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摘要目的：將抗人原發(fā)性肝癌(PLC)單抗TIGTC-Ⅲ，用胃蛋白酶法消化成F(ab′)2片段，標(biāo)記131I后進(jìn)行裸鼠人肝癌移植瘤的體內(nèi)定位研究。方法：采用胃蛋白酶消化法，進(jìn)行裸鼠體內(nèi)核素顯像。結(jié)果：消化產(chǎn)率為31.7%±2.4%，經(jīng)細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明F(ab′)2具有良好的免疫活性，抗體片段進(jìn)入裸鼠體內(nèi)后，與完整抗體比，進(jìn)入腫瘤的速度快，生物學(xué)分布特異性高，定位指數(shù)上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明顯縮短。結(jié)論：F(ab′)2與全抗體比較可使成像時(shí)間提前，定位清晰。

關(guān)鍵詞單克隆抗體F(ab′)2片段放射免疫顯像

ThepreparationofF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibodyTIGTC-Ⅲanditsapplicationintumorradioimmunoimagine

SHILe-Hua,YANGJia-He,CUIZhen-Fuetal.

EasternHepatobiarySurgeryHospital,TheSecondMilitaryMedicalCollege,Shanghai200433

AbstractObjective：InordertorealizetheimmunoimmagingwithF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibody(TIGIC-Ⅲ)forPLC.Methods：Monoclonalantibody(TIGTC-Ⅲ)againsthumanprimarylivercancer(PLC)wasdigestedintoF(ab′)2fragmentbypepsindigestion.Afterlabelledwith131Iand125IradioiodinatedF(ab′)2wasinjectedintonudemicebearingtumorxenograftsofPLCviatailveinandradioimmunoimaginewasperformed.Results:TheexperimentresultsshowedthattheyieldofpureF(ab′)2was31.7%±2.4%,theimmunoreactivityofF(ab′)2basedonthecellbindingstudieswasretainedwell.Aftertheinjectionof131I-F(ab′)2intoPLCtumor-bearingnudemice,photoscintigraphywasperformedatintervalsof12h.Thexenograftswerevisualizeddistinctlyduring24～96h.Conclusion：Theratiooftumortonon-tumor(T/NT)washigherthanthoseoftheintactIgGinalltissues.XenograftsofPLCinnudemiceacumulatedTIGTC-Ⅲ.Theexcretionofradioactivitywasdecreasedrepidly.

KeywordsMonoclonalantibodyF(ab′)2Radioimmunoimagine

用胃蛋白酶法制成TIGTC-Ⅲ的活性片段F(ab′)2，標(biāo)記上131I后進(jìn)行了裸鼠人肝癌移植模型的放射免疫顯像(RII)研究。

1材料與方法

1.1單抗TIGTC-Ⅲ的制備TIGTC-Ⅲ系將肝癌細(xì)胞株HEPG2免疫Balb/c小鼠后將其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合而成的雜交瘤分泌的一系列抗體之一，已經(jīng)抗體的專一性分析［1］。

1.2抗體片段F(ab′)2的制備與純化按Harlow方法進(jìn)行［2］。

1.3TIGTC-Ⅲ和F(ab′)2的標(biāo)記及其免疫活性測(cè)定用氯胺T法［3］。標(biāo)記物用SephadexG-25柱分離，去除游離碘。0.22μm微孔濾膜除菌，用細(xì)胞結(jié)合分析法測(cè)定免疫活性。

1.4荷人肝癌裸鼠模型的建立［4］將PLC細(xì)胞接種在4周齡的Balb/c裸小鼠腋部皮下，待腫塊長(zhǎng)到0.8cm3左右時(shí)進(jìn)行定位及治療研究。

1.5放射免疫顯像及抗體的生物學(xué)分布

1.5.1動(dòng)物處理標(biāo)記抗體注射前72h起，在飲用水中加1%碘化鉀，以封閉裸鼠甲狀腺對(duì)碘的攝取。

1.5.2TIGTC-Ⅲ及F(ab′)2在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布［5］12只荷瘤裸鼠，每鼠注射7.4×106Bq的125I-F(ab′)2，給藥后每24h處死3只，取腫瘤、血液及各臟器。分別稱重并測(cè)其放射性算出T/NT。另取3只荷瘤鼠，從尾靜脈注入125I-F(ab′)2及非特異性的131I-F(ab′)2，48h后處死，取器官組織稱重后分別測(cè)放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算定位指數(shù)。

1.5.3放射免疫顯像每鼠注射200μCi/0.1mg的131I-F(ab′)2，對(duì)照組注射相同劑量的非特異131I-

F(ab′)2，每12h行γ照射。

1.5.4標(biāo)記抗體的生物半衰期42只8周齡的Balb/c小鼠，分完整抗體組與F(ab′)2組。分別于給藥后12、24、48、72、96、120h處死，分離血清并加200μl肝細(xì)胞(1×106)，測(cè)放射性計(jì)數(shù)后算出抗體的生物半衰期。

1.5.5TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)取6只8周齡Balb/c小鼠分全抗體與F(ab′)2組，給藥后分別于6、12、24、48、72、96、120h自尾靜脈取血10μl，測(cè)放射性后繪制放射性-時(shí)間曲線。

2結(jié)果

2.1抗體片段的制備純化TIGTC-Ⅲ，經(jīng)電泳檢測(cè)純度大于95%。用胃蛋白酶消化，16h以上消化完全。消化液經(jīng)層析后第1峰為F(ab′)2。其產(chǎn)率為31.7%±2.4%。

2.2標(biāo)記抗體的質(zhì)量控制TIGTC-Ⅲ的標(biāo)記率為72%，比活度為7.54MBq/mg，放化純度92.5%±1.7%。TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2標(biāo)記上碘后，與PLC細(xì)胞的結(jié)合率分別為45%與28%，mIgG與其F(ab′)2的結(jié)合率均小于5%。

2.3不同時(shí)間每克腫瘤及其它組織對(duì)TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的攝取量見(jiàn)表1。

2.4不同時(shí)間的T/NT值見(jiàn)表2。

2.5定位指數(shù)靜注碘標(biāo)抗體后48h，測(cè)得定位指數(shù)TIGTC-Ⅲ為3.45，TIGTC-ⅢF(ab′)2為5.88。

2.6荷瘤鼠放射免疫顯像注入抗體后24h瘤區(qū)有放射性濃聚，36h后腫瘤顯像。顯像最佳時(shí)間為全抗體96h左右(圖1，B)，F(xiàn)(ab′)236～48h(圖1，A)，mIgG整個(gè)顯像過(guò)程無(wú)明顯濃聚(圖1，C)。

2.7抗體的清除速率及生物半衰期F(ab′)2在心血管的清除明顯快于完整抗體，F(xiàn)(ab′)2的生物半衰期約20.0h，全抗體為52.6h左右，兩者差異顯著。

表1裸鼠組織對(duì)完整抗體及其片段的攝取率

Tab.1PercentageintakeofTIGTC-ⅢandF(ab′)2pergramoftissue

Tissue24h48h72h

TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2

Tumor0.311.412.210.793.110.68

Heart0.460.360.480.300.450.15

Blood2.511.451.870.621.620.41

Kidney0.911.750.926.870.760.59

Liver1.620.501.860.321.270.20

Lung0.860.940.670.580.630.22

Muscle0.360.250.310.240.420.15

Spleen1.390.811.520.401.230.19

Bone0.330.210.350.190.470.11

表2裸鼠注射完整抗體及其片段后的T/NT值

Tab.2T/NTvaluesofdifferenttissueinnudemiceafterinvivoinjectionofTIGTC-Ⅲ&F(ab′)2

Tissue24h48h72h

TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2

Cerebrum19.5018.3321.8020.2023.5022.80

Bone2.702.852.953.023.202.85

Blood0.690.890.711.180.781.22

Heart1.380.692.502.883.102.72

Intestine2.251.124.754.865.305.58

Kidney1.080.432.150.562.400.81

Liver2.072.552.603.843.024.24

Lung1.270.981.340.761.500.80

Muscle3.503.253.783.453.853.47

Skin0.430.660.981.721.421.56

Spleen1.671.902.253.442.483.89

Stomach1.410.722.853.983.704.65

圖1F(ab′)2注入荷人肝癌裸鼠體內(nèi)后72h的RII

Fig.1TheradioimmunoimageofPLC-bearingnudemice72hafterinjectionofF(ab′)2

3討論

在以單抗為載體的放射免疫顯像中，由于完整抗體的Fc段常與組織細(xì)胞的Fc受體結(jié)合而使本底清除減慢，從而影響成像，抗體片段優(yōu)于完整抗體已被許多學(xué)者所證實(shí)［6］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明F(ab′)2比完整抗體有如下優(yōu)點(diǎn)：F(ab′)2進(jìn)入腫瘤速度快，生物學(xué)分布特異性提高，定位指數(shù)上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明顯縮短，從而使成像時(shí)間提前，成像清晰。

隨著影像技術(shù)的發(fā)展，使原發(fā)性肝癌的診斷及定位變得較為容易，因此，單抗在肝癌的應(yīng)用主要在于放射免疫治療，由于F(ab′)2的以上特點(diǎn)，使抗體片段在腫瘤部位的攝取量低于完整抗體，且生物半衰期短，免疫活性低，從而用于肝癌導(dǎo)向治療不如完整抗體。如何解決這一矛盾將是以后進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

在抗體片段的制備中有兩個(gè)基本要求，即盡可能高的消化產(chǎn)率及保留免疫活性。本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶消化法，此法雖然產(chǎn)率較低，但方法簡(jiǎn)便，免疫活性較高。F(ab′)2片段的免疫活性在標(biāo)記的前后均低于全抗體，可能是消化過(guò)程中酶對(duì)其損傷所致，為保留抗體的免疫活性，應(yīng)盡量縮短反應(yīng)時(shí)間。

作者簡(jiǎn)介：施樂(lè)華，男，40歲，肝膽外科學(xué)博士；

指導(dǎo)教師，吳孟超，男，中科院院士，博士生導(dǎo)師，主要研究肝癌的基礎(chǔ)研究與臨床治療

作者單位：施樂(lè)華楊家和崔貞福吳孟超(第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院，上海200433)

潘文舟孔令山(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院，上海200433)

王明庫(kù)(黑龍江紅興隆管局中心醫(yī)院，黑龍江155811)

4參考文獻(xiàn)

1施樂(lè)華，吳孟超，陳漢etal.分泌抗人原發(fā)性肝癌單克隆抗體雜交瘤TIGTC的制備及專一性分析.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996；17(4)：313

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