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關鍵詞：高效液相色譜儀；故障處理；處理方法

DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.01.182

0 引言

當前，液相色譜儀包含示差折光、二極管陣列、熒光、紫外等多種檢測器，其在輕工、食品、農藥、醫藥化工、生物等領域應用非常廣泛。高效液相色譜儀的自動化程度較高，其可實現對樣品的高靈敏度、高效和高速分離測定，其不僅能夠控制液相色譜儀的各項操作參數，而且可以科學處理色譜圖。為了確保高效液相色譜儀保持良好使用性能，應仔細分析故障原因，有針對性地進行解決處理。

1 高效液相色譜儀常見故障分析

1.1 高壓輸液系統故障

高壓輸液系統包括高壓泵、貯液器等部分，過濾器安裝在流動相輸液管頂部，貯液器主要用于盛裝流動相，一旦流動相、貯液器受到污染，往往會堵塞過濾器，導致基線發生波動，流速不穩定，而且色譜圖上還會顯示多余峰，使得基線底值提高，無法準確檢測出樣品的低濃度組分。高效液相色譜儀運行過程中高壓泵是其動力來源，高壓泵工作不穩定，往往會造成流量相抽取量反復變化，系統壓力變化較大，直接影響了高效液相色譜儀測定結果的準確性。高壓泵常見故障主要有柱塞桿磨損、密封圈滲漏和泵頭有氣泡。

1.2 進樣系統故障

進樣系統主要包括兩種：自動進樣器和手動進樣器，一般情況下，手動進樣器是六通閥，不管是自動進樣器，或者手動進樣器，在實際應用中易發生進樣閥堵塞故障，往往會造成進樣系統接頭滲漏、壓力不斷升高，導致進樣量準確性下降。

1.3 分離系統故障

分離系統是高效液相色譜儀的核心，而柱壓和柱效指標對于色譜柱使用壽命有著直接影響，若一支色譜柱的柱壓過高或者柱效過低，一般情況下，這種色譜柱就需要進行報廢處理，而色譜柱堵塞、鍵合相碳鏈斷裂等往往會造成這種情況。

1.4 檢測系統故障

檢測器是高效液相色譜儀的重要組成部分，其可以將樣品濃度轉換為電信號，紫外檢測器在日常檢驗中應用最為廣泛，在實際應用中往往會發生基線漂移、基線噪聲等故障。

1.5 峰拖尾故障

高效液相色譜儀在實際使用中，其色譜圖上有時會出現峰拖尾的情況，而造成這種情況的原因主要有：柱效下降、柱外體積較大、柱塌陷、硅羥基作用、峰干擾、柱超載等，這直接影響了高效液相色譜儀的檢測精度。

2 高效液相色譜儀故障處理方法

2.1 高壓輸液系統故障處理方法

對于專用貯液器，要定期用水、酸仔細清洗，然后使用超純水再蕩洗幾遍，若貯液器采用溶劑瓶，使用一段時間后應做好廢棄處理，防止滋生微生物，并且通過超聲波每月對流動相過濾器進行清洗，使用高效液相色譜儀專門的試液和試劑來配制流動相。使用流動相之前，通過超聲波進行脫氣，在高壓輸液系統中設置脫氣裝置，最大程度地控制氣泡對高效液相色譜儀的影響，并且高效液相色譜儀長時間采用含鹽流動相和運行往往會導致柱塞桿磨損和密封圈滲漏，所以使用合適溶劑洗出高壓泵緩沖液，防止鹽析出后嚴重磨損柱塞桿。

2.2 進樣系統故障處理方法

進樣系統應用過程中，要有針對性地處理樣品，利用高速離心機進行離心處理，然后通過0.45m濾膜進行過濾，對樣品的細小顆粒有效去除，從而延長閥使用壽命。并且為了避免進樣系統流動相中析出緩沖鹽，每次使用完高效液相色譜儀以后，對進樣系統使用不含鹽流動相進行反復沖洗。

2.3 分離系統故障處理方法

對于分離系統故障，應采取有效的處理方法，其一，在色譜柱pH允許使用范圍內合理控制流動相pH值；其二，使用色譜純試劑和超純水，樣品分析之前，通過針筒對樣品過濾，利用0.45m濾膜過流動相，流動相和樣品中的固體顆粒網往往會將色譜柱堵塞，造成柱壓升高，造成色譜峰形變寬；其三，使用在線過濾器或者保護柱，由于流動相和樣品過濾以后無法將固體顆粒物質全部消除，而一旦流動相將這些固體顆粒帶入色譜柱，會造成柱效下降、柱壓升高；其四，對色譜柱使用強溶劑進行沖洗，每次使用完高效液相色譜儀以后，利用過渡流動相沖洗色譜柱，先使用緩沖鹽流動相，然后再利用過度流動相，最后使用乙腈或者甲醇進行清洗，有效保存色譜柱。

2.4 檢測系統故障處理方法

對于檢測系統的基線漂移故障，應仔細檢查貯液瓶、色譜柱和檢測器是否受到污染，燈能量是否過低，檢測器溫度變化幅度是否太大，有針對性地采取有效措施。對于基線噪聲，檢查高壓泵的穩定性，檢測池是否存在氣泡和受到污染，使用高效液相色譜儀的專業溶劑，檢查檢測器和工作站輸出信號以及電壓穩定性。

2.5 峰拖尾故障處理方法

對于高效液相色譜儀的峰拖尾故障，應采取有效的處理方法：其一，及時更換柱，盡量在低腐蝕環境下使用，采用保護柱；其二，降低連接點，合理調整所有連接點，采用細內徑連接管；其三，在弱腐蝕條件下更換色譜柱；其四，設置在線過濾器，對燒結的不銹鋼進行更換；其五，降低流動相pH值，添加堿或者三乙胺鈍化柱，增加鹽或者緩沖液濃度；其六，調整流動相，清潔樣品；其七，增加柱直徑，降低樣品量，使用高容量固定相。

3 結束語

為了保持高效液相色譜儀良好的使用性能和穩定性，應仔細分析其常見故障，科學地進行分析，采用邏輯推理方法，采取有效、合理的故障處理措施，消除高效液相色譜儀故障問題，延長其使用壽命。

參考文獻：

[1]伍音茵.高效液相色譜儀的故障分析及處理對策[J].精細化工中間體，2013（02）：56-57+67.

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論文關鍵詞：高效液相色譜儀；水環境；監測；前景

一、高效液相色譜儀及其技術簡介

高效液相色譜（HPLC)也叫高壓液相色譜、高速液相色譜、高分離度液相色譜等。是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜儀的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器(能檢測色譜柱流出組分及其量的變化的器件。指機械的、電子的或化學器件，用于區分、記錄或指示環境中某一變量的變化，如溫度、壓力、電荷、電磁輻射、核輻射、粒子或分子等。)時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。

二、高效液相色譜儀的應用

高效液相色譜儀在水環境監測中的應用主要分為三個方面：一方面是對傳統監測項目指標的監測；一方面是針對水體中的有機物進行監測；另一方面是利用其高效分離的技術特點在對水體中污染物質總量的監測的基礎之上對不同價態及其形態的污染物進行分類定量監測。

（一）對傳統污染物的監測

對傳統污染物的監測主要是針對日常水體中常見污染物的重點監測。根據國家的相關要求及其本站的實際監測條件，對水體中主要污染物的監測包括了重金屬元素（銅、鋅、砷、汞、鎘、鉻等）、營養元素（氮、磷、鉀等）、特殊元素（硒、氯、硫等）。通過如上監測對水體的日常污染狀況進行把握與評價。同時，傳統污染物的監測還包括了對特定企業排污點的污水監測，作為其環保達標的重要依據。

（二）對水體中的有機物

在傳統的污染物的基礎之上工業以及農業淋容等多方面因素會對水體中造成一定的有機物污染，在針對有機物的污染監測過程中傳統的監測方法無法在精度與效率方面達到要求。在此方面應用高效液相色譜儀在對有機物進行定型的同時進行定量的監測。主要監測的項目包括了，工業有機污染物（氰化物、）揮發酚、石油類、總有機物等）、農業有機物（如殺蟲劑、除草劑、消化抑制劑）、特殊有機物（微生物代謝物、醫療污染物、生活污水等）。針對如上的有機物監測一方面能夠對水體中有機污染現狀進行評價，另一方面可以鑒別污染物種類進而對排查污染源提供一定的幫助。

（三）對不同價態及其形態的污染物的監測

同種化學元素的不同存在價態以及形態對其生物毒性的影響至關重要。比如鉻元素在水體中存在三價與六價之分，其中三價鉻毒性較小且對在較大濃度范圍內對人體有益，而六價鉻則表現為較強的生物毒性，在較低濃度下對人體造成較大危害。在水環境的監測過程中傳統的六價鉻的監測方法是利用六價鉻與二苯碳酰二肼的顯色反映進行檢測的。這種檢測方式由于收到氧化還原條件的影響容易造成較大誤差，進而使得對水體環境的判斷失準。采用高效液相色譜儀能夠同時監測同種元素的不同價態進而對水體的污染物及其毒性進行更好的定量分析，為后續的環境評價與治理奠定基礎。

三、高效液相色譜儀的特點

（一）高效液相色譜儀的準確性

與傳統的檢測方法相比較，高效液相色譜儀具有更高的準確性，這種準確性主要表現在兩個方面：一方面高效液相色譜儀為全自動檢測儀器，在避免了人為誤差出現的同時降低了機械誤差。而機械誤差經過標準物質的校訂之后可以得到很好的控制，這就決定了高效液相色譜儀在監測過程中誤差較小。同時，在另一方面高效液相色譜儀在監測原理上同樣優于傳統的監測方法，以火焰原子吸收測量水體中的重金屬濃度為例，其以火焰原子激發的峰值為測定濃度結果，在測定過程中的波動式消耗會使得測量結果較實際濃度偏低的現象。而采用高效液相色譜儀則是利用全部曲線的面積來代替相對體積內的總量，在計算優化方面更具備準確性。

（二）高效液相色譜儀的高效性

高效液相色譜儀的高效性主要表現為三個方面：

1、高效液相色譜儀的檢測效率本身，樣品從進樣到出結果僅需要30秒作用的時間對于單向測定，此時間還具有一定的下降空間。

2、高效液相色譜儀的多重測定效率。在針對多項目的測定過程中。利用高效液相色譜儀進行測定可以單次進樣多指標共同檢測的效果，大大的降低了進樣的重復性工作，提高了整體的工作效率。 　3、高效液相色譜儀的連續進樣機制，在前一樣品轉移到檢測室后，后一樣品既可以做進樣處理，在監測相同的項目指標的情況下，連續進樣與單獨進樣的監測效率提高越30%。

此外，通過高效液相色譜儀與質譜儀的連用可以實現在定量分析的基礎之上進行定性的監測。一方面省略了定性檢測的二次步驟，另一方面降低了樣品前處理的難度與過程。進而，降低了監測的時間。

（三）高效液相色譜儀的廣泛性

高效液相色譜儀的廣泛性主要表現為對監測物質的廣泛性，其監測項目幾乎涵蓋了水體環境監測的所有基礎項目。包括了重金屬的測定、營養元素的測定、其他離子的測定、不同價態的測定、有機物的測定等等諸多方面。尤其是其針對有機物的測定方面還可以細致劃分為多環芳烴類化合物的測定、酚類化合物的測定、苯胺類化合物的測定、鄰苯二甲酸酯類化合物的測定、氯聯苯和鹵代化合物的測定、苯基脲類化合物的測定、酞酸酯類化合物的測定等等。幾乎涵蓋了所有類別的污染物種類，使得在實際的操作過程中可以根據不同的監測目標與監測目的進行合適的項目選擇。

四、高效液相色譜儀的應用前景

（一）與評價軟件連用

高效液相色譜儀與評價軟件連用主要是利用高效液相色譜儀的數據收集功能以及數據計算功能。在高效液相色譜儀對數據計算的基礎上結合電腦的評價軟件對獲得數據進行進一步處理的過程。通過與評價軟件的連用可以達到在監測的過程中根據不同的監測目的進行合理的評價結果輸出的方式。進一步使得環境監測具有高效化與準確性。

在具體的操作層面其可能應用主要分為兩個方面：一方面是利用評價軟件的評價功能對超標樣品進行篩選。在測定前利用標準物質對環境標準進行測定。而在測定的過程中利用評價軟件的篩選功能自動對超標樣品進行報警或者標紅處理，而對于未超標樣品則可以采用忽略的處理方式。最終的數據輸出結果為超標樣品編號與濃度。這樣能夠有效的降低環境監測站的工作強度。

另一方面是利用預設的國家標準以及不同污染物的環境效應權重針對同一樣品的權指標測定項目進行評價報告的生成。在測定的過程中自動的對比國家環境標準，進而生成科學的環境評價報告，為后續的環境治理提供一定的依據。

（二）與質譜儀連用

高效液相色譜儀只能夠定性的分析被監測物質，或者通過對吸收光譜的設定來測定特定物質的濃度，而對于未知物質的監測則存在一定的不足。此方面的缺陷使得其在使用的過程中測定項目具有一定的盲目性。通過高效液相色譜儀與質譜儀的連用可以在同一樣品測定的情況下測定未知樣品中的特定物質種類以及物質濃度。方便并拓寬了水環境監測的廣度。

（三）與連續進樣裝置的連用

高效液相色譜儀具有一定的連續進樣能力。但是，此種進樣依舊采用手動的模式進行。在手動模式下，一方面對進樣效率的提高程度不顯著。另一方面則表現為對進樣的準確程度不精確。因此，采用高效液相色譜儀與連續進樣裝置的連用在進一步提高工作效率的同時，保障了進樣的準確性與測定的自動化程度。在效率與精度方面對高效液相色譜儀的檢測均是一種提高。

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[關鍵詞]高效液相色譜法； 大豆異黃酮；含量測定

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2015）06-0197-02

曾經1999年10月FDA了第11個健康聲明：每人每天食用25g黃豆，可以減少發生冠心病的風險。而近年來一些研究表明，大豆及豆制品具有更加廣泛的生物功效，如抗腫瘤、防治骨質疏松和增強記憶等，這些功能均與大豆異黃酮有關。大豆異黃酮與防治一些和雌激素水平下降有關的疾病，延緩女性衰老、改善更年期癥狀、骨質疏松、血脂升高、乳腺癌、前列腺癌、心臟病、疏松癥、心血管疾病等。

大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次生代謝產物，是生物黃酮中的一種，也是一種植物雌激素。它主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，種皮中含量極少。80%～90%的異黃酮存在于子葉中，濃度為0.1%～0.3%。胚軸中所含異黃酮種類較多且濃度較高，為1%～2%，但由于胚只占種子總重量的2%，因此盡管濃度很高，所占比例卻很少（10%～20%）[1-3]。迄今為止，共發現有12種成分，分為游離型的苷元和結合型的糖苷兩類。苷元占總含量的2%～3%，包括軟料木黃酮、黃豆苷元和黃豆黃素3種[4]。糖苷9種，以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二?；咸烟擒?種形式存在，其中染料木苷、黃豆苷、丙二酰金雀異黃苷、丙二酰大豆苷4種成分約占總量的83%～93%[5]。

目前國內外測定大豆異黃酮的方法主要有比色法、紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法（GC） 、紫外分光光度法和高效液相色譜法（HPLC）等。但紫外分光光度法常以染料木苷標準品來表征大豆異黃酮總濃度，該方法雖然簡便易行、成本低廉但僅適用于粗略測定異黃酮總量，結果有一定偏差[6]。薄層色譜法具有取樣量少，操作簡單、分離效果好等優點，但其薄層顯色劑用量難于準確控制，人為誤差大?？导僛7]等以6種SDS、正丁醇、正庚烷、水微乳液作展開劑，通過聚酰胺薄層色譜法分離和檢測13種黃連藥材、飲片及中成藥，并且觀察了微乳液類型副I分辨率的影響，結果表明，含水量75%的微乳液為適宜的展開劑。GC 法采用了樣品衍生后進行測定，存在操作煩瑣，條件不易控制、雜質干擾嚴重等問題；高效液相色譜法則具有樣品不需要預處理、測定快速、定量準確的優勢。本研究采用高效液相色譜法（HPLC），甲醇s乙腈s磷酸水（pH=3.0）=30s10s60作為流動相，同時對大豆異黃酮4種主要成分大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素進行分離定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

島津LC10AT高效液相色譜儀：附帶SPD-10A紫外檢測器，色譜柱為安捷倫 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），0.45？m微孔濾膜過濾器，JP-030S型超聲波清洗器，TU-1810紫外-可見分光光度計，BSA224S-CW分析天平。大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量均≥98%，且均購置于曼思特生物科技有限公司。乙腈色譜純，甲醇色譜純。樣品大豆異黃酮軟膠囊購置于深圳醫藥公司。

1.2 標準溶液制備

1.2.1 大豆異黃酮標準貯備溶液：稱取大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素各1mg，置于25mL容量瓶中，加入適量甲醇，經超聲處理10min，再用甲醇定容至刻度，制成400μg/mL標準溶液。

1.2.2 大豆異黃酮混合標準使用溶液：吸取1.2.1中標準貯備液，配成200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL的混合標液，使用甲醇定容。

1.3 供試液制備

膠囊去殼，將內容物混合均勻，稱取樣品0.05g-0.5g（精確至0.1mg），加入適量80%乙醇。超聲提取30min，加水定容，離心分離5-10min，取上清液經0.45μm微孔濾膜過濾后，收集濾液待測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件確定

2.1.1 檢測波長選擇

通過紫外掃描，可知四種大豆異黃酮在260nm處均有較大吸收，故選取檢測波長260nm。

2.1.2 流動相的選擇

分別采用甲醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作為流動相。甲醇-水作流動相時發現染料木素峰有嚴重的拖尾現象，且大豆苷和大豆苷元無法完全分開。當流動相pH3.0時，大豆苷和大豆苷元能很好的分開，但是染料木苷有前出峰現象，當流動相中加入一定比例的乙腈時，這種現象能夠很好的改善。因此流動相選擇甲醇s乙腈s磷酸水=30s10s60。

2.1.3 色譜條件確定

根據上述實驗，確定本實驗的色譜條件為：流動相為甲醇s乙腈s磷酸水（pH3.0）=30s10s60，流速為：1.0mL/min，波長：260nm，進樣量：10μL，柱溫：30℃。

2.2 檢測方法的驗證

2.2.1 線性關系考察

分別精密吸取一系列濃度范圍的對照品混合溶液，進樣量10μL。按照2.1.3條件注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸?；貧w方程及線性范圍見表1。

大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的理論塔板數分別為2412、2402、6803和7115，其理論塔板數顯示各成分的分離程度，能夠滿足檢測的需要。在進樣量為10？L時，四種大豆異黃酮最低檢測濃度均為：2.5μg/mL。

2.2.2 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液10？L，每隔8h，按照2.1.3項色譜條件進樣一次，共測6次，測定峰面積，結果大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的RSD分別為1.56%、2.03%、1.05%和2.37%。表明48h內測定結果穩定性良好。

2.2.3 重復性試驗

取同一樣品，按照1.3制備供試液，按照2.1.3項色譜條件，分別測定四種大豆異黃酮日內含量重復性和日間重復性，結果分別見表2和表3。樣品在一天時間內重復測定6次完成其日內重復性。每隔2天測定一次，共測定3次完成日間重復性。表2和表3的結果顯明本方法精密度好，準確度高，且操作簡便，適合推廣應用。

2.2.4 回收率試驗

稱取已知含量的同一樣品共9份，每3份為1組，按高、中、低3個水平分別加入對照品溶液，按照1.3制備供試液，按照2.1.3的色譜條件進樣，進行回收率試驗。回收率見表2。

3 結論

本方法討論了用不比例的醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作流動相，結果顯示甲醇s乙腈s磷酸水=30s10s60作流動相時，四種大豆異黃酮能很好的分開。對方法的重復性考察，在6天時間內方法是穩定的，重復性好，精密度高。分別對四種大豆異黃酮的回收率加以考察，回收率均在90%以上，表明方法可操作性高。

本方法用高效液相色譜法同時測定4種大豆異黃酮苷元的含量，結果準確、可靠，為大豆異黃酮的定量測定提供了一定的支持。

參考文獻

[1] Wang HJ， Murphy PA. Isoflavones composition of American and Japanese soybeans in Lowa： effects of variety. Crop year， and location. J Agric Food Chem， 1994， 4：1674～1677.

[2]楊薇.大豆植物性雌激素的構效關系及藥理作用[J].中國新藥雜志，2001，10（12）：892.

[3]董懷海，谷文英.高效液相色譜-質譜法在大豆異黃酮測定中的應用[J].糧食與飼料工業，2002，（5）：48～50.

[4]張玉梅，孫學斌，高旭年.紫外分光光度法測定大豆總異黃酮的含量[J].中國食品衛生雜志，2000，12（4）：7～9.

[5]郝青南，馬超，馬兵鋼. 大豆異黃酮的生理功能及其分離檢測方法研究進展[J].中國醫藥生物技術，2007，10（2）：383～385.

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關鍵詞：恩替卡韋 對映異構體測定 高效液相色譜法

Enantiomers of Entecavir by HPLC

Zhao Hai-qiao Wu Shuang-jun Fu Jian Su Gui-yong

（Shandong Fangming Pharmaceutical Group CO.，LTD.，Dongming 274500 ，China）

Abstract：Objective To establish a method for the enantiomers of Entecavirby HPLC.Methods The determination was carried out on CHIRALPAK AD-H，with Hexane - Isopropanol -ethanol - trifluoroacetic acid （70：10：：30： 0.5） as the mobile phase at the flow rate of 0.8ml？min-1 .The detection wavelength was 254nm. Results The method showed good linearity with a correlation coefficient （r） of 0.9999； the precision and stability were satisfactory with all RSDs below 2%. Conclusion This method is an accurate，fast and simple method for the enantiomers of Entecavirtablets.

Key word： entecavir Enantiomers HPLC

恩替卡韋（Entecavir）為最新抗乙肝病毒的一線藥物，恩替卡韋是環戊酰鳥苷類似物。II/III期臨床研究表明，成人每日口服0.5mg能有效抑制HBV-DNA復制，療效優于拉米夫定；III期臨床研究表明，對發生YMDD變異者將劑量提高至每日1mg能有效抑制HBVDNA復制。對初治患者治療1年時的耐藥發生率為0，但對已發生YMDD變異患者治療1年時的耐藥發生率為5.8%。我國SFDA也已批準用于治療慢性乙型肝炎患者。恩替卡韋對映異構體測定目前還未有報道，本文建立的方法，方法簡便，結果可靠。

一、儀器與試藥

1.儀器 日本島津 SPD-20A高效液相色譜儀。

2.試藥 恩替卡韋對照品（山東方明藥業集團股份有限公司，1301001）；正己烷、三氟乙酸、無水乙醇為色譜純；對映異構體對照品（山東方明藥業集團股份有限公司，1205001）；恩替卡韋（山東方明藥業集團股份有限公司；批號：1310001、1310002、1310003）

二、方法與結果

1.色譜條件

色譜柱為CHIRALPAK AD-H （250mm×4.6mm，5μm），以正己烷-無水乙醇-三氟乙酸（70：30：0.5）為流動相，流速為0.8ml﹒min-1，檢測波長為254nm，柱溫為30℃，進樣量為20μl。

2.供試品溶液的制備

取恩替卡韋對照品約20mg，精密稱定，置20ml容量瓶中，加稀釋劑（正己烷：無水乙醇=1：1）溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

3.對照溶液的制備

精密量取恩替卡韋供試品溶液0.1ml，置100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

4.專屬性試驗

為考察空白溶劑對本品異構體檢測的影響，進行專屬性試驗。取恩替卡韋對映異構體及恩替卡韋對照品各約5mg，分別置兩個100ml量瓶中，加稀釋劑適量超聲使溶解，放冷至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取分離度試驗溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗結果表明，空白溶劑不干擾本品異構體的檢測。恩替卡韋與其對映異構體能有效分離。

5.線性關系考察

通過試驗考察本品對照溶液濃度與峰面積在一定范圍內是否呈線性關系。①線性儲備液的配制：取恩替卡韋對照品約25mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加稀釋劑超聲使溶解并稀釋至刻度；精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。②樣品溶液的配制：精密量取線性儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml，分別置10ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得系列線性溶液。③測定方法：精密量取上述樣品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用最小二乘法，以恩替卡韋峰面積（A）為縱坐標，其濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸。結果顯示本品在濃度為0.10μg /ml～2.00μg /ml的范圍內與峰面積具有良好的線性關系，回歸方程為y=74478x-3302.1，相關系數r=0.9999。

6.精密度試驗

以在相同條件下，由同一分析人員對同一樣品重復進樣6次峰面積的偏差為考察目的，配制本品0.1%對照溶液進行精密度試驗。結果顯示RSD為0.51%，小于2%，表明進樣精密度良好。

7.穩定性試驗

樣品檢測過程中可能會將樣品溶液在室溫里放置數小時，為考察樣品溶液在室溫放置的穩定性，進行溶液穩定性考察。試驗結果顯示，供試品溶液室溫放置8小時，主峰峰面積的RSD為0.75%，小于2.0%，結果表明，樣品溶液在8小時內穩定性良好。

8.樣品測定

對批號為1310001，1310002，1310003的恩替卡韋樣品，按照“2.2及2.3”項下方法制備供試品及對照溶液，結果均未檢出。

三、結果與討論

1.流動相的選擇

剛開始選正己烷-無水乙醇（1：1），結果發現主峰出峰時間太長，改用正己烷-無水乙醇-三氟乙酸（60：40：0.1）分離效果好，且峰形比較好，故選擇該流動相。

2.檢測波長的選擇

以無水乙醇為溶劑，配置 0.05 mg·mL的溶液，在 200～400nm 范圍內掃描，結果表明，在 254nm 波長有最大吸收，故將 254nm 作為檢測波長。

參考文獻

篇5

關鍵詞 粉葛； 高效液相色譜電噴霧質譜； 同分異構體； 源內碰撞誘導解離

1 引 言

粉葛（Radix puerariae thomsonii）為豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根, 味甘, 辛、涼,有解肌退熱、透疹、生津止渴、通經活絡之功效 \。粉葛自古與野葛同作葛根用。研究發現, 粉葛與葛根（野葛）HPLC指紋圖譜\及臨床應用\存在較大差別, 2005版中國藥典首次將粉葛與葛根（野葛）分列作為中藥材記載。粉葛中主要成分為異黃酮類化合物, 大部分以苷的形式存在, 主要包括：葛根素、3′羥基葛根素、大豆苷等\, 其主要結構見表1。該類化合物中存在多對同分異構體, 主要分為碳苷和氧苷兩類化合物。同分異構體結構相似, 極性相近, 分離難度大。分離和鑒別中藥中同分異構體化合物, 一直是藥物分析的難題。

高效液相色譜質譜聯用（HPLCESIMS）技術結合了色譜與質譜的優點, 可有效分析復雜混合物中的單個和多個組分\。文獻\采用高效液相色譜（二極管陣列）/電噴霧質譜聯用系統（HPLCESIMS）方法分析葛根中異黃酮類化合物。但對粉葛中化合物質譜分析尚未見報道。本研究采用HPLCPDAESIMSn技術鑒別分析了粉葛中C苷和O苷兩類化合物, 建立區分粉葛中異黃酮類化合物同分異構體的電噴霧質譜方法。表1 粉葛中主要異黃酮類化合物

譜配有電噴霧離子源（ESI）；高效液相色譜儀系統（Surveyor HPLC）包括 Surveyor PDA Plus檢測器、Surveyor AutoSample Plus自動進樣器、Surveyor MS Pump四元泵； Xcalibur 2.0化學工作站軟件； Mass Frontier 6.0軟件。

粉葛藥材購于合肥市當地藥店, 經安徽中醫學院藥學院中藥教研室王德群教授鑒定為豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根；葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所, 批號 0752200509）; 乙腈、甲酸（色譜純, 美國Merck公司）, 實驗用水為亞沸蒸餾水。

2.2 樣品處理

篇6

脫氫乙酸(dha，dehydroacetic)，別名 二乙酰基乙酰乙酸，固態呈白色或淡黃色結晶粉末，無嗅、無味、熔點108～110℃，沸點270℃，是一種低毒高效防腐、防霉劑。在酸、堿條件下均有一定的抗菌作用，尤其對霉菌的抑制作用最強。我國自20世紀70年代中期開始用于食品防腐劑至今，曾用于果汁、醬菜、腐乳、人造奶油、乳酸菌飲料、果醬等食品的防腐劑[1]。雖然它的抗菌作用是有效的，但是它的毒性較大的缺點卻限制了脫氫乙酸的廣泛應用。脫氫乙酸能迅速被人體所吸收，進人人體后即分散于血漿和許多器官中，有抑制體內多種氧化酶的作用。目前，脫氫乙酸的安全性受到質疑，國際上已明確禁止使用，我國在一定范圍內允許其使用，但最大允許使用量為0.3g/kg[2]。目前檢測脫氫乙酸的國標方法為氣相色譜法[3]，前期樣品處理過程涉及到有機溶劑萃取、濃縮等步驟，操作起來比較麻煩，而且脫氫乙酸還容易造成色譜峰出現拖尾現象，使得難以獲得準確的定性和定量的結果[4]。應用高效液相色譜測定食品中脫氫乙酸的方法已見報道，比如采用超聲萃取、氫氧化鈉溶液浸泡等方法萃取月餅中的脫氫乙酸后再注射到色譜柱進行分離測定[5]。這些研究為應用高效液相色譜法測定果汁、罐頭、瓶裝腐乳等液態食品中的脫氫乙酸做了探索性的工作。本研究在國標gb/t 5009.1212003的基礎上，通過對目前市場上廣泛銷售的多種液態食品中的脫氫乙酸以高效液相色譜的方法進行分析，取得了比較滿意的結果，克服了氣相色譜法前處理復雜以及污染性大的缺點。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品、主要儀器與試劑

參加測定的樣品主要包括目前市場上銷售的果汁、腐乳、罐頭以及酸奶。hp1100型高效液相色譜儀、紫外分光光度計(上海光譜儀器公司);快速混勻器。甲醇(hplc級，dikma公司);甲醇(分析純，國藥);碳酸氫鈉(優級純，國藥);脫氫乙酸(國家標物中心);脫氫乙酸標準溶液：精密稱取脫氫乙酸標準品100 mg，用甲醇定溶至100ml。再用甲醇稀釋成1、5、10、15、20、30 mg/l的標準系列溶液，經0.45μm濾膜過濾。測定用水為二次蒸餾水。

1.2 樣品處理

果汁和酸奶混勻后直接稱取，腐乳和罐頭樣品需要先將固體物粉碎后再混勻。預先混勻的樣品稱取大約5.0g，加入到25.0ml容量瓶中，再加入10ml 2%的碳酸氫鈉溶液，用雙蒸水稀釋至刻度，搖勻。靜置10min后將上清液過0.45μm濾膜，以10μl進樣器加入到液相色譜儀測定。

1.3 色譜條件

色譜柱c18(5um,250×4.60mm);柱溫25℃;流動相選用甲醇0.02mol/l乙酸銨(5:95);流速1.0ml/min;進樣量10ul;檢測波長310nm;按照這種條件進行分析，以保留時間定性，以峰面積定量，測定樣品中脫氫乙酸的濃度。

1.4 結果計算

待測樣品中脫氫乙酸的含量(g/kg)=c×v×10-3/m

式中，c:樣品中脫氫乙酸的濃度(mg/l);v: 樣品體積(ml);m:樣品質量(g)

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

用紫外分光光度計對脫氫乙酸進行全波長掃描檢測到兩個吸收峰，在310nm處有最大吸收，在230nm處有次強吸收。在310nm處的干擾比在230nm處要小，背景吸收少，因此選擇310nm作為檢測波長。標準品及待檢樣品中的脫氫乙酸的檢出峰色譜圖見圖1，脫氫乙酸的保留時間在8.5min左右。

2.2 流動相的選擇

液相色譜柱c18分析中常用的流動相有甲醇磷酸鹽緩沖溶液系統、甲醇硫酸溶液系統以及甲醇乙酸鹽溶液系統。參考以前的研究結果，從流動相的本底吸收、靈敏度的影響和色譜柱的壽命等方面來考慮，本研究選擇了甲醇-0.02mol/l乙酸銨(5:95)。在流動相中加入甲醇，可以提高出峰的對稱性，隨著甲醇量的增加，出峰時間明顯加快，為了避開樣品中其它成分的干擾，將甲醇的比例調整到5%時，脫氫乙酸的出峰時間較為理想，且不受雜質的干擾。

2.3 測量精密度和回收率

取同一罐頭樣品10份，每5份添加同一個濃度的脫氫乙酸標樣，分別進行hplc分析。從表1的結果可以看出這種方法有較好的重復性和較高的回收率，可以用來進行定量分析。

2.4 線性實驗和靈敏度分析

取同一果汁樣品10份，每份約5.0g，置于25ml容量瓶中，分別加入脫氫乙酸標準液(5mg/l)1ml、2ml、3ml、4ml和5ml，樣品按照標準步驟處理后取10ul進入色譜柱測定，以出峰面積對脫氫乙酸濃度進行回歸分析，結果表明脫氫乙酸濃度與色譜峰面積有良好的線性關系，線性相關系數為0.9993。以信噪比(s/n)為3測得各成分的最低檢出限為0.25mg/kg。

2.5 樣品的測定

取目前國內銷售的液態食品4種，每種選取3種不同的品牌按照前面介紹的方法進行hplc分析，結果見表2?？梢钥闯?，一般酸奶中并沒有添加脫氫乙酸，因為酸奶的保質期通常只有半個月到1個月。果汁中也基本不含脫氫乙酸，而在選取的腐乳和罐頭中則添加了少量的脫氫乙酸，但是都遠低于最大添加量?？傊?，該法簡便快速，可以在相應類型的食品檢驗中推廣使用。表2 常見的4種液態食品中脫氫乙酸的含量測定結果

【參考文獻】

 

1 駱萌. 脫氫乙酸及相關化合物生產技術. 化工中間體，2004，1(7)：31～33.

2 明立艷，張忠義. 高效液相色譜法測定食品中脫氫乙酸含量.食品研究與開發，2009，3(30):106～108.

3 衛生部食品衛生監督檢驗所. gb/t 1494194 食品中脫氫乙酸的含量測定. 北京：中國標準出版社，1994.

4 張輝珍，馬愛國，梁惠，等. 高效液相色譜法測定食品中脫氫乙酸的方法研究. 衛生研究，2007，6(36):748～750.

篇7

【摘要】

目的延胡索乙素作為對照品，建立高效液相色譜（HPLC）法控制復方元胡止痛膠囊的質量。方法采用Alltima C18色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mn），用甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）為流動相，檢測波長280 nm；柱溫30℃；流速1.0 ml/min。結果延胡索乙素含量在0.102 9～1.028 8 μg范圍內呈良好線性關系，得回歸方程Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7，平均加樣回收率及RSD分別為101.17%和1.02%。結論以延胡索乙素為對照品，采用HPLC法控制復方元胡止痛膠囊質量的方法簡便快速、準確可靠、重復性好，專屬性強。

【關鍵詞】 復方元胡止痛膠囊；高效液相色譜； 延胡索乙素

Abstract：ObjectiveTo establish the method for determining the content of tetrahydropalmatine in complex Yuanhu Zhitong capsule by HPLC. MethodsThe separation was performed on Alltima C18 column (5μm， 4.6mm×250mm) with methanol-H2O -triethylamine (65∶35∶0.5) as mobile phase .The detection wavelength was at 280 nm， the column temperature was 30 ℃， and the mobile phase speed was 1.0ml per min.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.1029 to 1.0288 μg for the tetrahydropalmatine content and the linear equation was y＝4.840 1x +0.089 5(r=0.999 7). The average recovery rate was 101.17% and the relative standard deviation was 1.02%. ConclusionThe method is simple，rapid，accurate and reproducible.It can be used for the determination of tetrahydropalmatine content complex Yuanhu Zhitong capsule.

Key words：HPLC； Rhizoma Corydalis Decumbentis； Protopine； Content determination

復方元胡止痛膠囊是由延胡索（醋制）、香附（醋制）、川楝子、徐長卿4味藥組成的中藥復方制劑，是在復方元胡止痛片的基礎上經劑型改變而來，功能疏氣止痛，可用于肝胃氣痛，胃脘脹痛，胸肋痛，月經痛［1］。延胡索為方中君藥，現代研究表明，其主要有效成分為生物堿，其中以延胡索乙素的鎮痛作用較強，另外還有延胡索甲素（d-紫堇堿）、延胡索丙素、延胡索丁素（1-四氫黃連堿）、延胡索戊素（dl-四氫黃連堿）、黃連堿、非洲防己堿、d-海罌粟堿等［2］。為了提高產品的質量可控性，我們建立了HPLC測定樣品中延胡索乙素含量的質量控制法?，F報道如下。

1 器材與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)：P200 II型高壓恒流泵，UV200 II 紫外可變波長檢測儀，Rheodyne 7725i 高壓六通進樣閥，20 μl定量環；HW色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；百萬分之一電子天平（瑞士Mettler公司M3型）。

1.2 試藥

復方元胡止痛膠囊（由本實驗室自制）；延胡索乙素對照品（供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號0726-200208）；甲醇為色譜純（中國醫藥集體上?；瘜W試劑公司）；三乙胺（中國醫藥集體上海化學試劑公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Alltima C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mn）；流動相為甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5），使用前用孔徑為0.45 μm的有機濾膜減壓過濾，超聲20 min；檢測波長280 nm；柱溫30℃；流速1.0 ml/min；進樣量10 μl。

2.2 可行性實驗精密稱取供試品2 g，精密加入濃氨試液-甲醇（1∶20）50 ml，稱定重量，回流90 min（75℃），放冷，再稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1∶20)補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液25 ml置水浴鍋上蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至5 ml，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為HPLC檢測的供試品溶液。取配制好的延胡索乙素對照品溶液、供試品溶液分別進樣，原兒茶醛峰保留時間為9.275 min（見圖1～3）。由圖1～3可知，延胡索乙素保留時間為16.5 min左右，與其它組分分離很好，且陰性對照無干擾峰。理論板數以延胡索乙素計算為3 000。

2.3 線性關系的考察精密稱取延胡索對照品1.286 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.051 44 mg/ml。從中分別精密吸取2，5，10，15，20 μl注入色譜儀，測定其峰面積，以延胡索乙素進樣量為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。見圖2。由圖2可知，延胡索乙素在0.102 9～1.028 8μg范圍內進樣量與峰面積有良好線性關系，回歸方程為Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7（n=5）。

2.4 精密度實驗精密吸取對照品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積，重復測定6次，RSD為0.64%。結果見表1。結果表明精密度好。表1 精密度測定結果（略）

2.5 樣品回流時間考察取本品50粒，去膠囊殼后，混勻，取約2 g（批號20040501），精密稱定，稱取4份，分別置平底燒瓶中，精密加入濃氨-甲醇（1∶20）50 ml，密塞，稱定重量，分別回流30，60，90，120 min（75℃），放冷，再稱重，用濃氨-甲醇(1∶20)補足減失的重量，搖勻，過濾，精密取續濾液25 ml置水浴鍋上蒸干，殘渣用甲醇溶解定容至5 ml，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。依上述的方法測定。結果見表2。由表2可知，樣品回流90 min即可。表2 不同回流時間測得的延胡索乙素含量（略）

2.6 穩定性實驗取供試品溶液（批號20040501），間隔一定時間進針1次，共考察12 h，測定延胡索乙素峰面積積分值，結果表明本品12 h內穩定，RSD為0.97%。結果見表3。表3 穩定性實驗結果（略）

2.7 重復性實驗取本品50粒（批號20040501），去膠囊殼后，稱定重量，混勻，稱取5份，2 g/份，精密稱定，按供試品制備方法，制備供試品溶液，照樣品含量測定方法測定。結果見表4。結果表明本測定方法重復性較好。表4 重復性實驗結果（略）

2.8 加樣回收率實驗取本品已知含量，同一批號（批號20040501）樣品共6份，每份約1 g，精密稱定，置平底燒瓶中。另取延胡索乙素對照品用濃氨試液-甲醇(1∶20)配制成濃度為0.055 mg/ml的溶液，每份樣品中精密加入50 ml此溶液，稱定重量，回流90 min，放冷，再稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1:20)補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液25 ml置水浴鍋上蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至5 ml，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

照上述供試品制備方法制備供試品溶液，按含量測定方法測定延胡索乙素含量，按以下公式計算回收率。結果見表5。結果表明本法回收率較高，方法可行。表5 延胡索乙素含量測定加樣回收率的實驗結果（略）

2.9 樣品含量測定按上述方法制備供試品溶液和對照品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，依上述色譜條件測定10批樣品延胡索乙素的含量（n＝4）。結果見表6。由表可知，本品的延胡索含量為0.068 5～0.083 5 mg/粒，暫定本品每粒含延胡索乙素（C21H25NO4 ）不得少于0.05 mg。表6 樣品含量測定結果（略）

3 討論

延胡索對中樞神經系統具有明顯的鎮痛作用，并能使肌肉松弛具有解痙效應，口服能產生類似嗎啡以及可待因的效果，能緩解一般神經痛、頭痛、腰痛、關節痛、月經痛、腫瘍疼痛等。延胡索乙素是延胡索生物堿中具有較強鎮痛作用的成分，因此選擇延胡索乙素作為控制質量標準的指標之一，有一定意義。

在原劑型復方元胡止痛片的部頒標準中，只有3個理化性質鑒別，專屬性不強，也沒有含量測定項，顯然已經不符合我國中醫藥現代化的要求。本實驗室在參考文獻［4～6］的基礎上，先后考察了不同的預處理方法與流動相，最終選用了甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）為流動相，分離效果好。方法學考察結果表明，采用HPLC法測定延胡索乙素在復方元胡止痛膠囊制劑中的含量，穩定性好、精密度高、結果可靠、專屬性強，而且它是一個主要的活性成分，這樣就可以更好地控制產品質量，使產品更符合我國中藥現代化的要求。

參考文獻

［1］中華人民共和國衛生部藥政局.中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑，第7冊［S］.

［2］中國藥材公司. 中國常用中藥材［S］.北京：科學出版社， 1995：289.

［3］徐婷， 金昔陸， 曹惠明.延胡索乙素藥理作用的研究進展［J］.中國臨床藥學雜志， 2001， 10(1):58.

［4］朱才慶，范其坤，熊勝泉，等. 高效液相色譜法測定夏天無注射液中原阿片堿的含量［J］.中草藥， 2005， 36(5):699.

篇8

[關鍵詞]小兒氨酚黃那敏顆粒；對乙酸氨基酚；高效液相色譜法

中圖分類號：U164 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2016）10-0335-01

小兒氨酚黃那敏顆粒是一種適用于緩解兒童普通感冒及流行性感冒引起的發熱、頭痛、四肢酸痛、打噴嚏、流鼻涕、鼻塞、咽痛等癥狀常用的復方制劑，由對乙酸氨基酚、馬來酸氯苯那敏、人工牛黃等組成，是臨床常用的小兒抗感冒藥。

現行標準中僅采用紫外分光光度法測定對乙酸氨基酚的含量，專屬性不強，結果重現性差，因此產品質量可控性差。我們在文獻工作的基礎上，建立了一種快速檢測小兒感冒藥中對乙酸氨基酚含量的高效液相色譜法，并取得滿意效果。

1、儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀、61328B一級管陣列檢測器，關國安捷倫公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DZF}型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學

儀器有限公司；ME254S電子天平，德國Sartorius公司；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司。

對乙酸氨基酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100018200408）；甲醇（色譜純，Methane、公司，美國），娃哈哈純水。小兒氨酚黃那敏顆粒均購自不同廠家（產品批號分別為：1001321，100607，100885；其中每袋含對乙酸氨基酚125mg，馬來酸氯苯那敏0.5mg，人工牛黃5mg）。

2、方法與結果

2.1 確定色譜的應用條件

選擇C18色譜柱進行實驗，該色譜柱為150×4.6mm，波長為5um，而實驗選擇的流動相則為甲醇：水，兩者的配比為40：60，流動相的流速控制為1.0ml?min-1，選用的進樣量需要設定為20ul，確保色譜柱的溫度保持在25℃點上，并且將檢測波長的峰值設定為275nm，選用相應的對照品，將其與樣品的色譜柱圖進行對比分析，詳情可見圖1。

2.2 制備對照品溶液

選用精確的稱量儀器進行對乙酰氨基酚對照品的稱取，對照品的溫度要控制為105℃，將其進行干燥處理后達到恒重的狀態，確保其重量為0.0146g，將其放置選用的容量瓶中，該容量瓶為50ml，然后在容量瓶中加入適量的水進行稀釋，充分搖勻后，將其作為對照品溶液備用。

2.3 制備樣品溶液

從五個不同的生產廠家各選擇一袋小兒氨酚黃那敏顆粒，將這五袋小兒氨酚黃那敏顆粒進行混合磨碎，然后精確的稱取出一袋的藥品粉末重量，將粉末放置到準備好的容量瓶中，該容量瓶為100ml，加入適量的水，使得藥品粉末可以稀釋到制定的濃度刻度，搖勻，并利用微孔濾膜進行過濾處理，將過濾后的溶液留用。

2.4 測定線性關系

針對制備的對照品溶液進行稱量，分別稱出1-5ml的溶液，分別將稱取出的溶液，加入五個容量為50ml的容量瓶中，并利用水進行定容處理，在完成定容處理后，容量瓶中溶液的溶度分別為5.84mg?L-1，17.52mg?L-1，29.2mg?L-1，40.88mg?L-1，58.4mg?L-1，而且將進樣量也設定為標準溶液量，標準溶液量為20ul，然后就可以總結得出色譜的流出曲線圖。將對乙酰胺基酚的濃度作為X軸，其濃度單位設定為mg?L-1，而Y軸則設定為峰面積，進行線性回歸方程的計算，計算結果為Y=20.96X+0.8787，r=0.9998。從計算的結果就可以看出，對乙酰氨基酚的濃度范圍以及峰面積之間在對乙酰氨基酚的濃度達到5.84mg?L-1以上，58.4mg?L-1以下的時候，呈現出線性關系。

2.5 測定精密度

嚴格的依據相應的方法進行對照品溶液的選取，分別選取6次，而且選取的對照品溶液溶度需要控制為58.4mg?L-1，每一次選用的值均為20ul，通過實驗計算可知，RSD=1.19%（n=6），這就表明所選用的儀器有著較高的精度值。

2.6 重復性試驗

分別取制備樣品溶液項下3種藥品供試液按制備對照品溶液項下的色譜條件重復進樣3次，分別測得各種藥品供試液中對乙酸氨基酚色譜峰峰而積的RSD值，結果分別為0.29%，0.17%，0.73%（n=3），表明本法重復性好。

2.7 穩定性測定

分別取制備樣品溶液項下3種藥品供試液，在時間0，1，2，3，4，5h按2.2項下的色譜條件進樣，記錄峰面積，分別計算其RSD值。結果分別為2.68%，0.86%，0.89%（n=6），表明樣品在5h內穩定。

2.8 加標回收率測定

取同一批（批號：1001321，4g/袋）已知含量的小兒氨酚黃那敏顆粒樣品5份，每份約0.800g，分別精密加入對乙酸氨基酚2.500mg，依法測定，對乙酸氨基酚總平均回收率為116.6%，RSD為1.46%（表1）。

2.9 樣品測定

取制備樣品溶液項下處理好的樣品溶液各20ul，按上述色譜條件進行測定，按外標法（峰而積）計算含量，結果3批樣品1001321，100607，100885的含量分別為：83.2%，84.1%，84.5%（標示量）。

3、討論

3.1 選擇適宜的溶液

就相關的文獻資料可以了解到，流動相作為溶劑溶解樣品經常被應用于實驗研究。通過本文的研究可以了解到，將水作為對照品，分別針對水和流動相進行溶劑溶解檢定，對比的結果就是兩者之間沒有明顯的不同。所以，可以選擇價格較低的純凈水作為溶劑溶解樣品進行應用。

3.2 選擇適宜的流動相

就相關的文獻資料表明，在利用高效液相色譜法進行實驗的過程中，應用的流動相多選擇甲醇：磷酸二氫鉀溶液：三乙胺溶液，或者是選用的甲醇：乙腈：磷酸溶液。而就本文的實驗研究來說，選擇的溶液則為甲醇：水，兩者的比例為40：60，這樣的溶液在實驗中進行應用，具有操作便利的特點，而且也很容易出峰，并且在分離度上也相對較高，出現的峰形具有一定的對稱性，而且在實驗完成后，也很容易對色譜柱實施清洗。

3.3 合理的選用適宜的測定波長

測定對乙酰胺基酚紫外吸收波長后，根據測定的結果可以了解到，樣品溶液的峰值在275nm的時候，吸收率表現為最大。所以，本文在展開實驗的時候，選用的檢測波長峰值為275nm，就依據該檢測波長所檢測到的結果表明，基線處于較為穩定的狀態，不會對對乙酰氨基酚中的雜質造成嚴重的影響。

參考文獻

[1] 田磊.HPLC法同時測定復方銀翹氨敏膠囊中維生素C及對乙酰氨基酚的含量[J].安徽醫藥.2010（09）.

[2] 冀愛芬，裴小勇，王紅燕，華麗云，張勇.HPLC法測定復方對乙酰氨基酚片中三種成分的含量[J].中國藥師.2010（08）.

篇9

[關鍵詞] 含量測定；高效液相色譜法

中圖分類號：O657 文獻標識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）01-069-03

Doi：10.11876/mimt201401018

HPLC Determination of Content of Isoquinoline H-4 and its Related Substances

XU Chao1.2， YANG Jian-yun2，XIAO Bing-kun2，HUANG Rong-qing2

（1.Jiangxi university of TCM，Nanchang 330004；2.Academy of military medicine science，Peking 100850）

[Abstract] Objective： To establish a method for the determination of the content of H-4 and its related substances. Methods：RP-HPLC method was established. Column： Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250mm×4.6mm，5μm）；Mobile phase： water-methanol， Linear gradient elution， at a flow rate of 1mL/min with a diode array detector set at 236 nm； the temperature of column is 40℃.Results： Good linearity of the H-4 curve range of 20μg/mL～400μg/mL （r=0.9990）.The limited of detection is 0.8ng.Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive and convenient which can be used to control the quality of H-4.

[Key words] Determination of content； HPLC

1 概述

近年來，環境污染、快節奏的生活規律已讓癌癥的發病率越來越高，目前已成為世界性的難題。臨床上治療癌癥的方法有化療、放療、手術，免疫療法和其他方法 [1]。H-4是新型研發的異喹啉抗腫瘤藥物，為組蛋白去乙?；敢种苿?，能引起細胞周期阻斷和細胞凋亡基因的激活，從而抑制腫瘤細胞的生長[2]。本文采用高效液相色譜法對H-4及其在合成中產生的有關物質進行檢測，結果表明，該法靈敏度、精密度和重現性均能滿足要求，實驗數據準確可靠。

2 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀（waters2695泵，2 9 9 6型二極管陣列檢測器，自動進樣器，EMPOWER數據處理系統）；BP211D型電子天平（德國SARTORIUS）；甲醇、乙腈為色譜純（FISHER生產商），水為純凈水（娃哈哈有限公司）；H-4對照品（純度99.6%），原料藥（批號20120715，20120716，20120717）均由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所提供。

3 實驗部分

3.1 對照品溶液的制備

取對照品H-4 12mg，精密稱量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得對照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備

取供試品12mg，精密稱量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。

3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱：流動相為甲醇-水，線性梯度洗脫（0-25min 35%甲醇75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇35%甲醇），檢測波長為236nm；流速1.0mL/min；柱溫40℃，進樣體積20μL。在該色譜條件下，理論塔板數大于10000，分離度大于1.5，色譜行為良好（如圖1）。

4 方法學考察

4.1 線性關系

取對照品約10mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密取對照品貯備液0.5 mL，1.0mL，2.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度的溶液。取上述溶液及貯備液20μL，按“3.3”色譜條件下分別進樣兩次，記錄色譜圖。以對照品進樣濃度（X，μg?mL-1）為橫坐標，以對照品峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，得線性方程：Y=109261X+899070，r=0.9990（n=7），結果表明H-4在 20μg/mL～400μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

4.2 檢測限與定量限的確定

以信噪比3：1時注入儀器的量為檢測限，以信噪比約為10：1時注入儀器的量為定量限。結果H-4的檢測限為0.8ng，定量限為3.2ng。

4.3 精密度試驗

取3.1項下得對照品溶液，連續吸取6次，每次20μL，以峰面積計算其RSD為0.50%（n=6）。結果表明測定是儀器精密度良好。

4.4 重復性試驗

分別精密稱取樣品（批號20120717）9份，按3.2項下方法操作，配制成濃度為100μg/mL，120μg/mL，150μg/mL的低中高三個濃度，每個濃度溶液制備3份，按3.3色譜條件下測定H-4的含量，平均含量為99.4%，RSD為0.87%（n=9），表明該方法重復性良好。

4.5 穩定性實驗

取4.4項下配制好的高、中、低3個濃度的供試品溶液，在0，4，8，12，24，48，72h分別進樣20μL，測定峰面積，計算高、中、低三個濃度的峰面積的RSD分別為1.45%、1.21%及0.93%。表明供試品溶液在室溫放置72h內穩定性良好。

4.6 樣品含量測定

按3.1，3.2項下的方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，分別進樣20μL，按外標法以峰面積計算樣品含量。實驗數據如表1，3批樣品H-4含量均在99.0%以上。

4.7 有關物質含量測定

取3.2項下的供試品溶液1mL，精密量取，置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得自身對照溶液。以3.2項下配置的溶液為供試品溶液，按不加校正因子主成分自身對照法計算有關物質的含量。結果表明，有關物質均在1%以內（見表1）。

5 討論

5.1 流動相溶劑的優化

流動相是改善分離度的重要參數，分別考察甲醇―水、乙腈―水以及混合溶劑（甲醇乙腈）―水三種流動相對樣品的分離。試驗表明乙腈―水系統主峰與有關物質峰分離度小于1.5。而混合溶劑（甲醇乙腈）―水則表現出理論塔板數低的缺點。所以最終選擇甲醇―水系統。在該流動相系統條件下能較好的改善峰型，且分離度大于1.5，理論塔板數大于10000。

5.2 波長的選擇

H-4溶解在甲醇中最大吸收波長為236nm，有關物質也在此波長處有較強吸收；且在此波長處溶劑無干擾，故選擇236nm波長為檢測波長。

5.3 色譜柱的考察

選擇了不同填料、規格及廠家的色譜柱進行比較，包括Phenomenex LUNA C18 Column（250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C18 Column（250mm×4.6mm，5μm）、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250mm×4.6mm，5μm）。結果表明Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18最佳，所得色譜圖分離度良好，柱效高，而且相對于其他兩類色譜柱，保留時間也有一定的提前。

6 結論

綜上所述，該法靈敏度高，重復性好，專屬性強，可為H-4樣品的質量標準提供可靠的依據。

參 考 文 獻

篇10

[關鍵詞]小兒氨酚黃那敏顆粒；對乙酰氨基酚；高效液相色譜法；含量測定

中圖分類號：TM459 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2016）10-0343-01

小兒氨酚黃那敏顆粒是一種臨床比較常用的復方制劑，主要適用于緩解兒童普通感冒及流行性感冒所引起的發熱、頭痛以及打噴嚏、流鼻涕等癥狀，具有較好的應用價值?，F行標準中對小兒感冒藥中乙酰氨基酚的含量測定存在一定的局限性，因而采取高效液相色譜法對小兒氨酚黃那敏顆粒中乙酰氨基酚進行含量測定，具有重要的現實意義，并取得了較好的測定效果。

1 測定實驗中儀器與試藥

在高效液相色譜法測定小兒感冒藥中乙酰氨基酚含量的實驗中，選用國外先進的高效液相色譜儀和二級管陣列檢測器作為乙酰氨基酚含量測定的專用設備，確保這兩種設備的實際性能滿足實驗的標準。先用專業化的超聲波清洗器和電熱恒溫鼓風干燥箱，確保乙酰氨基酚含量測定的精準性和可靠性，與此同時，選用國外先進的紫外分光光度計，以促進含量測定實驗的順利進行。

在試藥方面，選用乙酰氨基酚的對照品，確保其質量和規格滿足國家藥品生物制品檢驗標準，與此同時進行甲醇、娃哈哈純凈水的配備。所選用的小兒氨酚黃那敏顆粒均購自于不同的廠家，其中每袋內乙酰氨基酚以及人工牛黃等的含量具有一定的一致性。

2 實驗方法與結果

2.1明確色譜條件。在高校液相色譜法對小兒氨酚黃那敏顆粒中乙酰氨基酚的含量進行測定的實驗操作中，對色譜條件以及流動相進行明確，流動相為甲醇-水，并將實際流速和進樣量控制在合理范圍內，對實驗中的檢測波長進行明確，乙酰氨基酚對照品與樣品的色譜圖分別建圖1。

2.2對照品溶液的制備操作。在本實驗中，精密稱取標準溫度條件下干燥至標準重量的乙酰氨基酚的對照品適量，置于容量瓶內，并通過娃哈哈純凈水進行稀釋，至刻度后進行搖勻，即可能到標準的乙酰氨基酚對照品溶液。

2.3樣品溶液的制備操作。在本實驗中，分別選取購買自不同廠家的不同規格的小兒氨酚黃那敏顆粒數袋，經研磨至標準形態后，精密稱取適量并置于標準的容量瓶內，加哇哈哈純凈水進行稀釋，稀釋至刻度后可采用專業的濾膜進行過濾，留作備用。

2.4對實驗中的線性關系進行測定和明確。在實驗過程中，分別稱取對照品溶液適量，加入50ml容量瓶內進行定容操作，并對定容后的濃度進行準確的記錄，從而得出色譜流出曲線。在此基礎上，以乙酰氨基酚濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，做標準化的線性回歸方程，線性回歸顯示，乙酰氨基酚濃度范圍與峰面積具有良好的線性關系。

2.5對實際精密度進行準確的測定。在本實驗中，對同一種對招聘溶液進行重復進樣操作，并對每次進樣的對照品溶液的量進行合理的控制，可以發現本實驗過程中儀器具有良好的精密度。

2.6進行重復性試驗操作。在本實驗中，按照色譜條件，對藥品供試品溶液進行重復進樣，并對各種藥品溶液中的乙酰氨基酚色譜峰峰面面積進行明確，實驗表明高效液相色譜法具有良好的重復性和應用性。

2.7對穩定性進行測定。在實驗過程中，嚴格按照色譜條件進行進樣操作，并對峰面積進行準確的記錄，實驗結果顯示，實驗中樣品溶液在5小時之內具有較好的穩定性。

2.8對加標回收率進行準確的測定。在實驗中，選取同一批的含量已定的小兒氨酚黃那敏顆粒樣品適量，分別加入對乙酰氨基酚適量，在高效液相色譜法測定條件下進行測定，可以明確乙酰氨基酚的總平均回收率，詳情見表1。

2.9對樣品進行準確可靠地測定。在實驗過程中，選取處理好的標準樣品溶液適量，按照高效液相色譜條件進行測定，并嚴格按照外標法對乙酰氨基酚含量進行計算，實際樣品含量均在80%以上。

3 討論

3.1溶劑的選取。實驗研究顯示，以流動相和純凈水分別作為溶劑對乙酰氨基酚含量進行測定，發現并不存在明顯差異，因而在高效液相色譜法對小兒感冒藥中乙酰氨基酚含量進行測定時，可以選用廉價易得的純凈水作為溶劑，來對式樣樣品進行溶解操作。

3.2對流動相進行選取。相關資料研究顯示，高效液相色譜法進行乙酰氨基酚含量測定的過程中，流動相對位甲醇、三乙胺溶液、磷酸溶液等。而在本實驗中，主要采用甲醇：水（40：60）作為流動相，實際操作具有一定的便捷性和可靠性，操作簡單且出峰時間較快。對實驗結果進行觀察和分析可以發現，甲醇：水（40：60）作為流動相時，實際分離度較高且峰形對稱，試驗后色譜柱的沖洗也比較簡便，具有良好的適用性。

3.3測定波長的選擇。對對乙酰氨基酚紫外吸收波長進行測定，結果顯示樣品溶液在275 nm處有最大吸收。因此本實驗選擇275 nm作為檢測波長。此時檢測基線穩定，對乙酰氨基酚前后雜質干擾小。

3.4高效液相色譜法，又稱“高壓液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。

高效液相色譜法分析速度快、載液流速快，分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。應用范圍廣，百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

參考文獻

[1] 閆海燕-高效液相色譜法測定小兒氨酚黃那敏顆粒中對乙酰氨基酚的含量《安徽醫藥》，2011.