導(dǎo)語：腸道致病菌測(cè)體論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

沙門菌屬、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌是常見的引起人類和動(dòng)物細(xì)菌性痢疾和細(xì)菌性食物中毒的腸道致病菌，嚴(yán)重的危害著人類健康和牲畜的平安〔1〕。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)方法具有重要意義。目前常見病原菌的檢驗(yàn)方法存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大、所需試劑多，而且假陰性率高，靈敏度低，或假陽性率高，特異性差等缺點(diǎn)。PCR技術(shù)提供了理想的檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)采用多重PCR方法，可在同一反應(yīng)體系中檢測(cè)不同的細(xì)菌，整個(gè)過程只需要2～3h，應(yīng)用前景廣闊。

1材料和方法

11實(shí)驗(yàn)菌株腸炎沙門菌、阿柏丁沙門菌，雞雛沙門菌，德爾比沙門菌、鼠傷寒沙菌，福氏志賀2a，福氏志賀2b，宋氏志賀菌，枸緣酸桿菌，變形桿菌，河弧菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌(四川省疾病預(yù)防控制中心)；產(chǎn)毒素大腸埃希菌C83921，產(chǎn)毒素大腸埃希菌C83902（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；侵襲性大腸埃希菌（中國(guó)生物制品探究所）。

12試劑染料、緩沖溶液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、核酸染料(GV)、瓊脂糖、Marker等(北京塞百盛基因技術(shù)公司)。

13主要設(shè)備PCR基因擴(kuò)增儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、紫外可見凝膠成像系統(tǒng)、核酸分析儀、微量加樣槍(德國(guó)Eppendorf公司)；電泳槽、DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

14方法

141引物設(shè)計(jì)沙門菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因片段具有沙門菌屬特異性〔2-4〕，根據(jù)GenebankV01373提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，即引物1摘要:5′-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3′；引物2摘要:5′-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3′由于ipaH基因存在于所有志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌（EIEC）的質(zhì)粒和染色體上〔5〕，根據(jù)GenebankM32063提供的序列設(shè)計(jì)志賀菌和EIEC引物,引物序列為摘要:引物1摘要：5′-TGTATCACAGATATGGCATGC-3′；引物2摘要：5′-TCCGGAGATTGTTCCATGTG-3′。選擇不耐熱腸毒素(LT)的編碼基因保守區(qū)〔6〕，根據(jù)GenebankS60731提供的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物為摘要：引物1摘要：5′-GCGTTACTATCCTCTCTATGTG-3′引物2摘要：5′-AGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3′。

142DNA模板的提取采用熱裂解法，取細(xì)菌培養(yǎng)液10ml,置于Eppendorf管中,8000r／min，滅菌蒸餾水洗滌2次,最后用1ml蒸餾水懸浮,隔水煮沸10min,8000r／min，離心10min,取上清,即為DNA模板溶液。

143多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化通過多次試驗(yàn)先確定了變化較小的因素buffer,dNTP,再對(duì)影響較大的因素如MgCl2濃度、引物濃度、Taq酶用量、模板濃度，在1個(gè)范圍內(nèi)做正交實(shí)驗(yàn)，再進(jìn)行局部微調(diào)，最后調(diào)整退火溫度和循環(huán)數(shù)參數(shù)等。取PCR產(chǎn)物5μl及DNAMarker參照物在含有(GV)的1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓75V,電泳40min后在紫外燈下觀察結(jié)果。

144多重PCR體系的特異性、靈敏度、樣品檢測(cè)(1)特異性檢測(cè)摘要：9株標(biāo)準(zhǔn)目的菌株和7株非目的菌株,提取DNA模板,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后觀察有無條帶的出現(xiàn)。(2)靈敏度檢測(cè)摘要：將從目的菌株提取的DNA模板用核酸分析儀測(cè)定DNA含量,然后作10倍梯度稀釋,取每個(gè)稀釋度的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳后觀察條帶的亮度,直到不出現(xiàn)擴(kuò)增帶為止。(3)樣品的檢測(cè)摘要：從牛肉中分離的可疑菌株,提取DNA模板,進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。同時(shí),按常規(guī)進(jìn)行生化檢驗(yàn)和玻板凝集試驗(yàn)。

145PCR試劑盒組成經(jīng)反復(fù)試驗(yàn),組裝多重PCR試劑盒。包括PCR反應(yīng)管,PCR反應(yīng)液［染料，緩沖溶液（Mg2+），dNTP，引物］,瓊脂糖粉,GoldView染料，Taq酶,陽性對(duì)照,陰性對(duì)照,液體石蠟。

2結(jié)果

21PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化反應(yīng)體積50μl,10×buffer5μl，引物各025μl（50μmol/L）,Taq聚合酶08μl(5U/μl),dNTPs2μl（10mmol/L）,粗提DNA模板各1μl。擴(kuò)增條件摘要:94℃預(yù)變性4min,94℃變性45s,退火58℃40s,延伸72℃60s,32個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫5min，見圖1。

1摘要：腸炎沙門菌；2摘要：阿柏丁沙門菌；3摘要：雞雛沙門菌；4摘要：德爾比沙門菌；5摘要：鼠傷寒沙門菌；6摘要：產(chǎn)毒素大腸埃希菌C83902；7摘要：產(chǎn)毒素大腸埃希菌C83902；8摘要：福氏志賀2a；9摘要：福氏志賀2b；10摘要：宋氏志賀；11摘要：侵襲性大腸埃希菌；12摘要：腸炎沙門菌+產(chǎn)毒素大腸埃希菌；13摘要：產(chǎn)毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a；14摘要：腸炎沙門菌+福氏志賀2a；15摘要：福氏志賀2a+腸炎沙門菌+產(chǎn)毒素大腸埃希菌；16摘要：腸炎沙門菌+產(chǎn)毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a；17摘要：腸炎沙門菌+產(chǎn)毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a

圖1多重PCR反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果（略）

22特異性用所建立的方法檢測(cè)沙門菌、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌均擴(kuò)增出特異的、和預(yù)期結(jié)果相符的DN段,未見非特異性擴(kuò)增帶，且其他的非目的菌株未擴(kuò)增出條帶。

23靈敏度單獨(dú)及多重PCR體系中幾種菌的靈敏度均達(dá)到10-8fg/μl,兩體系靈敏度一致,即沙門菌屬為913×10-8fg/μl，志賀菌屬（侵襲性大腸埃希菌）為723×10-8fg/μl，腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌234×10-8fg/μl，見圖2。

M摘要：DNAMarker；1～4摘要：各模板DNA稀釋度分別為10-1，10-2，10-3，10-4倍

圖2多重PCR反應(yīng)靈敏度檢測(cè)結(jié)果（略）

24牛肉中志賀菌的檢測(cè)用多重PCR方法從牛肉中共檢測(cè)出9個(gè)陽性樣品。經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生檢驗(yàn)方法驗(yàn)證均為陽性〔7〕。

25試劑盒穩(wěn)定性和重復(fù)性除Taq酶,PCR反應(yīng)液,陰、陽性模板置-20℃貯存外,其余試劑均4℃條件下貯存。在貯存時(shí)間為30，60，90，120，150，180，210，240，270和300d時(shí)取出,用已知PCR陽性樣品檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性,結(jié)果直到300d,樣品PCR仍呈陽性,說明該試劑盒的有效期在300d以上。此外,PCR陽性樣品用試劑盒重復(fù)試驗(yàn)3次,結(jié)果均為陽性;而PCR陰性樣品重復(fù)試驗(yàn)3次,均為陰性。說明該試劑盒的重復(fù)性好。

3討論

本探究在于應(yīng)用多重PCR快速檢測(cè)腸道致病菌，考慮到引物間的配對(duì)、引物間的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增、退火溫度等均可影響多重PCR的擴(kuò)增效果〔8〕，因此，查找的序列均具有很強(qiáng)的保守性，設(shè)計(jì)的3對(duì)引物之間不能相互配對(duì)，形成二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，Tm值基本一致等。對(duì)選取的目的菌株和非目的菌株同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果目的菌株均顯示出特異擴(kuò)增,而所有非目的菌株均不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,說明引物具有很強(qiáng)的特異性。多重PCR影響因素復(fù)雜,不同的引物、模板、引物濃度、模板濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度及其比例、緩沖液成分和濃度、反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)等會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的綜合效應(yīng)〔9〕。本體系中10×buffer,dNTPs,模板量等對(duì)多重?cái)U(kuò)增的影響不大,Taq酶、引物、Mg2+濃度、循環(huán)次數(shù)、退火溫度等對(duì)PCR反應(yīng)的特異性和反應(yīng)效率影響較大。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和條件,使實(shí)驗(yàn)效果達(dá)到了最佳，且?guī)追N細(xì)菌隨機(jī)組合的擴(kuò)增也獲成功,未出現(xiàn)相互間強(qiáng)抑制現(xiàn)象。PCR試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)表明,該試劑盒重復(fù)性好,有效期長(zhǎng),特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確,對(duì)待檢樣品要求不高,檢測(cè)時(shí)間更短等。通過對(duì)牛肉樣品的檢測(cè),顯示PCR法陽性率明顯高于培養(yǎng)法,且培養(yǎng)法陽性的樣品,PCR法均為陽性,說明試驗(yàn)結(jié)果可靠。因此,該試劑盒有一定的應(yīng)用價(jià)值,可在生產(chǎn)生活中推廣應(yīng)用。

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