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【關鍵詞】RNA干擾；高血壓；血管緊張素Ⅱ受體；載體

GenesilencingtargetedtotheratAT1receptorsbyefficientshRNAsanditsscreening

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheefficacyofshorthairpinRNAs(shRNAs)tomodulatetheexpressionofratangiotensinⅡtype1(AT1)receptorgeneinmammaliancellsandtoexplorethecorrelationsbetweenthefeaturesofefficientshRNAsandshRNAsfunctionality.METHODS:Wegenerated4shRNAsexpressionvectorstargetingagainstratangiotensinⅡreceptors.TheshRNAsweretargetedto4differentregionsofthesamegene.TheratC6gliomacellsweretransfectedwithconstructedpGenesil1shRNAplasmidandscrambledplasmid.TheculturedcellswerecollectedatdifferentphasesforRTPCRandWesternblotanalyses.RESULTS:24hlater,nosignificantreductioninAT1mRNAlevelsatalltreatedgroupscouldbedetected.48hlater,AT1mRNAlevelofPbtreatedgroupdropedto(55.7±7.6)%ofthatincontrolgroup,andreachedtheirlowestpointafter72h(43.7±8.2)%.NosignificantinhibitionofAT1receptormRNAexpressionwasfoundinothergroups(P＞0.05).TheAT1mRNAandproteinlevelsbehavedultimatelysimilarly.Athour24and48,theAT1proteinwas(46.9±4.2)%and(37.0±3.7)%respectivelycomparedtocontrolandamaximumreductionwasobservedafter72hincubation［(28.1±4.0%comparedtocontrols)］.CONCLUSION:Besidessomegeneralrules,webelievethattheloopstructureinthemRNAattheregiontargetedbysiRNAandthebetteraccessibilityofthesiRNAtotargetedmRNAdohaveastrongeffectonsilencing.

【Keywords】RNAi;hypertension;angiotensinⅡreceptor;vector

【摘要】目的：研究哺乳動物細胞中shRNA調節大鼠血管緊張素Ⅱ1型受體基因表達的有效性并探索有效shRNA的特征與shRNA功能性之間的關系.方法：設計并構建四個靶向大鼠AT1受體基因不同區域的shRNA表達載體，轉染大鼠神經膠質瘤C6細胞，并在不同時相收集轉染的細胞，進行RTPCR和Westernblot檢測.結果：轉染24h之后，各處理組均未見AT1mRNA水平有明顯減少.與對照組相比，Pb組在轉染后48h血管緊張素Ⅱ受體mRNA基因水平下降到（55.7±7.6）%，72h后達到最低點（43.7±8.2）%.其它組AT1受體mRNA表達無明顯抑制(P＞0.05).抑制大鼠血管緊張素Ⅱ受體mRNA基因及其蛋白的結果類似.與對照組相比，Pb組血管緊張素Ⅱ受體蛋白在24h和48h分別減少至（46.9±4.2）%和（37.0±3.7）%，最大減少在轉染后72h（28.1±4.0）%.結論：選擇有效的shRNA序列時，除了一般的原則之外，靶位mRNA的環狀結構及siRNA是否能到達靶位對基因干擾實驗能否成功具有重要作用.

【關鍵詞】RNA干擾；高血壓；血管緊張素Ⅱ受體；載體

基因干擾（RNAinterference）可以特異性地靶向降解目的基因mRNA，從而使組織或細胞中的靶基因表達減少或沉默［1］.在本實驗中，我們采用RNAi技術，擬靶向降解大鼠神經膠質瘤C6細胞中的血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）的mRNA，選取并合成了多條編碼大鼠AT1RmRNA的短發夾rna（shRNA）的核苷酸單鏈，退火形成雙鏈結構并將其克隆進入質粒載體，在構建完成四條編碼AT1RshRNA的表達載體之后，轉染C6細胞.根據不同核苷酸序列shRNA質粒在哺乳動物細胞內的功能表達，研究核苷酸序列及堿基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差別，探索篩選有效shRNA的原則.

1材料和方法

1．1材料載體pGenesil1質粒購自武漢市晶賽生物工程技術有限公司，限制性核酸內切酶BamHⅠ，HindⅢ，SalⅠ，PstⅠ購自大連寶生物工程有限公司;T4DNA連接酶及緩沖液購自NewEnglandBiolabs公司;大鼠神經膠質瘤細胞株C6細胞購自中國典型物保藏中心;細胞培養液DMEM購自Hyclone公司;轉染試劑Metafectamine購自德國Biotex公司.所有的DNA合成及引物合成服務均由上海博亞生物技術有限公司提供.

1．2方法

1．2．1靶基因AT1RmRNA的shRNA的構建在GenBank上選取大鼠AT1R的基因序列（序列號NM_030985），利用網上設計軟件siRNATargetFinder，選取siRNA以堿基TT結尾、長度為21個核苷酸的序列，并且GC含量最大不超過60%，剔除含有連續四個或四個以上的A或T堿基的核苷序列，并通過BLAST驗證的靶基因核苷酸序列四條，化學合成編碼shRNA序列的DNA前向和反向序列單鏈如下：靶基因核苷酸序列同時設計一對非特異性序列作為陽性對照.將合成的shRNA序列退火，與線性化的pGenesil1質粒連接，轉化并提陽性克隆，PstⅠ和SalⅠ酶切和測序鑒定證實.以上不同的靶基因序列質粒分別稱為pGenesilA（Pa），pGenesilB（Pb），pGenesilC（Pc）和pGenesilD（Pd）質粒.

1．2．2細胞培養及轉染按2×108/L密度以相同的細胞數接種培養板，過夜至細胞鋪滿50%～60%.用Metafectamine轉染細胞，按1∶6的比例，根據試劑提供商的轉染方案進行轉染.

1．2．3RTPCRAT1基因引物序列為：5′TGTTCCCTTTCCTTATCATTCT3′,5′CTTTGCTTGGTTACT

CCTTCA3′，內參GAPDH的引物序列為：5′TTCAACGGCACAGTCAAGG3′,5′TTAGTGGGGTCT

CGCTCC3′.反應體積25μL包括5μLcDNA，各引物0.25μL，1.5μLMgCl2，0.25μLTaqDNA聚合酶，0.5μLdNTP混合物和5μL10×緩沖液.反應條件:在94℃退火3min之后，94℃15s，55℃15s，72℃15s進行30個循環.畢后，產物上瓊脂糖凝膠電泳.

1．2．4WesternBlot分析轉染pGensilAT1shRNA質粒和對照質粒之后，不同時相收獲C6細胞.PBS液洗滌后，上樣緩沖液溶解細胞.煮沸溶解液10min后，離心，取上清，棄沉淀物.確定蛋白濃度.電泳分離細胞溶解液，轉膜.50g/L脫脂奶封閉后，加入抗AT1抗體（1∶1000）和抗βactin抗體（1∶1500）室溫下孵育1.5h，再加入二抗（抗兔HRP抗體）孵育，增強型化學發光顯色.

統計學處理：根據RTPCR和WesternBlot分析結果，用圖像處理軟件ImageTool3.0測灰度值，并與內參照相比得相對值.用SPSS11.5統計軟件onewayANOVA進行組間方差分析.顯著性水平為P＜0.05.

2結果

2．1不同shRNA表達質粒靶點及二級結構我們選擇大鼠血管緊張素Ⅱ受體基因mRNA序列的部分序列,即556~575bp，469~488bp，595~614bp，663~682bp,做為基因沉默靶位（圖1）.構建了四條堿基序列不同的pGenesilAT1shRNA質粒，預計產生的短發夾RNA如圖2所示.

除在3′端缺乏兩個連續的胸苷之外，AT1shRNA的正義鏈與大鼠AT1基因的mRNA序列的靶位基因序列是相同，反義鏈與靶序列互補.其轉錄產生的RNA，預計可以折疊成短發夾siRNA.所轉錄出的shRNA在理論上應可裂解靶基因mRNA，而經重新洗牌的對照質粒所轉錄出的shRNA則不應對AT1受體基因產生有效的基因沉默效應.

2．2AT1shRNA轉染后AT1mRNA水平和蛋白表達轉染四組陽性質粒24h后，各組AT1mRNA水平無明顯減少.在48h后與對照組相比，轉染Pb質粒組的AT1mRNA表達水平下降到（55.7±7.6）%，72h下降到最低點［僅為對照組的（43.7±8.2）%］.轉染重新洗牌的siRNA大鼠神經膠質瘤C6細胞其AT1受體mRNA表達水平無明顯抑制(P>0.05).結果提示，Pb質粒明顯抑制了AT1受體mRNA基因的表達，其它三組質粒抑制AT1受體mRNA基因作用不顯著（圖3，4）.將抑制AT1受體mRNA有效的Pb質粒進行WesternBlot分析.在24h和48h，AT1蛋白的表達分別為（46.9±4.2）%和（37.0±3.7）%.與對照組相比，表達減少的最大時相在轉染后的72h［僅為對照組的（28.1±4.0）%］.結果表明，Pb質粒轉染的細胞，AT1蛋白水平下降.而轉染重新洗牌的shRNA質粒和對照組則并不能減少AT1基因的表達（圖5）.所有的結果清楚表明，轉染Pb質粒能夠抑制AT1基因的表達.

3討論

腎素血管緊張素系統其主要的效應分子血管緊張素Ⅱ具有調節血壓、水鈉平衡、神經功能等作用.研究證實，血管緊張素Ⅱ參與了動脈硬化、心肌梗塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理過程.血管緊張素Ⅱ通過直接激活AT1R并間接刺激一些生長因子和細胞因子的釋放，誘導心肌細胞,血管細胞肥厚和增生［2］.同時也可刺激AT2，激活與AT1相反的生物學效應而導致血管擴張、緩激肽生成增加、抑制纖維化和血管重塑［3］.本研究構建AT1短發夾RNA表達質粒，試圖用基因沉默技術抑制哺乳動物細胞的AT1mRNA的表達，希望在阻滯AT1受體之后，通過血管緊張素Ⅱ對AT2的作用，達到血管擴張，降低血壓、抑制血管重塑等目的［4］.

實驗結果表明，我們觀測到AT1基因mRNA的表達在早期即有減少，而隨著mRNA水平的抑制，相應的蛋白也有所減少.結果表明，U6啟動子驅動的shRNA序列可有效地和特異地抑制AT1基因在轉染的C6細胞中的表達.因此，通過shRNA的表達，在細胞中抑制與高血壓病理生理相關的AT1基因的表達，有可能成為一種有效的治療方法.

目前尚無選擇siRNA序列的共識性意見或標準［5］.為了優化siRNA誘導的基因沉默效率，許多研究小組對寡核苷酸長度、二級結構及siRNA雙鏈的序列特異性進行了研究.普遍認為［6］，siRNA序列應在靶基因起始密碼子下游100個堿基之后進行選擇，應避開起始密碼子的5′或3′端非編碼區選擇siRNA序列.選擇的正義鏈序列應是AA（N19）TT，其中N代表任何核苷酸，即選擇的siRNA應該有兩個尿嘧啶核苷的3′突出末端.并且所選的siRNA的長度應是21個核苷酸.決定RNA干擾研究成功與否的因素還有很多，包括靶位在mRNA三級結構中的位置、轉染效率以及雙鏈shRNA的特異性等［7-8］.在比較本實驗中設計的四條質粒時我們注意到，其中Pc和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因mRNA二級結構中的核心位置尤其以Pd明顯，這可能是質粒轉染細胞后轉錄產生的短發夾RNA在與RISC(RNA誘導的基因沉默復合物)結合后無法進入靶mRNA裂解部位而導致實驗失敗的原因之一.而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因mRNA二級結構中的表面位置，但質粒Pa也無效，分析可能的原因：①質粒Pa的GC含量偏低可以導致對靶基因mRNA的識別效率的減少;②與RISC雜交效率的下降.除此之外，我們還發現Pb質粒裂解靶基因的局部二級結構比質粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氫鍵相對弱于后者的靶位.在這些影響因素中，我們認為最重要的因素是siRNA能否進入靶位，而靶位中mRNA的結構是否足夠松散，允許siRNA與RISC復合體進行靶向裂解.

總之，在進行短發夾RNA設計時，除了要遵循如靶序列應位于開放閱讀框，而不能選擇非編碼區；GC含量應在50%左右；避開起始密碼子后至少100個堿基；搜索5′AA（N19）序列并進行BLAST等一些普遍的規則［9］之外，我們認為siRNA能否進入靶裂解部位并且靶位的二級結構是否松散是有效shRNA合理設計并取得實驗成功的最重要的因素.

【參考文獻】

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