些先進實驗方法、原理、臨床意義介紹給醫護人員,使之能合理地選擇試驗、正確地分析試驗結果用于診斷和治療是檢驗醫學的重要內容,這也正是檢驗醫師以后需要加強的重要方面。檢驗醫師已經不只是局限于對送到實驗室的標本負責,而應從單純提供實驗數據向提供有價值的診斷信息轉變,將自己的專業與臨床相結合,做臨床與實驗室間堅實的橋梁。

[參考文獻]

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[2]梁冰,李慧,吳振軍.臨床檢驗操作技術系列叢書:微生物學檢驗分冊[M]. 北京:軍事醫學科學出版社,2006.

[3]康格非,何萍.我國檢驗醫學發展的道路及前景[J].臨床檢驗雜志,1994,23(2):12-13.

[4]李燕平.加強檢驗醫師隊伍的培養 促進臨床與檢驗的交流[D].第三屆全國臨床檢驗實驗室管理學術會議論文匯編,2005.

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[關鍵詞] 生物樣品前處理； 研究進展； 展望

生物樣品的預處理是藥物分析最為關鍵的一步。通過預處理可以將綴合物（尿）或者結合物釋放出來，以便測定藥物的總濃度；可以純化待測組分；可以更好地適應分析方法的靈敏性、專屬性等；也能減少雜質對分析儀器的污染，達到提高儀器靈敏度、準確度、精密度等要求。生物樣品包括動物組織、植物和微生物等。對于動物組織，先絞碎結締組織、脂肪等非活性部分，然后選擇合適的溶劑進行提取，必要時要破碎細胞。對于植物，要去殼、除脂。而對于微生物生物樣品，要及時將菌體與發酵液分開。本文著重闡述一般的生物樣品，包括血液、尿液、唾液、糞便以及各種組織，其中最常用的是血漿或血清，因為其可以較好地體現藥物濃度和療效之間的關系。其特點是成分極其復雜，包括基質、內源性物質及代謝產物等等，樣品中含有數百種乃至幾千種化合物，而要測定的藥物濃度卻很低， 往往處于ng～pg 級水平，甚至更低。此外，在分析生物樣品之前還要經歷分離、純化及濃集，必要時還需對待測組分進行化學改性處理，以使待測物純度達到儀器使用的基本要求[1]。步驟繁雜，耗時長，回收率不客觀。基于以上特點，選擇適合的前處理方法是實驗的關鍵環節。

目前，國內外最常見的生物樣品前處理方法有以下幾種，它們各自的優缺點如下。

1 沉淀蛋白

通過沉淀蛋白質可以使結合的藥物釋放出來，達到對待測組分提取和純化的目的，也可以測定藥物總濃度。去除蛋白質預防提取過程中蛋白質的發泡，可以減少乳化，另外還可以保護儀器，延長使用壽命。沉淀蛋白是體內藥物分析工作的第一步。如應景艷將大鼠的五臟等組織取出后，吸取組織殘留的血液然后加入0.9%的生理鹽水研漿處理，1萬 r?min-1離心10 min后吸取上清液[2] 。一般使用1～3倍體積的甲醇、乙腈、丙酮或乙醇等有機溶劑對蛋白進行沉淀。如果是水溶性的可以用酸類沉淀蛋白。有機溶劑沉淀蛋白的能力大小一般為乙腈>丙酮>乙醇>甲醇，由于乙腈和甲醇對液相和液-質的兼容性好，所以最常用的沉淀蛋白的有機溶劑為乙腈和甲醇[3]，其中乙腈可以提高被測組分的分離度，也能更好地改善峰形。另外，如果用高氯酸，如6%的高氯酸進行沉淀蛋白后，最好不要直接進色譜柱進行分析，應調節合適的pH然后過膜，再進樣，以免由于酸性太強損傷柱子。與液液萃取相比，蛋白沉淀操作方便，但可能會稀釋樣品，降低靈敏度，且樣品較臟。

李利群等[4]給大鼠灌胃和尾靜脈注射紅景天苷，取出血漿后用高氯酸沉淀蛋白，結果在24～150 000 μg?L-1線性關系良好，平均提取回收率為95.99%。

甲醇、乙醇、丙酮等水溶性溶劑能使蛋白質脫水，使得溶液的介電常數下降，蛋白質分子間的靜電引力增大，從而使蛋白質凝聚和沉淀。用這種方法沉淀蛋白時要注意有機溶劑可能會溶解塑料，所以必要時要考察離心所用的容器[5]。另外，質譜的響應值與離子強度有關。生物樣品中殘存的雜質會導致待測物的離子化強度的改變，生物基質效應還受到動物個體的影響，采用液質聯用時注意考察基質效應對樣品的影響，采用與基質一致的成分進行標準曲線和質量控制樣品的配制以減小差異[6]。

蛋白質是多價的兩性電解質，通常在酸性溶液中帶正電，在堿性溶液中帶負電。電解質處于等電點時，分子表面凈電荷為零，導致賴以穩定的雙電層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。等電點沉淀分離法的基本原理即通過調節溶液的pH，使兩性電解質的溶解度下降，從而使蛋白質陽離子形成不溶鹽而沉淀。如飽和硫酸銨、硫酸鈉等中性鹽進行沉淀。當然鹽溶液如果加入過多會使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀，此時對于色譜分析儀器，要注意柱子容易堵塞的問題。

蛋白質沉淀法操作簡單，有較好的重復性，效率也較高，但是對于蛋白結合率較高的成分，會有回收率低的結果產生。此外，去除蛋白質的方法還有加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑法、酶水解法（如枯草桿菌酶）、加熱法，但一般都很少用。

2 液-液提取

液-液提取包括液-液萃取、液-液回提（多次提取）、離子對提取。

液-液萃取（LLE）是在液體混合物中加入與其不相混溶（或稍相混溶）的溶劑，利用組分在溶劑中的不同溶解度而達到分離或提取目的，又稱溶劑萃取或抽提。由于多數藥物是脂溶性的，而生物樣品中的內源性物質是水溶性的，因而可以利用液-液萃取法除去大部分雜質，如應用于血漿、尿液、毛發樣本的萃取等。實驗者在選擇溶劑時應注意按照相似相溶的原則；使用與水不互溶如乙醚等溶劑，防止帶水溶性雜質；且溶劑純度AR（分析純）以上、無毒，沸點要低、易揮發和濃集，不影響紫外檢測；還要有很好的化學穩定性。最好不要選擇氯仿，易乳化且毒性大。如果被測定組分極性較小，可以選擇正己烷等極性相對較弱的溶劑，相反，可以選擇二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等[7]。

向貞兵等[8]取糖尿病模型大鼠全血加入0.3 mL的0.06 moL?L-1 HCl后，又經過乙酸乙酯和乙腈萃取，成功得到了以溴化苯甲酰噻唑的類似物為導向設計合成的化合物。回收率約80%左右，重復性也良好。Tabernero M J等[9]以25個濫用氯胺酮和安非他明的人的頭發為樣本，用0.1%聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯沖洗，待干燥后，再用0.01% 甲酸超聲4 h。液-質聯用檢測后，線性范圍0.5～25 μg?L-1，檢測限為0.1 μg?L-1。

液-液回提（多次提取）對指對于堿、酸性藥物，在有機溶劑初次提取后，調節適當的pH，使藥物變成離子型，用水把藥物回提（反提取）（back extraction）到水相，再調節水相pH，使藥物變成分子型，最后用有機溶劑萃取水相中的藥物。液-液回提法可以將一些酸、堿性雜質除去，達到凈化樣品的目的，缺點是提取率低

離子對提取法是指由于一些電離性較強（調pH無效）的藥物在水溶液中主要以電離形式存在，很難被提取，此時，通過加入適當的反離子（counter ion）與其形成離子對（大分子復合物），則成為一種偽中性分子，即能從水相進入有機相中，之后可用萃取法提取[10]。常用的反離子有季銨鹽R4N+，磺酸鹽，苦味酸陰離子；一般常用的惡提取溶劑為鹵代烴類，如CH2Cl2。

液-液提取操作簡單，應用廣泛，但是需要大量使用有機溶劑，有毒，存在乳化現象，也難以實現自動化。此外，一般萃取率都不高。為了防止乳化，可應用較大體積的有機溶劑，避免猛烈振搖或加入適當的試劑改變其表面張力而破乳，若已發生嚴重的乳化現象，可將試管置于冰箱中冷凍破乳或者可將試管置于離心機中離心消除乳化[11]。

3 固相萃取

固相萃取（solid phase extraction，SPE）技術廣泛用于各種生物樣品的處理，和HPLC，GC色譜原理基本相同，即相似相溶。SPE技術操作一般可分為4步：選擇SPE柱、裝柱、上樣、收集樣品[12]。柱壓可分為： 減壓、加壓、常壓。減壓可以降低固定相的用量，缺點包括溶劑易揮發、被測物質易損失。加壓主要可以縮短跑樣時間。缺點包括：壓力大會降低柱子的塔板數，如果壓力過大反而會使溶劑流速過快而分離較差。一般常壓效率很高，但比較耗時。

3.1 選擇固相萃取柱

根據樣品量的大小、固定相的保留能力、目標物的理化性質，然后選擇合適的萃取柱。為減少成本，實驗室一般選擇直徑-長度1∶5～1∶10，固定相硅膠量-樣品量30～40 倍的萃取柱。填料包括陰離子交換填料、陽離子交換填料以及反相填料。這主要依據待測物所帶的電荷。如果樣品對氧、水敏感且易分解，則可以選擇無水氧化柱[13]。

固相萃取裝柱包括干法裝柱和濕法裝柱，但一般都分為3步，即裝下篩板，加裝填料，裝上篩板。第一步裝下篩板時要注意把篩板浸泡于水中，用超聲或震蕩趕掉篩板空隙中的空氣，備用。用裝柱工具把篩板頂入柱體，再把篩板平推到柱體底部；第二步進行加裝填料，將填料和適量的緩沖液加入小燒杯中，制成混懸液。蓋上柱體的下蓋，用吸管取混懸液加入柱體中，當混懸液體積多于柱體體積時，取掉下蓋放掉部分緩沖液，靜置使填料沉到柱體底部。第三步裝上篩板，保持柱體垂直，用裝柱工具把篩板頂入柱體，再把篩板推到填料上表面，蓋上蓋（注意： 某些應用需要在填料上表面和上篩板之間留適當空隙）。一般若想得到十分均勻緊實的固定床，采用濕法裝；如粒度較大可采用干法裝柱。

3.2 上樣前樣品的處理

可以先除蛋白后取上清液，以使藥物游離出來，也防止堵塞色譜柱。然后調節pH[14]，可以直接用酸或者堿調節pH后取上清液萃取；也有采用超聲后加入水或緩沖液，然后取上清液方法進行萃取的。

3.3 選擇合適的洗脫劑

收集洗脫液，然后將洗脫液揮干濃縮后，用流動相復溶，再進行檢測。如果樣品在硅膠中解析較慢，可以采用氧化鋁作為固定相。

注意：如果過柱時產生氣泡，一方面考慮選擇沸點較高，揮發性較小的溶劑。混合溶劑則需要沸點相似。另外，在裝柱子之前，為避免柱子中殘留空氣，需要加壓將其排干。

Horspool等[15]使馬盲腸液進入固相萃取柱，然后經磷酸緩沖液洗脫后，結果檢測7 種短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和乳酸，回收率約為72%～89%。

固相萃取方法安全性高、選擇性好、高效性、高自動化程度、低耗性、預處理時間短，上樣量少，操作簡單而應用廣泛[16]。此外，在處理生物樣品時，很少引入外源性雜質，也不會產生乳化現象。但是固相萃取成本高，要求的技術高，所用的萃取小柱也容易堵塞。

4 分子印跡技術

分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）是一種人工合成的抗體，通過分子印跡技術合成的對特定目標分子（模板分子）及其結構類似物具有特異性識別和選擇性吸附的聚合物，即利用抗體進行選擇性提取和富集目標化合物[17]。

基本原理為目標分子（模板分子）（templatemolecular）和功能單體（funcit ionalmonomer）通過共價鍵或非共價鍵作用可逆結合，然后加入交聯劑（crosslin ker），聚合形成目標分子被埋在內的剛性的固體顆粒，最后選擇合適的溶劑將目標分子從聚合物中洗脫下來，獲得的聚合物即為分子印跡聚合物。MIP具有記憶功能，高度的識別性和預定的出峰順序以保證目標物的富集。總之原理類似于酶-底物的“鑰匙一鎖”相互作用原理。廣泛應用于色譜固定相、固相萃取、模擬酶催化、膜分離和模擬抗體受體等方面。MIP合成方法相對簡單，且成本較低，對酸和堿以及有機溶劑的耐受性也較好[18]，見圖1。

洗脫方法包括溶液浸泡、索式提取和超聲洗脫等。MIP制備中應用的溶劑體系通常為乙腈-水或甲醇-水。常用的分子印跡聚合物合成方法為熱聚合法和紫外光照射法。

李魏嶙等[19]基于異丙酚光纖熒光檢測系統的改進而把膜分離和異丙酚分子印跡固定相萃取柱結合起來，對異丙酚血樣進行處理。本方法的優點是膜分離與分子印跡固相萃取方法的結合實現了對異丙酚的全血樣品的在線和快速的處理，并且能對血液起到一定的“保護作用”。

呂斌等[20]先后采用熱和紫外光輻射引發2種方法合成了膽固醇的非共價型MIPs，MIPs有效地免疫吸附了血液、蛋黃、牛奶中的膽固醇，其中對血清的效果最好，而效果最差的是蛋黃。

分子印跡聚合物受到模板分子結構的制約而使得分子印跡聚合物的吸附性能擴大，分子印跡的適用范圍較窄[21]。

5 固體微萃取技術

固相微萃取技術（SPME）始于20世紀80年代末，該樣品前處理技術基于固相萃取，但是不必需要柱填充物和有機溶劑。SPME的萃取主要有2種模式： 直接法（Di-SPME）和頂空法（Hs-SPME）。前者適用于分析難揮發性物質，而后者適用于揮發性、半揮發性物質。固相微萃取的涂層材料主要有以下幾種類型：聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）新型聚合物涂層；商品化涂層，包括PDMS/乙烯基苯（divinylben-zene，DVB）、聚乙二醇（carbowax CAR）/PDMS）碳分子篩（carbon molecular sieve，CW）/DVB、CW/模板樹脂溶膠-凝膠涂層。近年來還比較關注的涂層是離子液體，與商品纖維相比，其萃取效率更高。在萃取過程中，被分析物在纖維萃取頭外部涂漬的固定相涂層和樣品中快速分配平衡，完成采樣、萃取和濃縮。涂層上吸附的待測物的濃度與樣品中待測物濃度成正比，萃取完后可以結合氣相色譜-質譜、液相色譜-質譜對樣品進行熱解析或者液體解析。操作簡單，易自動化，環保，也能減少樣品低溫保存。在生物樣品的應用中，活體固相微萃取（in vivo SPME）和基于多孔板技術（multi-well plate technology）的高通量固相微萃取（high-throughput SPME）[22]。

近年來，SPME用于活體采樣，如可以對靜脈注射給藥后的血藥及其代謝產物的濃度進行定量。需要注意的是，在動物采樣時要求在無菌環境中進行，即SPME裝置必須在使用之前進行消毒，這樣才可以實現生物相容性，進而有效排斥蛋白，最終萃取出目標小分子分析物。SPME在體內完成提取后，結合液-質聯用色譜，即可完成對被測物的定量分析。從采血樣到樣品分析整個過程，相對傳統的液質色譜前處理分析，SPME耗時更短[23] 。

趙艦等[24]用固相微萃取-氣相色譜聯用分離、分析尿中痕量毒鼠強，監測了1例毒鼠強中毒幼兒尿中毒鼠強含量，在中毒后 3 個月內仍從尿中檢出毒鼠強成分。該方法的線性范圍為10～500 μg?L-1，最低檢出濃度< 10 μg?L-1， RSD

6 微透析技術

微透析技術誕生于20 世紀60 年代，最早用于研究腦脊髓液化學環境，經過近60年的發展，現在廣泛應用于實驗神經生理學、神經化學[25-27]、體內藥物分析[28]等多領域。微透析（microdialysis）技術結合灌流取樣和透析的原理，實現了對動物和人的細胞外液、組織、大腦等生理水平的動態微量生化取樣，具有活體連續取樣、動態定量分析的特點，而且取樣量小、組織損傷輕等特點。 可以在麻醉或清醒的生物體上使用。相比SPE和LLE 法，MD操作簡單、無溶劑消耗、快速。微透析技術的缺點就是對取出的樣品需要進行準確可靠的校正，其主要關系到對回收率的測定。探針回收率是從灌流液中流出的被測組分與標準濃度之百分比。探針回收率將直接影響微透析結果， 而回收率的好壞取決于取樣部位的生物學性質、透析膜的物理性質（材料、孔徑、長度及幾何形狀等）、待測物質的相對分子質量、灌流速度、壓力、生物體本身的健康條件和生物節律等多方面條件。目前測定回收率的方法包括：零凈通量法、內標法、低灌注流速法、外推法、無凈流出量變化點、滲出率法等[29-30]。

為了實現從樣品的采集、處理、分離到檢測完全自動化，近年來，微透析技術逐漸與高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳（CE）、液質（LC-MS）等技術聯用。

Rong-Hua Ma 等[31]采用微透析與LC-MS 聯用技術實時監測了斯皮諾素和斯皮諾素與環孢素A聯用時在大鼠腦、血和膽汁中的藥代動力學參數，選擇性好、靈敏度高，具有合適的線性范圍。董文彬等[32]對大鼠靜脈注射米諾環素后，進行在體、實時的微創體液取樣，即利用微透析進行動態采取血液和腦內的海馬CA1區中游離米諾環素，然后直接利用HPLC進樣，最后計算米諾環素在大鼠體內血漿蛋白結合率。米諾環素大鼠血漿蛋白結合率為82.08%。Marina M Carrozzo等[33]在老鼠體內植入微探針獲得了微量的腺甘酸，運用LC-MS/MS監測了在自由運動的老鼠大腦特定區域的腺甘酸濃度的微小變化，方法靈敏、可靠。

7 磁性固相萃取技術（MSPE）

磁性固相萃取技術（MSPE）基于磁性納米材料的使用，利用磁性微球或磁性納米粒子吸附目標物。

磁性微球作用的原理是磁球吸附目標物，然后通過磁分離器進行分離，最后從磁球上把目標物洗脫下來，達到純化目標產物的目的。具體萃取操作步驟：將含有目標物的液體與磁珠混合發生偶聯反應。然后用磁分離器分離磁珠目標物復合體，再清洗復合體表面的雜質，最后通過洗脫使目標物從復合體中分離，從而得到純化的目標產物。施加磁場的技術包括磁泳分離技術、四極磁場下的磁泳分離技術、微芯片上的磁泳分離技術等[34]。

磁性微球一般由具有超順磁性無機納米磁性材料（Fe，Co，Ni及其氧化物等）和高分子2部分組成。磁性微球分為核殼型、混合型、多層型。當磁性的粒徑小于某一臨界尺寸后，在有外加磁場存在時，表現出較強的磁性；但當外加磁場撤銷后，無剩磁，不再表現出磁性。磁性微球具有良好的表面效應和體積效應，選擇性和磁響應性很好、物理化學性質穩定并且有一定的生物相容性，表面改性帶有多種活性的功能基團，可以專一性地分離生物大分子。

于希[35]利用化學共沉淀方法制備了包覆表面活性劑的 Fe3O4磁性納米微粒MNPs，利用乳液聚合法聚苯乙烯磁性納米微粒（MNPs/PSt），結果2種微粒均具備超順磁性，其中Fe3O4MNPs 的飽和磁化強度為66.81 emu/g，MNPs/PSt 的為 38.82 emu/g 。

MSPE在操作繁瑣度和萃取率等方面都有令人滿意的結果，例如不必離心和過濾等，而且不存在堵塞柱子的問題。因此廣泛應用于藥物轉運、分離細胞、酶的固定、農殘檢測等領域中[36]。

8 柱切換技術

柱切換技術是色譜分析中處理復雜樣品的方法之一。利用切換閥改變不同的色譜系統，達到在線樣品凈化、組分富集等目的[37-39]。2個不同液相色譜柱之間的切換稱為液相色譜切換法，對生物樣品的藥物分析特別有用。

隨著分析儀器的不斷快速發展，便利了生物樣品前處理。優化生物樣品的處理方法可以直接影響到檢測結果的參考價值。生物樣品前處理方法的選擇應該考慮被測組分的理化性質、存在的大量內源性物質、代謝產物及共存藥物等干擾物質、回收率等因素。樣品的高通量化、采集樣品的無損化、消耗試劑的微量化，分析儀器的完全自動化以及環境的低污染化將是生物樣品前處理技術發展的方向。

9 展望

目前，在體內樣品的分析方法中，除了上述重點介紹的8種常用方法外，還有化學衍生化法、大孔樹脂方法、離子交換樹脂法、超臨界流體萃取法（SFE）、膜分離法、在線毛細管電泳法等，也有一些技術的結合，如固相萃取技術與超臨界流體萃取技術的結合、分子印跡技術與固相萃取技術的結合。這些技術都豐富了生物樣品分析的手段。實驗者可以根據分析的目的、樣品的理化性質、內源物是否有干擾、技術優勢等進行樣品的預處理方法的選擇。然而當前樣品前處理技術還很繁瑣，尤其在研究天然藥物在體內的各方面作用規律的指標時，有時會因為靈敏度不夠高等因素而無法做出分析，所以如何才能實現樣品分析的超高靈敏化、傻瓜化以及完全自動化將有很長的路要走。

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Research progress of pretreatment of biological samples

FENG Jian-nan， DU Shou-ying*， BAI Jie*， LU Yang， LIU Hui-min

（School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Suitable pretreatment of biological samples can truly reflect the role of law of the measured components played in the body and will provide experimental evidence for the studies on metabolic process， material basis of efficacy， mechanism of action， pharmacology， toxicology and the others. Biological samples include blood， urine， hair， tears， etc. There are also many samples processing methods， such as the direct protein precipitation， liquid-liquid extraction and solid phase extraction and so on.These methods could be used alone or combined.

篇7

關鍵詞：耕牛；血吸蟲病；滅螺；生態綜合防治

中圖分類號：S852.72 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013），01-0031-04

血吸蟲病是日本血吸蟲寄生于人和牛、羊、嚙齒類及一些野生哺乳動物的門靜脈系統的小血管內而產生嚴重危害的一種人畜共患寄生蟲病[1-3]。近年來受多種因素影響，咸寧市部分地方已達到傳播控制標準和傳播阻斷標準的地區出現疫情回升現象。為了解耕牛血吸蟲病綜合防治的效果，筆者對咸寧市部分地區耕牛血吸蟲病流行情況進行了調查，將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇

疫區所有耕牛均為試驗動物。

1.2 試驗分組與設計

將咸寧市四個地區（咸安、嘉魚、赤壁和通山）分為2個組。具體分組如下：赤壁因實施耕牛血吸病綜合防治項目作為試驗組；咸安、嘉魚、通山按照傳統方法進行防治（即：一年一度的血防普查，病牛進行治療，血檢陽性牛擴大化療）作為對照組。2008年兩個組的供試耕牛全部沒有采取生態防治措施；2009年試驗組實施耕牛血吸病綜合防治項目，對照組按傳統方法進行防治。

1.3 耕牛血吸蟲病農業生態綜合防治方法

綜合防治項目實施地（赤壁市）是我省尚未控制血吸蟲病流行的12個重疫區縣（市）之一，疫區人口達到12.4萬多人。近年來疫情形勢有反復和蔓延之勢，得到市委、政府和有關部門的高度重視。2008年9月，赤壁市血吸蟲病農業生態綜合防治項目得以立項，2008年10月-2009年9月實施。

1.3.1 水改旱項目

水改旱呈矩形田塊，農田排水溝渠分為干、支、斗、農、毛溝5級，干溝間距約為1 000～1 500 m；支溝與干溝垂直布置，間距約為400～500 m；斗溝與支溝垂直布置，間距約為200 m；農溝與干溝垂直布置，間距約為100 m；毛溝與農溝垂直布置，間距約為50 m；干溝旁布置3 m寬的田間道路，支溝旁布置2.5 m寬的田間道路，斗溝旁布置2 m寬的生產道路。各小田區的水經排水毛溝、農溝、斗溝、支溝、干溝流到大田區外，通過工程排水實現大田區水改旱工程。

1.3.2 養殖滅螺項目

項目實施地屬荒土地，由于長年積水，水草生長茂盛，釘螺繁殖速度快，成為了血吸蟲的疫源地，沒有農戶對其進行開發利用，地面一片荒蕪，沒有公用設施，有利于建精養魚塘，實施魚禽立體養殖，達到蓄水滅螺和養禽滅螺的目的。

1.3.3 家畜圈養項目

水改旱以后，農田耕作實行“以機代牛”，耕牛實行集中圈養。根據各鎮、處、場農民居住區布置形式和農民生活習慣的實際，耕牛采取集中圈養和分戶圈養。選址后進行挖屋基，建欄舍并種植牧草，家畜的飼養使用秸桿氨化青貯飼料。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 樣品的采集 血樣采集：血防普查時，每頭牛均采耳靜脈血，滴在濾紙上，制作血紙；糞樣采集：對血檢陽性者進行牛糞收集，用尼龍袋集卵孵化法3送3檢，發現毛蚴者為陽性感染牛。

1.4.2 耕牛血液檢測 采用金標免疫滲透診斷法。將反應板上的孔依次編號，取長條形反應板（10頭份/塊），用內徑約1 mm玻璃毛細管吸血紙浸出液，從標記有1、2號的孔開始點樣，玻璃毛細管輕貼膜0.5 s，向上移走玻璃毛細管，依此類推。每次連續點樣3～5塊反應板，然后先往點樣最早的反應板孔中滴加甲液1滴，間隔5～7 s滴加第2孔，即可保證每個點樣點的時間達3～4 min可滴加甲液，依次類推；待甲液滲入后每孔滴加乙液1滴，按點樣次序滴乙液；待乙液滲入后每孔滴加蒸餾水1滴。結果判定：紅色斑點判為陽性（+），粉紅色斑點判為可疑（±），黃色或無色斑點判為陰性（-）。血檢陽性率=血檢陽性頭數/樣本總數×100﹪。

1.4.3 耕牛糞便檢測 采用毛蚴孵化法。取血檢陽性牛的新鮮糞便100 g，置500 mL容器內，加水調成糊狀，通過40～60目銅篩過濾，收集濾液。將濾液收集于500～1 000 mL的燒杯中，加無菌水，靜置20 min，待糞渣和蟲卵下沉后，吸去上層液，每隔15 min換清水1次，直到水清澈為止。當水溫在15℃以上時，第一次換水后，應改用1%的食鹽水洗糞，當水溫在18℃以上時，全部洗糞和沉淀用水均應改用1%的食鹽水，以抑制毛蚴過早孵出。洗凈的含有蟲卵的糞便渣，即可用于孵化。將糞便渣傾入500 mL的三角燒瓶內，加入溫水（不可用鹽水）進行孵化。孵化時外界溫度以22～26 ℃為宜，室溫在20 ℃以上時，即無需加溫。樣品進行孵化后，經1、3、5 h各觀察1次，檢查有無毛蚴在瓶內出現。毛蚴為灰白色，折光性強的棱形小蟲，多在距水面下4 cm以內的水中作水平的或略斜向的直線運動。結果判定：有毛蚴者為陽性（+）；無毛蚴者陰性（-）。糞檢陽性率=糞檢陽性頭數/樣本總數×100﹪。

1.5 數據的統計分析

所有試驗數據均采用SPSS 8.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 耕牛血吸蟲病感染情況

通過2008年度耕牛血吸蟲病普查工作可見，咸寧市耕牛血吸蟲病依然存在。27個疫區鄉鎮（場、街道）、150個疫點（村、居委會）檢查了13 563頭牛，其中病牛數達299頭，感染率達2.2%。（感染率=病牛數/查病數×100%）。其中嘉魚、赤壁兩縣市比較嚴重，尤

其是赤壁市感染率達到4.4%（表1）。

通過2009年全市秋季血吸蟲病普查工作，檢測結果表明（表2），2009年咸寧市4個疫區縣（區、市）26個疫區鄉鎮（比2008年少了1個，因該區連續多年沒有發現被感染的牛，故不列入疫區鄉鎮）148個疫區村仍存在不同程度的疫情，疫區存欄牛15 687頭，查病15 190頭，查檢率達96.8%，確診病牛275頭，感染率為1.8%。

赤壁市的柳山湖鎮、黃蓋湖、車埠鎮、赤壁鎮通過血吸蟲病農業生態綜合防治措施實施后，其病牛數大為減少，感染率也大幅降低。而其他未實施生態綜合防治措施的鄉鎮，除新店、余家橋外，蒲圻辦、趙李橋、官塘驛3個鄉鎮耕牛血吸病疫情均出現反彈。2008年血防普查中蒲圻辦、趙李橋、官塘驛三個鄉鎮沒有發現病牛，而在2009年的普查中則分別出9頭、3頭、3頭病牛，感染率也在2%以上（表3）。

通過2008、2009年耕牛血吸蟲病普查工作可見，咸寧市耕牛血吸蟲病依然存在。調查的四個地區中，除通山以外，都存在不同程度耕牛血吸蟲的感染。耕牛血吸蟲病感染率在0.2﹪～5.0﹪（表4）。2008年與2009年相比較，通過實施綜合生態防治措施后，項目實施的地區赤壁的耕牛血檢陽性率和糞檢陽性率均顯著減少（P

3 小結與討論

3.1 綜合防治措施的作用

根據赤壁市柳山湖、黃蓋湖、赤壁鎮、車埠鎮等4個鎮實際情況，因地制宜采取綜合措施，以實施水改旱，開展養殖滅螺，采取家畜圈養，結合反復查治為主要控制措施。通過水改旱，開挖溝渠，將水田改為旱地，從而改變釘螺孳生的環境，從而達到消滅釘螺的目的；通過養殖來螺，將地勢低洼之地，通過開挖魚塘，先是將有螺草、土埋在塘堤里面，外面覆蓋1 m厚的無螺土，可以起到滅螺作用；再是在魚塘內實施魚禽立體養殖，達到蓄水滅螺和養禽滅螺的目的；家畜圈養，在14個村共建8 000 m2的牛舍將耕牛圈養，讓其與疫區隔離，從而阻斷疫情的傳播。通過兩年的實踐，從綜合治理前后耕牛感染率顯著降低等結果不難看出，綜合治理措施不失為控制此類地區耕牛血吸蟲病流行的有效措施。農業生態綜合防治措施，可以

很好消滅釘螺，保護易感動物，從而阻斷血吸蟲病疫情的傳播，其作用是長期的，不易反復的[4-7]。

3.2 血吸蟲病防治的主要困難和疫情回升的原因

吸蟲宿主和傳播環節多，單一的防病措施很難奏效。對人群和家畜進行同步化療是控制疫情的重要手段，但反復化療群眾接受程度下降；由于基層動物血防機構不健全、防治經費得不到保障、治療藥品短缺，家畜傳染源的查治難以開展，且管理難度大。本研究選擇咸寧市為試驗區，以實施水改旱，開展養殖滅螺，采取家畜圈養，結合反復查治為主要控制措施。通過兩年的實踐，從綜合治理前后耕牛感染率顯著降低等

結果不難看出，綜合治理措施不失為控制此類地區耕

牛血吸蟲病流行的有效措施。

藥物滅螺只是控制感染的應急措施，不能徹底解決釘螺控制問題，而且還會帶來環境污染。養殖滅螺和家畜圈養能有效地控制傳染源，對減少耕牛血吸蟲病流行起到明顯作用。自然環境因素復雜，防治難度大。長江流域洪澇災害頻繁，使湖區釘螺擴散加劇。山丘型地區釘螺孳生環境復雜，交通不便，滅螺難度大。此外，南水北調等大型水利工程建設對釘螺擴散和血吸蟲病傳播也存在潛在的影響。本研究實踐表明，依據不同地區的地形地貌，將水改旱、養殖滅螺和家畜圈養等措施與當地情況有效結合，是切實可行的。

血防科學研究不能滿足防治工作的需要。血防科學研究滯后于血防工作形勢的變化與發展要求，防治技術無突破性進展。急需開發研制高效、低毒、廉價、使用方便的滅螺藥物和血吸蟲病預防治療后備藥物，加快現場使用方便的血清學診斷方法和快速診斷試劑的研制，加強對可持續發展的血防策略的研究。

3.3 經濟與社會效益分析

我國血吸蟲病的防治策略的發展經過三個階段。第一階段是單一防治措施。如治療病人、病畜、滅螺、糞管。第二階段是進過調查研究和反復實踐，總結出預防為主的綜合措施和因時因地制宜的防治策略。第三階段是以化療為主的疾病控制策略[8，9]。以滅螺為主的綜合防治措施多年實踐證明是有效的，我國水網和山丘型流線區均是采用這一策略控制和阻斷血吸蟲病傳播的[10-16]。本研究中實施的生態綜合防治項目也是采用的這一策略，而且與咸寧市的地域面積、地貌特點、經濟發展水平和衛生教育水平等相符。

通過實施綜合防治措施，有效的控制耕牛血吸蟲病的疫情，也保護了人的健康。經過防治措施的實施，經濟效益明顯。①綜合開發水改旱的農田，統一規劃，統一種植；②養殖滅螺項目建設的精養魚池投產使用，為養殖戶增加收入；③耕牛死亡率降低，產仔率升高。同時，非常有利于農業水利建設。項目實施當年產生直接經濟效益360萬元，其中水改旱項目產生經濟效益170萬元，養殖滅螺項目產生經濟效益90萬元，家畜圈養項目產生經濟效益100萬元。社會效益更加廣泛：項目實施后，有效地消滅了釘螺，控制了人畜血吸蟲病的疫情，改善了當地的農業生產條件，搞高了農作物的產量、品質，增加了農民收入，加快了農村小康建設的步伐。

目前，咸寧市大部分地方防治耕牛血吸蟲病的方法是通過一年一度的血防普查：在疫區對耕牛進行血檢，血檢陽性者再進行糞檢，糞檢呈陽者確診為病牛。對病牛進行治療，對疫區其它牛進行擴大化療。從2008年度普查的結果來看，用傳統的方法進行防治，對于疫情較為嚴重的地方來說，很難控制疫情蔓延之勢，勢必要尋找新的防治方法，特別是生物防治法，將兩者結合起來。通過農業生態綜合防治措施的實施，改善了環境的同時，也很好的達到了滅螺的效果，達到了降低血吸蟲病爆發的目的，所以通過環境改變來防治血吸蟲病爆發是可行的。

通過對咸寧市2008、2009兩年耕牛血吸蟲病防治工作的調查研究，赤壁市因實施耕牛血吸蟲病的生物綜合防治措施，2009年的耕牛血檢陽性率和糞檢陽性率比2008年均明顯減少。故農業生態綜合措施項目的實施，有效降低了耕牛血吸蟲病的發病率。此法不僅效果好，有利于環境保護，且能長期發揮作用。咸寧市4個疫區，除通山外其他3個縣、市、區（咸安、赤壁、加魚）均屬長江中下游地區，且長江在其境內穿過，水網資源發達，地理水紋環境十分相似，耕牛血吸蟲病傳播途徑也十分相似。所以耕牛血吸蟲病的生物綜合防治措施（水改旱、養殖滅螺、家畜圈養）可在全咸寧市、全湖北省（長江中下游地區）疫區范圍推廣應用。

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