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【摘要目的摘要：探索二酰基甘油酰基轉移酶1（DGAT1)K378N基因多態性和中國人2型糖尿病(T2DM)及糖尿病腎病(DN)的關系.方法摘要：運用熒光偏振模板依靠的染料摻入反應法（TDIFP）技術檢測DGAT1K378N基因多態性在71例T2DM患者［29例糖尿病腎病患者（DN＋組）和42例糖尿病非腎病患者（DN－組）］和45例健康對照者中的等位基因和基因型分布頻率.結果摘要：KK，KN和NN基因型在T2DM組的分布分別為摘要：42,40,12例；DN＋組摘要：14,11,4例；DN－組摘要：22,14,6例；正常對照組摘要：13,23,9例.①T2DM患者DGAT1K378等位基因頻率(66.0％)高于健康對照組（54.4％），但未達顯著性水平；②DN＋組和DN－組K378N等位基因及基因型分布無顯著差異（P%26gt;0.05）.結論摘要：K378等位基因頻率在T2DM患者組有升高，但未見DGAT1K378N基因多態性和中國人T2DM及DN發生的明顯相關關系.

【糖尿病，2型；糖尿病腎病；多態性，單核苷酸；二酰基甘油酰基轉移酶1；TDIFP技術

0引言

二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT)是微粒體酶，催化甘油二酯和脂肪酰基輔酶A以共價健結合，是三酰甘油（TG）合成的限速酶.近來有報道DGAT1缺陷小鼠可反抗飲食誘導的肥胖、提高胰島素及瘦素敏感性.胰島素反抗是2型糖尿病（T2DM）發病的重要原因，而肥胖是T2DM最主要的危險因素之一.DGAT1基因可列為T2DM病因學探究的候選基因，我們應用了具有高敏感性和特異性的檢測單核苷酸多態性（SNPs）方法熒光偏振模板依靠的染料摻入反應法（TDIFP）［1,2］檢測了該基因第378位賴氨酸到天門冬酰胺（K378N）多態性在T2DM患者和健康人中的分布，以明確其和T2DM及DN的關聯性.

1材料和方法

1．1材料

1.1.1血樣標本2型糖尿病患者（T2DM組）摘要：94例T2DM患者均系我院內分泌科就診患者，依1999年世界衛生組織（WHO）糖尿病診斷標準診斷.按其是否發生腎病并發癥分為兩組摘要：①糖尿病腎病組（DN＋組）29（男15，女14）例，年齡（58.5±7.2）歲，病史5~12a，多次尿白蛋白陽性，排除感染、高血壓引起的尿蛋白.糖尿病腎病常和糖尿病視網膜病變同時存在，若同時有尿蛋白但無糖尿病視網膜病變，則尿蛋白不能排除為高血壓造成，因而該組剔除了有尿蛋白無視網膜病變同時有高血壓患者共17例.②糖尿病非腎病組（DN-組）42（男20，女22）例，年齡（54.9±10.6）歲，病史3~10a，尿白蛋白陰性，因有糖尿病視網膜病變多已伴發腎臟改變，可能尚處于病變早期而無臨床表現，因而該組剔除了尿白蛋白陰性但同時有糖尿病視網膜等微血管病變患者共6例.健康對照組（Control組）摘要：隨機取我院體檢中心體檢健康者45（男21，女24）例，年齡（48.5±13.1）歲，經檢查排除糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、肥胖及腎病等，且均無糖尿病家族史.采集所有受檢對象空腹靜脈血樣標本，EDTA抗凝，提取DNA，另一管送常規生化檢驗.

1.1.2主要試劑及儀器dNTP，TaqDNA聚合酶、pGEMTEasy載體系統購自Promega公司.核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶、AcycloDNA聚合酶和熒光偏振檢測儀Victor2購自PerkinElmer公司.熒光標記終止子AcycloTerminatorsTM（AcycloGTPR110/AcycloCTPTAMRA）為PerkinElmer公司專利產品.DNA引物5′CACACCCCACCTACCTGATGC3′及5′CCTGGGGGCTGGGATGG3′；探針5′CTTCTGGCAGAACTGGAA3′由上海博亞生物技術有限公司合成.

1.2方法

1.2.1DNA引物及探針設計根據引物設計的基本原則，應用DNAStar軟件，結合TDIFP反應的非凡要求設計引物及探針.引物和探針序列不能重疊，探針的3′末端必須緊鄰待測變異基因位點.特異性寡核苷酸探針及和變異堿基對應互補末端摻入的特異堿基GTP/CTP是基于DGAT1基因擴增片段內的序列及變異堿基設計的，擴增靶片段長度為140bp（Fig1）.

1.2.2DNA的提取及PCR擴增用標準酚/氯仿法由四周血白細胞內提取基因組DNA.取DNA模板5μL，dNTP150μmol/L，引物各0.25μmol/L，MgCl22.0mmol/L,TaqDNA聚合酶16.67nkat，反應體系共25μl.PCR條件摘要：95℃4min；94℃30s，52℃40s，72℃30s，40個循環；72℃5min，擴增靶片段DNA.標本DNA經擴增后所得產物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測.將經回收、連接、轉化、篩選、測序正確的發生和未發生變異的質粒DNA作為陽性和陰性標準品.

1.2.3DGAT1K378N基因多態性的檢測鑒定采用TDIFP方法對擴增產物中K378N變異堿基進行檢測.首先消化處理摘要：蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ混合物和PCR產物37℃孵育2h，可分別降解PCR產物中殘余的dNTPs和引物，避免對后續反應的干擾；而后80℃熱處理15min滅活酶.以此產物為模板和探針結合，再以AcycloGTPR110和AcycloCTPTAMRA這兩種熒光標記終止子為底物，在AcycloDNA聚合酶及其緩沖液中于95℃2min,然后95℃15s，50℃30s，25個循環雜交延伸,最后15℃延伸10min，4℃保存.PCR產物模板和探針互補雜交，和模板互補的游離熒光標記終止子AcycloG/CTP摻入到探針末端，熒光素分子量增加，在熒光偏振檢測儀上分別檢測AcycloGTPR110（波長535nm）和AcycloCTPTAMRA（波長595nm）的熒光偏振（FP）值,據兩種熒光的FP值,推斷變異堿基類型.

統計學處理摘要：正態分布資料用x±s表示，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，組間均數比較采用t檢驗（方差不齊時用t′檢驗）或方差分析，疾病危險因素分析采用二分類Logistic回歸，整個統計分析用SSPS11.0軟件處理.

2結果

2.1臨床特征DN＋組和DN－和正常對照組的性別（Sex）、年齡(Age)、體質指數BMI，均無顯著差異(P%26gt;0.05)，DN＋組和DN－的收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)水平高于正常對照組(P%26lt;0.05)，并且DN+組收縮壓高于DN－組(P%26lt;0.05,Tab1).表1各組臨床特征比較（略）

2.2生化特征DN＋組和DN－和正常對照組的血膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白（HDL）等均無顯著差異(P%26gt;0.05)，DN＋組和DN－組的TG水平高于正常對照組(P%26lt;0.05,Tab2).表2各組生化指標特征比較（略）

2.3反應體系及引物測試PCR擴增所有標本基因組DNA中DGAT1基因目的片斷,顯示擴增片段長度為140bp,無非特異擴增條帶，和預期相符.

2.4TDIFP方法檢測PCR擴增產物消化后，和DGAT1基因特異探針及兩種熒光標記堿基混合反應，AcycloCTPTAMRA摻入，TAMRAFP值增高，對應N378等位基因；AcycloGTPR110摻入，R110FP值增高，對應K378等位基因；兩者都有摻入時，為雜和基因型.DN+，DN-，T2DM，正常對照組基因型及等位基因頻率經χ2檢驗符合HardyWeinberg遺傳平衡定律(P%26gt;0.05)，樣本具有群體代表性.①T2DM患者DGAT1K378等位基因頻率(66.0％)和健康對照組（54.4％）比較未達顯著性水平（χ2=3.432,P=0.064,Tab3).②DN＋組和DN－組的K378N等位基因頻率及基因型頻率無顯著差異（P%26gt;0.05,Tab4).表3T2DM組和正常對照組等位基因及基因型頻率比較（略）表4DN+組和DN-組等位基因及基因型頻率比較（略）

2.5用Logistic回歸進行疾病危險因素分析以是否有T2DM為因變量進行Logistic回歸分析，SBP（P=0.000），TG（P=0.003）進入方程，提示SBP（OR=1.122，95％CI摘要:1.055～1.193）,TG升高（OR=6.532，95％CI摘要:1.923～22.185）是T2DM發生的危險因素.

3討論

DGAT是TG合成的限速酶，包括DGAT1和DGAT2兩種.DGAT1的表達廣泛，在腎上腺皮質髓質、睪丸、小腸高表達，在甲狀腺、胃、心、骨骼肌、肝中等量表達，而DGAT2表達較受限制［3］.已發現DGAT1缺陷小鼠可通過增加能量消耗反抗飲食誘導的肥胖，組織TG水平降低，胰島素及瘦素敏感性提高［4］.而過表達DGAT的胰島β細胞在高糖水平下培養72h后，糖刺激的胰島素分泌明顯受損［5］.DGAT被認為和胰島素反抗密切相關，抑制該酶可能是治療肥胖及糖尿病的新靶點.還有報道過表達DGAT1可減少信號脂質(DAG、磷脂酶C、磷脂酶A2和膜脂質）而合成TG，調節膜脂質和信號脂質的合成，因而在調節細胞生長方面有重要功能［6］.

SNPs被目前認為是疾病臨床表現的遺傳基礎.SNPs的探究熱點是啟動子區的SNPs和cSNPs即及蛋白質編碼區域內的SNPs.cSNPs又分同義cSNPs和非同義cSNPs.非同義cSNPs指堿基序列的改變可使以其為模板翻譯的蛋白質序列發生改變，從而可能影響蛋白質的功能，這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因.已有報道DGAT1基因啟動子C97T變異和土耳其女性低體質量指數、高HDLch及低DBP有關［7］.但Coudreau等［8］探究則認為該變異和法國人肥胖無關.DGAT1基因SNPs變異和糖尿病關系尚未見報道.我們檢索了美國國家生物技術信息中心Entrez的SNP數據庫，檢索到該基因的一個cSNPs變異K378N并進行了病例對照探究，T2DM患者DGAT1K378等位基因頻率(66.0％)高于健康對照組（54.4％），雖未達顯著性水平；但不能否認該基因和糖尿病可能存在關聯.催化同樣反應的DGAT2，和DGAT1分屬于不同的基因家族［9］，是否會補償由于DGAT1K378N基因多態性造成的異常.這有待DGAT1及DGAT2各自功能的進一步闡明，以及基因變異和酶活性間的對應關系的探究.另外可能受到該基因其他多態性位點的影響，如和C97T變異有無交互功能存在.

本探究還顯示DN＋組和DN－組K378N等位基因頻率及基因型頻率無顯著差異，DGAT1基因多態性和糖尿病腎病發生無關.Logistic回歸結果提示TG及SBP為糖尿病的危險因素，因此可以從對TG代謝或對SBP有影響的眾多候選基因中進行多基因篩查，這將有助于糖尿病遺傳學的探索.

【參考文獻］

［1］HsuTM,ChenX,DuanS,etal.UniversalSNPgenotypingassaywithfluorescencepolarizationdetection［J］.Biotechniques，2001；31(3)摘要：560-568.

［2］焦凱，江華，張菊,等.模板指導末端延伸法檢測內皮型一氧化氮合酶基因多態性探究［J］.中華檢驗醫學雜志，2004；27（10）摘要：653.

JiaoK,JiangH,ZhangJ,etal.AstudyoneNOSgenepolymorphismwithTDIFP［J］.ChinJLabMed,2004；27（10）摘要：653.

［3］OelkersP，BehariA，CromleyD，etal.CharacterizationoftwohumangenesencodingacylcoenzymeA摘要:Cholesterolacyltransferaserelatedenzymes［J］.JBiolChem,1998；273（10）摘要:26765-26771.

［4］ChenHC,SmithSJ,LadhaZ,etal.IncreasedinsulinandleptinsensitivityinmicelackingacylCoA摘要:Diacylglycerolacyltransferase1［J］.JClinInvest,2002；109(8)摘要:1049-1055.

［5］KelpeCL,JohnsonLM,PoitoutV.Increasingtriglyceridesynthesisinhibitsglucoseinducedinsulinsecretioninisolatedratisletsoflangerhans摘要:Astudyusingadenoviralexpressionofdiacylglycerolacyltransferase［J］.Endocrinology,2002；143(9)摘要:3326-3332.

［6］BagnatoC,IgalRA.Overexpressionofdiacylglycerolacyltransferase1reducesphospholipidsynthesis,proliferation,andinvasivenessinsimianvirus40transformedhumanlungfibroblasts［J］.JBiolChem,2003；278(52)摘要:52203-52211.

［7］LudwigEH,MahleyRW,PalaogluE,etal.DGAT1promoterpolymorphismassociatedwithalterationsinbodymassindex,highdensitylipoproteinlevelsandbloodpressureinTurkishwomen［J］.ClinGenet,2002;62(1)摘要:68-73.

［8］CoudreauSK,TounianP,BonhommeG,etal.RoleoftheDGATgeneC79TsinglenucleotidepolymorphisminFrenchobesesubjects［J］.ObesRes,2003；11(10)摘要:1163-1167.

［9］LardizabalKD,MaiJT,WagnerNW,etal.DGAT2摘要:Anewdiacylglycerolacyltransferasegenefamily［J］.JBiolChem,2001；276(42)摘要:38862-38869.